Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تشريح السمعية بولا بعد الولادة في الفئران: عزل العظام الأذن الوسطى وتحليل النسيجي

Published: January 4, 2017 doi: 10.3791/55054
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Laboratory of Cell and Tissue Biology, Keio University School of Medicine, 2Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Keio University School of Medicine

Abstract

في معظم الثدييات، عظيمات السمع في الأذن الوسطى، بما في ذلك المطرقة، السندان والركابي، هي أصغر العظام. في الفئران، وهو هيكل عظمي يسمى الفقاعة السمعية منازل للعظيمات، في حين أن كبسولة السمعية يرفق الأذن الداخلية، وهي القوقعة والقنوات الهلالية. العظيمات الفئران ضرورية لسماع وبالتالي من مصلحة كبيرة للباحثين في مجال طب الأذن والحنجرة، ولكن من عملية التمثيل الغذائي، والتنمية، وتطور وذات أهمية كبيرة لغيرها من المجالات. تغيير استقلاب العظام يمكن أن تؤثر على وظيفة السمع في فئران بالغة، ومختلف الفئران الجينات نقص تظهر التغيرات في التشكل من عظيمات السمع في الرحم. على الرغم من عظيمات السمع الفئران هي صغيرة، والتلاعب بهم ممكنا إذا كان أحد يفهم ميولهم التشريحية وهيكل 3D. هنا، نحن تصف كيفية تشريح الفقاعة السمعية وكبسولة من الفئران بعد الولادة ثم عزل عظيمات الفردية عن طريق إزالة جزء من الفقاعة. نحن أيضا مناقشة كيفية مالسرير الفقاعة وكبسولة في اتجاهات مختلفة لتوليد البارافين أو أقسام المجمدة مناسبة لإعداد المقاطع الطولية الأفقية أو الجبهي من المطرقة. وأخيرا، فإننا تعداد الاختلافات التشريحية بين الفأر والإنسان عظيمات السمع. أن هذه الأساليب يكون مفيدا في تحليل الجوانب المرضية والتنموية والتطورية للعظيمات السمع والأذن الوسطى في الفئران.

Introduction

وعظيمات السمع الثلاث في الأذن الوسطى، وهي المطرقة، السندان، والركابي، تشكل سلسلة السمعية الثدييات محددة التي تنقل الصوت من الغشاء الطبلي إلى الأذن الداخلية، أو القوقعة 1،2. السمع وظيفة يمكن تقييمها في الفئران عن طريق قياس سمعي جذع الاستجابة (ABR) عتبات 3-6، واهتزاز المطرقة وراء يمكن رصدها باستخدام الليزر دوبلر Vibrometry (LDV) 7 الغشاء الطبلي. من خلال الجمع بين ABR، LDV، والقياسات تشويه المنتج Otoacoustic الانبعاثات (DPOAE)، وفقدان السمع التوصيلي يمكن أن يكون هناك تمييز من ضعف الحسي 8.

هناك حاجة إلى نماذج حيوانية من الظروف الأذن، نظرا لأهمية السمع وصحة الأذن إلى رفاه المرضى من جميع الأعمار. على سبيل المثال التهاب الأذن الوسطى هو التهاب الأذن شائعة جدا ينظر في الرضع والأطفال الإنسان، والحادة، التهاب الأذن الوسطى الحاد ويمكن أن يحدث مضاعفاته إذا كان كونديلم يتم علاجه نشوئها مع مضادات الجراثيم المناسبة 9. قد تكون نماذج الماوس من التهاب الأذن الوسطى مفيدا في فهم المرضية وفي تطوير علاجات 10،11.

العظيمات الفئران، التي تتشكل (باستثناء الجزء goniale من المطرقة) التي تعظم غضروفي 12،13، هي ذات أهمية كبيرة لدراسة استقلاب العظام والتشكل. أولا، صغر حجمها يسمح تحليل عالية الدقة للعظام مع السمحاق سليمة باستخدام الأشعة السينية أو المجهري مضان 14. ثانيا، الشاذة استقلاب العظام، مثل المفرط أو نقص ارتشاف العظام، أو تفاعلات ضعاف بين الخلايا العظمية 15، يمكن تحليلها كمساهم محتمل لفقدان السمع 3،4،7. وذكر الثالث، غير طبيعي التشكل عظيمات في الفئران عدة جينات ناقصة، مثل الحيوانات التي تفتقر إلى Hoxa2 16-19، 20-22 الجينة Msx1، Prrx1 23، Goosecoid(GSC) 24،25، Bapx1 13، Tshz1 26، Dusp6 (Mkp3) 27، رأس (وتد) 28، Fgfr1 29، وهرمون الغدة الدرقية مستقبلات (Thra، Thrb) 5، Bcl2 30 وغيرها 1،31، أو في الفئران overexpressing Hoxa2 32. وأخيرا، على الرغم من صغر حجمها، والهياكل المرتبطة عظيمات مثل العضلات والمفاصل 33 34،35 يمكن الوصول إليها.

العظيمات الماوس هي أصغر من عظيمات الإنسان، ولكن من الجدير بالذكر أن الأذن الوسطى الماوس ليست نسخة مصغرة من نظيرتها الإنسان. على سبيل المثال، في الفئران، الشريان الركابي، الذي يمر من خلال حلقة من الركابي، استمر طوال حياته 36، في حين أنه في البشر، يختفي الشريان الركابي الجنينية أثناء الحمل. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مورفولوجية المطرقة الماوس يختلف من عشرالبريد العظم البشري (أنظر الشكل 6). في الفئران، الفقاعة السمعية (طبلي) يرفق تجويف الأذن الوسطى مليئة بالهواء، في حين أنه في البشر، وخلايا الخشاء الهواء يتكون من العظام التربيقي في العظم الصدغي ويوجد في عظيمات بدلا من الفقاعة 37. في كلا النوعين، وكبسولة السمعية (الكبسولة، التي التيه العظمي) يرفق القوقعة والقنوات الهلالية في الأذن الداخلية. وقد استعرضت علم الأحياء التطوري المقارن والأذن الوسطى على نطاق واسع 38-40.

بروتوكول الواردة أدناه أولا يصف كيفية تشريح خارج الفقاعة السمعية وكبسولة، والتي تتكون أساسا من الأذن الوسطى والأذن الداخلية، على التوالي. يوضح هذا البروتوكول أيضا كيفية عزل المطرقة، السندان والركابي من الفقاعة السمعية. وأخيرا، فإنه يظهر كيفية توجيه الفقاعة السمعية وكبسولة لتضمين استعدادا لباجتزاء الأنسجة من عظيمات السمع.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية التي أجريت في هذه الدراسة من قبل جامعة كايو المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC - عدد موافقة: 09221) واتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية في التجارب على الحيوانات في جامعة كيو لاستخدام الحيوانات في مجال البحوث. تم عزل العينات البشرية من جيفة التبرع بها لقسم التشريح، جامعة كيو كلية الطب، واستخدمت وفقا للوائح المؤسسية.

1. عزل السمعية بولا وكبسولة

  1. الموت ببطء الفئران في وعاء يحتوي على منصة فوق المناشف الورقية غارقة في الأيزوفلورين أو سيفوفلوران حتى تتوقف تهوية الجهاز التنفسي لأكثر من دقائق ثم قم بإجراء خلع عنق الرحم. كن حذرا لتجنب الاتصال المباشر من الفئران مع مناشف ورقية مبللة.
  2. جعل شق عرضي صغير في الجانب الظهري من الرقبة وسحب الجلد بعيدا نحو الرأس والذيل باستخدام كلتا اليدين لفضح الأساسي مو الرقبةالأنسجة scle.
  3. قطع رأس الفئران في منطقة عنق الرحم باستخدام 14 سم مقص جراحي حادة.
  4. قشر الجلد تماما نحو الأنف. قطع جميع الجلد جنبا إلى جنب مع خطم والقواطع.
  5. إدراج مقص في الفم وقطع العضلات الماضغة في كلا الجانبين.
  6. فتح الفك بعناية وإزالة اللسان والفك السفلي معا.
  7. استخدام مقص حاد، الجمجمة تقسيم وقاعدة الجمجمة إلى نصفين على طول الطائرة السهمي النصفي (الشكل 1A، B).
  8. باستخدام ملقط، إزالة نصفي الكرة المخية والمخيخ وجذع الدماغ. وتقع الفقاعة السمعية وكبسولة الأفقي إلى المخيخ وجذع الدماغ. لاحظ أن الفقاعة السمعية هي أبعد الجانبية للكبسولة السمعية (الشكل 1C، D).
  9. تشريح خارج الفقاعة وكبسولة مع المحيط عظم الجمجمة (الشكل 1E).
  10. نقل العينة إلى صحن يحتوي مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 في RT.
  11. Uالتانجو تشريح المجهر مجهر، واستخدام الملقط لسحب بصرف النظر العظام ومقص المحيطة لقطع الحدود خففت حول الفقاعة وكبسولة (الشكل 1F). العظام المحيطة إزالتها هي قاعدي قذالي (الحدود بطني)، خارج القذالي (-ventro الخلفي الحدود)، فوق القذال (الحدود خلفي)، الجداري، الجدارية (الحدود ظهري)، صدفي (ظهراني الأمامي الحدود)، جناحي وتدي (الحدود الأمامي)، والعظم القاعدي الوتدي (الحدود انتيرو بطني) العظام. لاحظ أن عملية إبري الشكل (SP)، الذي يدعم افتتاح الطبلي من النفير 41، يختلف عن عملية الإبري من العظم الصدغي.

2. عزل السمعية عظيمات: المطرقة، السندان وعظمة الركاب

  1. المطرقة
    1. باستخدام كل من مقص صغير وملقط، إزالة جزء من الخارجي الجانبي القناة السمعية إلى الطبلي تلم بحيث الغشاء الطبلي مرئيا (الشكل 2A، B).
    2. إزالة جزء من الغشاء الطبلي والعظم الطبلي بالقرب من malleal الناتئ القصير (نتوء الدويري، انظر مناقشة)، سواء على بطني (منقط) والخلفي (#) الجدران (الشكل 2C). وينبغي الآن يتعرض المطرقة والموترة للطبلة العضلات (الشكل 2D، E).
    3. رفع المطرقة (الشكل 2F) وقطع العضلة الموترة للطبلة مع حافة مشطوف من 27 إبرة G (الشكل 2G). لاحظ أن المقبض malleal تعلق بحزم لغشاء الطبل، كما هو الحال في غيرها من الثدييات.
    4. فصل الغشاء الطبلي بعناية من المقبض، الذي لا يزال هشا. إزالة العظم الطبلي للكشف عن عظيمات السمع الثلاث.
    5. خلخل في المطرقة من سندان في مفصل عظيمي (الشكل 2H).
    6. عزل المطرقة التي كتبها كسر عملية الأمامية في goniale.
  2. سندان وعظمة الركاب
    1. عزل رانه سندان بقطع في الرباط الخلفي للسندان في الساق قصيرة (الشكل 3A).
    2. عزل الركابي بقطع الشريان الركابي قرب الركابي مع حافة مشطوف من 27 إبرة G (الشكل 3B، C). إذا لزم الأمر، وقطع في وتر العضلة ركابي في عملية العضلات من الركابي مع الإبرة.
    3. ادخال ابرة الخياطة (أو دبوس بمناسبة) في الثقبة المسد من الركابي ويرفع الركابي. بعد إزالة الركابي، ينبغي أن يكون فتح نافذة بيضاوية واضحة للعيان (الشكل 3D).

3. تضمين من السمعية بولا وكبسولة

  1. إعداد مبنية كتل البارافين
    1. عزل الفقاعة وكبسولة كما هو موضح في القسم 1.
    2. قطع نهاية الأمامي من الفقاعة (عملية إبري الشكل) قبالة مع مقص، وتزج الفقاعة وكبسولة في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني في 4 درجاتC، والسماح تثبيتي للدخول في الفقاعة. إذا يصبح الهواء المحبوس في الفقاعة، إزالته مع الإبر والمحاقن. ترك الفقاعة وكبسولة في تثبيتي في 4 درجات CO / N على محور دوار أنبوب.
      تحذير: PFA غير سامة، ويجب أن يتم التعامل معها بعناية.
    3. اغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
    4. يزيل الكلس الفقاعة وكبسولة لمدة أسبوع في 4 درجات مئوية 10٪ ethylenediaminetetraacetic حامض الصوديوم الملح ثنائي الهيدرات (EDTA-2NA)، و 100 قاعدة ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.0، في أنبوب مل 2. تغيير المخزن المؤقت كل يوم.
    5. يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. العينات يمكن تخزينها في 70٪ من الإيثانول في الماء عند 4 درجات مئوية. اختياريا، ونقل إلى 70٪ من الإيثانول من خلال سلسلة الكحول متدرج (30٪، 50٪، 70٪ في الماء).
    6. على معالج الأنسجة، ويذوى العينات في سلسلة متدرجة من الحلول الإيثانول (70٪، 2X 95٪، 3X 100٪، كل ح 1)، واضحة في الزيلين (4X، كل ح 1 في 40 درجة مئوية)، والتسلل العينات مع المنصهر شمع البارافين 42. اختياريا، زيلين البديل مع clearin الأنسجة التجاريز حل (مثل HISTO-واضح).
    7. تفريغ عينات من المعالج، وإزالتها من الكاسيتات الخاصة بهم.
    8. على الأنسجة تضمين نظام وحدة التحكم، مكان. نماذج في قوالب مليئة شمع البارافين المنصهر. انتقل إلى تضمينها (القسم 4).
  2. إعداد مبنية بنات المجمدة (طريقة فيلم كاواموتو في) 43
    1. عزل الفقاعة وكبسولة كما هو موضح في القسم 1.
    2. قطع نهاية الأمامي من الفقاعة (عملية إبري الشكل) قبالة مع مقص، وتزج الفقاعة وكبسولة في تثبيتي (2٪ أو 1٪ PFA بدلا من 4٪ في برنامج تلفزيوني للحفاظ على استضداد) في 4 درجات مئوية. إذا تم المحاصرين الهواء في الفقاعة، إزالته باستخدام الإبر والمحاقن. ترك الفقاعة وكبسولة في تثبيتي في 4 درجات CO / N على محور دوار أنبوب.
    3. غسل الفقاعة وكبسولة بسرعة في برنامج تلفزيوني وتزج فورا في السائل مركب تضمين البرد في 4 درجات مئوية.
    4. هام: إزالة فقاعات الهواء وجدت في منتصفوالأذن الخارجي من خلال التطلع بواسطة إبرة، وذلك بإضافة مجمع تضمين بالملقط. انتقل إلى تضمينها (القسم 4).

4. توجيه العينة وتضمينها

يجب أن يكون ترتيب الفقاعة كلها، وكبسولة في اتجاه معين خلال تضمين لخفض أقسام المرجوة: ملاحظة. وتستخدم الإجراءات المبينة أدناه لقسم المطرقة في مختلف التوجهات.

  1. الطولي (مجاور للسهمي) باجتزاء من المطرقة
    1. وضع الجانب الوحشي من الفقاعة أو الصماخ السمعي الخارجي عليها في البارافين الدافئة (أو مركب تضمين البرد). ضبط اتجاه بحيث الرقبة ومستعرضة الصفيحة من المطرقة موازية لأسفل الأفقي للطبق التضمين (الشكل 4A - C). لاحظ أن الغشاء الطبلي يميل بزاوية مقدارها حوالي 30 درجة إلى رأسي في الرأس الماوس (الشكل 4A، الشكل 59 في كامبن
  2. باجتزاء الأفقي للالمطرقة
    1. ضع قمة ظهري أفقيا في البارافين الدافئة (أو مركب تضمين البرد). ضبط اتجاه الفقاعة وكبسولة بحيث الرقبة ومستعرضة الصفيحة من المطرقة هي عمودي إلى أسفل الطبق التضمين (الشكل 4D - F).
  3. باجتزاء الأمامي (المقاطع العرضية) من قبضة القص والطبلي غشاء 5
    1. وضع المقبض malleal في البارافين الدافئة (أو مركب تضمين البرد) بحيث يكون عموديا إلى أسفل الطبق تضمين.
  4. تهدئة كتلة لدرجات الحرارة المناسبة لتصلب شمع البارافين على الأنسجة تضمين نظام وحدة (بدلا من ذلك، استخدم مركب تضمين البرد في الجليد حمام جاف / الهكسان).
  5. كتلة الأنسجة عملية وقطع المقاطع باستخدام الإجراءات الروتينية. على سبيل المثال، أقسام صمة عار البارافين مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H & #38؛ E)، سفرانين O (لغضروف)، أو مقاومة للطرطرات حمض الفوسفاتيز (TRAP) النشاط (لالآكلة) 3، أو عن طريق المناعية. cryosections Undecalcified هي مناسبة لوصفها العظام باستخدام fluorochromes 14، الأليزارين تلطيخ الأحمر للكالسيوم، والمناعي +42.

Representative Results

ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لعزل عظيمات من الفقاعة الماوس السمعية. أولا، يتم تشريح الفقاعة وكبسولة من كقطعة واحدة من الجمجمة (الشكل 1). ثم يتم استخدام الفقاعة تشريح لإعداد المطرقة (الشكل 2) وسندان والركابي (الشكل 3). معالم الفقاعة السمعية وكبسولة هي عملية إبري الشكل في نهاية الأمامي من الفقاعة، وقمة ظهري، قناة الهلالية الأمامية، والحفرة قرب المقوس (الشكل 1F). Microcomputed التصوير المقطعي (CT) والتصوير يكشف عظيمات في الفقاعة السمعية فضلا عن التوجهات الأمثل لباجتزاء الطولي والأفقي تلك العظيمات (الشكل 4).

لباجتزاء البارافين الطولي للالمطرقة، وdecalcified الفقاعة وكبسولة في EDTA عند 4 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد، جزءا لا يتجزأ من السلطة الفلسطينيةكتلة RAFFIN في التوجه هو مبين في الشكل (4) A - C، مقطوع في 4 ميكرون، ثم ملطخة باستخدام H & E. والمطرقة تعلق على الغشاء الطبلي في الفقاعة السمعية وكشفت التحجر غضروفي المستمر في P14 (الشكل 5A). لتصور تشكيل العظام الجديدة، calcein (30 ميكروغرام / غرام من وزن الجسم) تم حقن peritoneally إلى الماوس P20، وعزلت الفقاعة وكبسولة بعد 24 ساعة عند P21. وكان جزءا لا يتجزأ من العينة دون زوال الكلس المجمدة ثم cryosectioned في 6 ميكرون باستخدام الفيلم لاصقة على أساس طريقة كاواموتو 43. بعد تلطيخ النووي مع دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindole)، وقد لوحظ قسم تحت المجهر مضان. إشارات Calcein (الأخضر) كشفت تكوين عظام جديدة في المطرقة (م)، الفقاعة وكبسولة (الشكل 5B). لباجتزاء الأفقي للالمطرقة، وجزءا لا يتجزأ من الفقاعة السمعية معزولة عن ماوس البالغ من العمر 5 أسابيع المجمدة دون زوال الكلس (لالتوجه انظر الشكل 4D - F)، cryosectioned في 6 ميكرون باستخدام طريقة كاواموتو، وملطخة باستخدام H & E. يظهر باجتزاء الأفقي للخنصر malleal الناتئ (ام. بي) أيضا القوقعة (الشكل 5C).

وجهة نظر وسطي من عظيمات السمع الصحيحة معزولة عن ماوس P31 يظهر المظاهر التقليدية للالمطرقة الماوس، وهما "مزلق-النورس يشبه الجناح" (أو الفارسي 45 مثل السيف) المقبض، وهو الناتئ القصير بارز (نتوء الدويري انظر مناقشة)، والصفيحة مستعرضة (الشكل 6). لاحظ أن عملية الأمامي (الناتئ الأمامي) وقد اصيب بكسر في إجراء تشريح حول goniale وفصلت من الحلقة طبلي (ectotympanic). يسلك هذه عينة تمثيلية المفصل السنداني المطرقي سليمة بين المطرقة والسندان، في حين خلع المفصل السنداني الركابي. الإدراج الوترية في malleal والعمليات العضلات ركابي هي اكتشاف (الشكل 6A، العلامات النجمية).

الشكل 6B يقارن الماوس وعظيمات السمع الإنسان في نفس التكبير. الاختلافات بين الأنواع، وغيرها من حجم، وتشمل ما يلي. المقبض malleal هي الجناح تشبه في الفئران ولكن مثل النادي في البشر. الزاوية بين محور التشريحية (أو محور الدوران، والخط من خلال عملية الأمامية من المطرقة وعملية قصيرة من سندان) والمقبض هو أصغر بكثير في الفئران وهما مواز تقريبا، في مقابل ما يقرب من عمودي في البشر 6،46-48. في عظيمات الإنسان، دراسات vibrometric تكشف أن المشترك-incudo الكعبية هو المحمول بدلا من الثابت وظيفيا 49. والمطرقة الماوس المعارض واسعة، ورقيقة، ومسطحة مستعرضة الصفيحة يست واضحة في البشر 47. في الفئران، الأمامي الناتئ الصمامات العظام غشائي، وهي goniale وطبلة الأذنج عصابة، بينما في البشر يتم تقليل الأمامي الناتئ إلى الشوكة صغيرة من العظام 41. والركابي من الفئران والبشر يختلف أيضا: في الفئران والساق الأمامية منحني والساق الخلفية هو أكثر مباشرة في حين أنه في البشر، والساق الأمامي هو أكثر مباشرة من الساق الخلفية. ومن الجدير بالذكر أن رئيس المطرقة بالنسبة لحجم الجسم وتوسيع نطاق واسع في أنواع مثل الخلد الذهبي، مما يدل على التباين الكبير في العلاقات المغايرة النسبية من "أصغر" عظام 48.

شكل 1
الشكل 1. تشريح السمعية بولا وكبسولة. (أ) جمجمة الفأر P31 ينقسم إلى اليمين واليسار نصفين. A، الأمامي. P، الخلفي. L، غادر. R، أليس كذلك. (ب) سطح الإنسي من النصف الأيمن من رئيس البشرة شطر. CX، القشرة الدماغية. البنك التجاري، المخيخ. إفطار، المخnstem. D، الظهرية. V، بطني. (ج) إزالة الدماغ مع ملقط. (D) عرض الإنسي من الكبسولة السمعية في الجمجمة الصحيحة. قمة الظهرية (السهام) تقع بين الحفرة المتوسطة الجمجمة (ألف قدم مكعب) والخلفي الحفرة القحفية (الحزب الشيوعي الفرنسي) وتفصل ظهراني الأمامية والأسطح ventro الخلفي من الكبسولة السمعية. شريط الحجم، 2 مم. (E) التكبير العالي للالفقاعة السمعية وكبسولة (عرض وسطي). شارك، القوقعة. سابعا، العصب الوجهي. ثامنا، الدهليزي القوقعي العصبية. AC، الأمامي (متفوق) القناة الهلالية. SF، الحفرة تحت المقوسية، الذي يضم النديفة المخيخ. شريط الحجم، 1 مم. (F) صورة مجهرية من الفقاعة السمعية معزولة وكبسولة (عرض وسطي). يرة سورية، وعملية إبري الشكل. شريط الحجم، 1 مم. (A - E)، P31 الماوس. (F)، P33 الماوس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تشريح المطرقة. (أ) عرض بطناني من الفقاعة السمعية المناسبة وكبسولة. والطبلي تلم (ST، السهم متقطع) هو موقع الحجز على الغشاء الطبلي. الوحشي العظام إلى ST هو جزء من الأذن الخارجية، والإنسي العظام إلى ST يشكل أرضية تجويف الأذن الوسطى. A، الأمامي. P، الخلفي. D، الظهرية. V، بطني. (ب) عرض بعد إزالة القناة السمعية الخارجية للكشف عن غشاء الطبل (TM) بما فيها الجزء الرخو (الجبهة الوطنية) والجزء الموتر (حزب العمال). (ج) إزالة أجزاء من العظم الطبلي (الخطوط المنقطة و#) بالقرب من malleal الناتئ القصير (ام. بي). م، المطرقة، ملي، المقبض malleal. السهم، فقاعة الهواء في تجويف الأذن الوسطى ينظر من خلال الغشاء الطبلي. (D) المطرقة مكشوف. وأشار رئيس المطرقة. منقطخط يشير إلى السطح المفصلي للسندان. (E) وتر العضلة الموترة للطبلة (تي تي) تعلق على المطرقة. يتم سحبها (F) وموترة الطبلة عندما يتم رفع المطرقة. * عملية العضلات. يتم قطع (G) الموترة للطبلة باستخدام إبرة. (H) ثلاثة عظيمات السمع بعد إزالة الغشاء الطبلي. هو خلع مفصل-incudo الكعبية. م، المطرقة، أنا، سندان، الصورة، الركابي، الذهاب، goniale (تنصهر في المطرقة وطبلي حلقة، TR). جميع الحانات الحجم، 0.5 مم. (A، H)، P33 الماوس. (B - G)، P31 الماوس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تشريح سندان وعظمة الركاب. (A) سندان والركابي بعد إزالة المطرقة. الشريان الركابي (SA) يمر عبر الركابي (ق). خط منقط يشير إلى السطح المفصلي للسندان. لاحظ أن الساق قصيرة (ICB، الساق القصيرة) لسندان (ط) هو ثابت من الرباط الخلفي (لا يظهر). النجمة، عملية العضلات من الركابي. (ب) الركابي بعد إزالة سندان. يستخدم طرف إبرة لقطع الشريان الركابي (SA). السهم، واتجاه تدفق الدم. خط منقط يشير سطح مفصلي للالركابي. إزالة (C) الشريان الركابي من الركابي. X يشير إلى نهاية قطع الشريان الركابي (SA). (D) نافذة بيضاوية (آه، النافذة البيضوية أو الدهليز fenestra) مرئيا بعد إزالة الركابي. RW، نافذة مستديرة (مستديرة fenestra أو قوقعة fenestra). أشرطة النطاق، 0.5 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذاالشكل.

الشكل (4)
الشكل 4. توجيه السمعية بولا وكبسولة خلال تضمينها لالطولي (مجاور للسهمي، A - C) وأفقي (D - E) باجتزاء من المطرقة. (A - C) والرقبة ومستعرضة الصفيحة من المطرقة وضعت بالتوازي مع الجزء السفلي من تضمين الطبق. (أ) الجانب الشخصي: الصغرى CT الصورة لتظهر التضمين من المطرقة الحق في الفقاعة (pseudocolored الأزرق). وpseudocolored والمطرقة والسندان الأخضر. خط متقطع، المطلوب الطائرة القطع. خط الصلبة، أسفل تضمين الطبق. م، المطرقة، النصال، الظهرية قمة. M، سطي. L، الأفقي، D، الظهرية. V، بطني. (ب) أعلى عرض: مايكرو-CT الصورة. لاحظ أن نهاية الأمامي من (عملية إبري الشكل) الفقاعة تمت إزالة. ط، سندان. (C) أعلى عرض: صورة مجهرية (التي اتخذت معمرشح اللون). AC، الأمامي (متفوق) القناة الهلالية. سادس، الحفرة تحت المقوسية. يرة سورية، وعملية إبري الشكل. A، الأمامي. P، الخلفي. D، الظهرية. V، بطني. (D - F) وخنصر اليد الناتئ من المطرقة يتم وضع عمودي على الجزء السفلي من تضمين الطبق. (D) منظر جانبي: مايكرو-CT الصورة لتظهر التضمين من المطرقة الصحيحة. خط متقطع، المطلوب الطائرة القطع. خط الصلبة، أسفل تضمين الطبق. (E) أعلى عرض: مايكرو-CT الصورة. ملي، المقبض malleal. (F) أعلى عرض: صورة مجهرية (التي اتخذت مع مرشح اللون). الحانات الحجم، 1 مم. تم الحصول عليها صور مايكرو-CT في قرار فوكسل من 5 ميكرون، كما هو موضح سابقا 7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
Figure 5. علم الأنسجة. (أ) H & E تلطيخ. المقطع الطولي (مجاور للسهمي) من المطرقة جزءا لا يتجزأ من البارافين الصحيحة (م) في الفقاعة السمعية (الخط المنقط) في P14. TM، الغشاء الطبلي. (ب) Calcein العظام وصفها. المقطع الطولي للالمجمدة، المطرقة اليسرى undecalcified (م) في الفقاعة السمعية في P21. مباين، دابي. (C) H & E تلطيخ. القسم الأفقي للخنصر اليد المجمدة، undecalcified ترك malleal الناتئ (ام. بي) في الفقاعة السمعية وكبسولة (الماوس البالغ من العمر 5 أسابيع). شارك، القوقعة. الحانات الحجم، 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. الإنسي منظر السمعية العظيمات. (A) عظيمات السمع رايت P31 الماوس. A، الأمامي. P، الخلفي. D، الظهرية. V، بطني. شريط الحجم، 1 مم. المطرقة الرأس (كابوت للمطرقة، رؤيس المطرقة)؛ العنق (عنق المطرقة)؛ الصفيحة (الصفيحة مستعرضة)؛ ملي (المقبض المطرقة)؛ النجمة السوداء (عملية العضلات من المطرقة)؛ MPA (الناتئ الأمامي، الناتئ الناحلة)؛ MPB (الناتئ القصير)؛ هيئة سندان (كوربوس سندان)؛ ICB (الساق القصيرة، الساق قصيرة، عملية قصيرة)؛ ICL (الساق الطويلة، الساق الطويل، عملية طويلة)؛ IPL (الناتئ العدسي، عملية عدسي، سيلفيان نتوء)؛ رئيس الركابي (رأس الركاب)؛ النجمة البيضاء (عملية العضلات من الركابي)؛ هيئة السلع التموينية (الساق الأمامية، الساق الأمامية)؛ اللجنة الدائمة (الساق الخلفي، الخلفي الساق)؛ قاعدة (للركاب الأساس، الصفيحة القدمية)؛ قوات العمليات الخاصة (الثقبة المسد، الثقبة بين السويقات). (ب) عظيمات السمع حق أنثى الإنسان البالغ من العمر 76 عاما (بالإذن من قسم التشريح، كيو كلية الطب بجامعة). وعظيمات من الماوس P31 (أسفل اليمين) يتم تصوير في نفس التكبير الذي استعمل لعظيمات الإنسان. المنحنياتوتشير السهام إد الزاوية بين محور التشريحية والمقبض (الخطوط المنقطة). شريط الحجم، 2 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هنا، فإننا نقدم وسيلة مفيدة لعزل الفقاعة السمعية وكبسولة في الفئران بعد الولادة. قبل P12، أنسجة هشة ويمكن أن تصبح التالفة أثناء العزلة. بعد P12، الفقاعة السمعية وكبسولة يمكن عزلها عن الأنسجة المحيطة بها. تشريح الفقاعة من الرأس قبل باجتزاء ديها العديد من المزايا. أولا، التجويف ما بعد الولادة ونمو الفقاعة السمعية تحدث معظم بنشاط من P6 فصاعدا وهي كاملة من قبل P14 50. يتم استبدال الأنسجة الوسيطة بين الغشاء الطبلي وجدار القوقعة عن طريق الجو من خلال عملية التجويف. الهواء الناجم عن ذلك في تجويف الأذن الوسطى يمكن أن تعوق الاتصال بين الأنسجة والسوائل أثناء التثبيت، وزوال الكلس والتضمين. فمن الأسهل لإزالة الهواء من الفقاعة السمعية معزولة بقطع النهاية (عملية إبري الشكل) الأمامية بدلا من محاولة القيام بذلك في الفقاعة unisolated. ثانيا، توجه المطرقة (والغشاء الطبلي) ليس الرأسيفي الرأس. ولذلك فمن الأسهل إلى قسم المطرقة في الطائرات المطلوب عن طريق دمج الفقاعة السمعية معزولة وكبسولة في اتجاه معين.

مرة واحدة معزولة، الفقاعة السمعية وكبسولات مفيدة للعديد من التحليلات. على سبيل المثال، يمكن أن ارتفاع قرار الأشعة السينية الصغرى CT كشف العظام المجهرية التشكل مثل الشعيرات الدموية المكونة للعظم في المطرقة 14. وstereofluorescence تشريح المجهر هو أداة قوية لتصور الهياكل في تقييم الفئران مراسل معربا عن البروتينات الفلورية في الوسط أو الداخلية الأذن 33. بالإضافة إلى ذلك، مختلف في الجسم الحي أو خارج الجسم الحي مضان طرق وضع العلامات وكله جبل كشف المناعي يمكن الاضطلاع بها. ضوء ورقة مضان المجهر مفيد أيضا لتحليل ثلاثي الأبعاد-51. وإن لم يكن هو موضح هنا، والهياكل التشريحية المختلفة المرتبطة الفقاعة السمعية وكبسولة مثل الأعصاب الطرفية، والأوعية الدموية، والغشاء الطبلي في الأذن الوسطى كما يمكن تقييمها باستخدام هذا البروتوكول.

لاحظ أن باجتزاء البارافين يتطلب زوال الكلس للأنسجة العظام قبل التضمين، وبالتالي لا يسمح تحليل تمعدن. على النقيض من ذلك، فإن طريقة فيلم كاواموتو 43 المستخدمة في إعداد أقسام المجمدة يمكن أن يؤديها من دون زوال الكلس ومناسبة للدراسات تمعدن استخدام في تقنيات العظام وضع العلامات الجسم الحي أو تلطيخ خاص مثل الصبغ الأحمر تلطيخ. ينبغي أن يكون الأمثل ظروف البرد باجتزاء .. وفقا القائم على أساس السن الماوس. على سبيل المثال، ينصح درجة حرارة أقل باردة داخل الغرفة ناظم البرد لعينات الماوس القديمة للحد من الأضرار التي لحقت أقسام.

وفي الماوس، المصطلح الصحيح للنتوء بارز شبه كروية من المطرقة هو "نتوء الدويري". ومع ذلك، فإن مصطلح "خنصر الناتئ" وقد استخدم على نطاق واسع للإشارة إلى نتوء الدويري لمزيد من اللعقدين من الزمن، وخاصة بين الماوس علماء البيولوجيا التطورية 16،20،22-25. "الناتئ القصير" يشير أصلا إلى عملية الجانبية (الناتئ الوحشية)، والذي يختلف من نتوء الدويري. في البشر، وهي عملية تشبه الجانبية إسقاط مخروطي طفيف تشكل الخط العام للمرفق إلى غشاء الطبل، وتمتد من قبضة القص (لم أر في الشكل 6B، عرض وسطي). في الفئران، وعملية الجانبية هي أيضا إسقاط المقبض في الطرف المقابل لبجرة 48. في الجزء الرخو من الغشاء الطبلي فوق عملية الجانبية للالمطرقة. نتوء دائري ليست واضحة في المطرقة الإنسان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tools/Equipment
Paper towel Daio Paper Corporation 703347 can be purchased from other vendors
Glass Jar Various can be purchased from other vendors
14 cm surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 91400-14 can be purchased from other vendors
Extra fine scissors-straight Fine Science Tools (F.S.T.) 14084-08 can be purchased from other vendors
Fine Forceps Angled 45° Fine Science Tools (F.S.T.) 11063-07 can be purchased from other vendors
Dissecting microscope Nikon SMZ800N for routine dissection
Dissecting microscope Nikon SMZ18 for movies 
Injection needle 27 G TERUMO NN-2719S
Syringe (1 mL) TERUMO SS-01T
Marking Pin Various
Tube rotator RT-50 TAITEC 0000165-000 can be purchased from other vendors
Cryostat Leica CM3050S http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/
TC-65 Tungsten blade Leica 14021626379 for Kawamoto's firm method
Stainless containers Leica for Kawamoto's firm method
Cryofilm type IIC Leica for Kawamoto's firm method
Silane coated slide (New Silane II) Muto Pure Chemicals 511617 can be purchased from other vendors
Cover glass Matsunami can be purchased from other vendors
Tissue processor Sakura Finetek VIP-5 can be purchased from other vendors
Tissue Embedding Console System Sakura Finetek Tissue-Tek TEC 5  can be purchased from other vendors
Sliding microtome for paraffin Yamato Kohki Industrial REM-710 can be purchased from other vendors
Path Blade+pro for hard tissue Matsunami PB3503C for paraffin section
Micro-CT RIGAKU R_mCT2 http://www.rigaku.com/en
Fluorescence microscope KEYENCE BZ-9000
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Isoflurane Maruishi pharmaceutical Co. Ltd
NaCl wako 191-01665 for PBS
KCl wako 285-14 for PBS
Na2HPO4 12H2O wako 196-02835 for PBS
KH2PO4 wako 287-21 for PBS
Paraformaldehyde (PFA, EM Grade) TAAB P001
EDTA-2Na wako 15111-45
Trizma base Sigma T1503-1KG
Super Cryoembedding Medium Leica for Kawamoto's firm method
Dry Ice Various for Kawamoto's firm method
Hexane wako 080-03423 for Kawamoto's firm method
Super Cryomouting Medium type R2 Leica for Kawamoto's firm method
Paraffin Sakura Finetek 781001A0107
Histo-Clear NDS HS-200
Calcein DOJINDO 340-00433
Hematoxylin  wako 131-09665
Eosin wako 051-06515

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mallo, M. Formation of the middle ear: recent progress on the developmental and molecular mechanisms. Dev Biol. 231, 410-419 (2001).
  2. Manley, G. A. An evolutionary perspective on middle ears. Hear Res. 263, 3-8 (2010).
  3. Kanzaki, S., Ito, M., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Resorption of auditory ossicles and hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. Bone. 39, 414-419 (2006).
  4. Kanzaki, S., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Bisphosphonate therapy ameliorates hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. J Bone Miner Res. 24, 43-49 (2009).
  5. Cordas, E. A., et al. Thyroid hormone receptors control developmental maturation of the middle ear and the size of the ossicular bones. Endocrinology. 153, 1548-1560 (2012).
  6. Dong, W., Varavva, P., Olson, E. S. Sound transmission along the ossicular chain in common wild-type laboratory mice. Hear Res. 301, 27-34 (2013).
  7. Kanzaki, S., et al. Impaired vibration of auditory ossicles in osteopetrotic mice. Am J Pathol. 178, 1270-1278 (2011).
  8. Qin, Z., Wood, M., Rosowski, J. J. Measurement of conductive hearing loss in mice. Hear Res. , (2009).
  9. Klein, J. O. Is acute otitis media a treatable disease? N Engl J Med. 364, 168-169 (2011).
  10. Rosch, J. W., et al. A live-attenuated pneumococcal vaccine elicits CD4+ T-cell dependent class switching and provides serotype independent protection against acute otitis media. EMBO Mol Med. 6, 141-154 (2014).
  11. Li, X., et al. Otitis media in sperm-associated antigen 6 (Spag6)-deficient mice. PLoS One. 9, e112879 (2014).
  12. Rodríguez Vázquez, J. F., Mérida Velasco, J. R., Jiménez Collado, J. A study of the os goniale in man. Acta Anat (Basel). 142, 188-192 (1991).
  13. Tucker, A. S., Watson, R. P., Lettice, L. A., Yamada, G., Hill, R. E. Bapx1 regulates patterning in the middle ear: altered regulatory role in the transition from the proximal jaw during vertebrate evolution. Development. 131, 1235-1245 (2004).
  14. Matsuo, K., et al. Osteogenic capillaries orchestrate growth plate-independent ossification of the malleus. Development. 142, 3912-3920 (2015).
  15. Matsuo, K. Cross-talk among bone cells. Curr Opin Nephrol Hypertens. 18, 292-297 (2009).
  16. Rijli, F. M., et al. A homeotic transformation is generated in the rostral branchial region of the head by disruption of Hoxa-2, which acts as a selector gene. Cell. 75, 1333-1349 (1993).
  17. Mallo, M., Gridley, T. Development of the mammalian ear: coordinate regulation of formation of the tympanic ring and the external acoustic meatus. Development. 122, 173-179 (1996).
  18. O'Gorman, S. Second branchial arch lineages of the middle ear of wild-type and Hoxa2 mutant mice. Dev Dyn. 234, 124-131 (2005).
  19. Santagati, F., Minoux, M., Ren, S. Y., Rijli, F. M. Temporal requirement of Hoxa2 in cranial neural crest skeletal morphogenesis. Development. 132, 4927-4936 (2005).
  20. Satokata, I., Maas, R. Msx1 deficient mice exhibit cleft palate and abnormalities of craniofacial and tooth development. Nat Genet. 6, 348-356 (1994).
  21. Zhang, Z., et al. Malleal processus brevis is dispensable for normal hearing in mice. Dev Dyn. 227, 69-77 (2003).
  22. Houzelstein, D., Cohen, A., Buckingham, M. E., Robert, B. Insertional mutation of the mouse Msx1 homeobox gene by an nlacZ reporter gene. Mech Dev. 65, 123-133 (1997).
  23. Martin, J. F., Bradley, A., Olson, E. N. The paired-like homeo box gene MHox is required for early events of skeletogenesis in multiple lineages. Genes Dev. 9, 1237-1249 (1995).
  24. Yamada, G., et al. Targeted mutation of the murine goosecoid gene results in craniofacial defects and neonatal death. Development. 121, 3005-3012 (1995).
  25. Rivera-Pérez, J. A., Mallo, M., Gendron-Maguire, M., Gridley, T., Behringer, R. R. Goosecoid is not an essential component of the mouse gastrula organizer but is required for craniofacial and rib development. Development. 121, 3005-3012 (1995).
  26. Coré, N., et al. Tshz1 is required for axial skeleton, soft palate and middle ear development in mice. Dev Biol. 308, 407-420 (2007).
  27. Li, C., Scott, D. A., Hatch, E., Tian, X., Mansour, S. L. Dusp6 (Mkp3) is a negative feedback regulator of FGF-stimulated ERK signaling during mouse development. Development. 134, 167-176 (2007).
  28. Hwang, C. H., Wu, D. K. Noggin heterozygous mice: an animal model for congenital conductive hearing loss in humans. Hum Mol Genet. 17, 844-853 (2008).
  29. Calvert, J. A., et al. A missense mutation in Fgfr1 causes ear and skull defects in hush puppy mice. Mamm Genome. 22, 290-305 (2011).
  30. Carpinelli, M. R., et al. Anti-apoptotic gene Bcl2 is required for stapes development and hearing. Cell death dis. 3, e362 (2012).
  31. Chapman, S. C. Can you hear me now? Understanding vertebrate middle ear development. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1675-1692 (2011).
  32. Kitazawa, T., et al. Distinct effects of Hoxa2 overexpression in cranial neural crest populations reveal that the mammalian hyomandibular-ceratohyal boundary maps within the styloid process. Dev Biol. 402, 162-174 (2015).
  33. Wang, L., et al. Scleraxis is required for differentiation of the stapedius and tensor tympani tendons of the middle ear. J Assoc Res Otolaryngol. 12, 407-421 (2011).
  34. Amin, S., Tucker, A. S. Joint formation in the middle ear: lessons from the mouse and guinea pig. Dev Dyn. 235, 1326-1333 (2006).
  35. Amin, S., Matalova, E., Simpson, C., Yoshida, H., Tucker, A. S. Incudomalleal joint formation: the roles of apoptosis, migration and downregulation. BMC Dev Biol. 7, 134 (2007).
  36. Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of anatomy. 201, 15-29 (2002).
  37. Treuting, P. M., Dintzis, S. M. Ch. 22, Special senses: ear. Comparative Anatomy and Histology: A Mouse and Human Atlas. Treuting, P. M., Dintzis, S. M. 22, Academic Press. 419-432 (2012).
  38. Mallo, M., Schrewe, H., Martin, J. F., Olson, E. N., Ohnemus, S. Assembling a functional tympanic membrane: signals from the external acoustic meatus coordinate development of the malleal manubrium. Development. 127, 4127-4136 (2000).
  39. Anthwal, N., Joshi, L., Tucker, A. S. Evolution of the mammalian middle ear and jaw: adaptations and novel structures. Journal of anatomy. 222, 147-160 (2013).
  40. Takechi, M., Kuratani, S. History of studies on mammalian middle ear evolution: a comparative morphological and developmental biology perspective. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 314, 417-433 (2010).
  41. Henson, O. W. Jr Ch. 3, Comparative Anatomy of the Middle Ear. Handbook of Sensory Physiology. Keidel, W. D., Neff, W. D. Vol. 1, Auditory System. Anatomy, Physiology (Ear), Springer. Berlin Heidelberg. 39-110 (1974).
  42. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. , Humana Press. (2003).
  43. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
  44. Kampen, P. N. V. Gegenbaurs Morphologiesches Jahrbuch. 34, W. Engelmann. 321-722 (1905).
  45. Lee, J. H., Park, K., Kang, T. C., Choung, Y. H. Three-dimensional anatomy of the temporal bone in normal mice. Anat Histol Embryol. 38, 311-315 (2009).
  46. Fleischer, G. Evolutionary principles of the mammalian middle ear. Adv Anat Embryol Cell Biol. 55, 3-70 (1978).
  47. Lavender, D., Taraskin, S. N., Mason, M. J. Mass distribution and rotational inertia of "microtype" and "freely mobile" middle ear ossicles in rodents. Hear Res. 282, 97-107 (2011).
  48. Mason, M. J. Of mice, moles and guinea pigs: functional morphology of the middle ear in living mammals. Hear Res. 301, 4-18 (2013).
  49. Willi, U. B., Ferrazzini, M. A., Huber, A. M. The incudo-malleolar joint and sound transmission losses. Hear Res. 174, 32-44 (2002).
  50. Richter, C. A., et al. Defects in middle ear cavitation cause conductive hearing loss in the Tcof1 mutant mouse. Hum Mol Genet. 19, 1551-1560 (2010).
  51. Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61, 382-395 (2013).

Tags

علم التشريح، العدد 119، عظيمات السمع والأذن الوسطى والأذن الداخلية، المطرقة، السندان، الركابي، الفقاعة الطبلية، الغشاء الطبلي، الموترة للطبلة، الكبسولة، التي القوقعة، الشريان الركابي
تشريح السمعية بولا بعد الولادة في الفئران: عزل العظام الأذن الوسطى وتحليل النسيجي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sakamoto, A., Kuroda, Y., Kanzaki,… More

Sakamoto, A., Kuroda, Y., Kanzaki, S., Matsuo, K. Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis. J. Vis. Exp. (119), e55054, doi:10.3791/55054 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter