Abstract
I de fleste pattedyr, auditive ossicles i mellemøret, herunder malleus, incus og stapes, er de mindste knogler. Hos mus, en knoglestrukturen kaldet auditive bulla huser ossicles, mens det auditive kapsel omslutter det indre øre, nemlig cochlea og halvrunde kanaler. Murine ossicles er afgørende for at høre, og dermed af stor interesse for forskere inden for området otolaryngology, men deres stofskifte, udvikling og evolution er yderst relevante for andre områder. Altered knoglemetabolisme kan påvirke hørelse funktion i voksne mus, og forskellige gen-mangel mus viser ændringer i morfogenese af auditive ossicles i livmoderen. Selvom murine auditive ossicles er lille, deres manipulation er mulig, hvis man forstår deres anatomiske orientering og 3D struktur. Her beskriver vi, hvordan at dissekere den auditive bulla og kapsel postnatal mus og derefter isolere individuelle ossicles ved at fjerne en del af bulla. Vi diskuterer også, hvordan man emseng bulla og kapslen i forskellige orienteringer til generering paraffin eller frosne snit egnede til fremstilling af langsgående, vandrette eller frontale sektioner af malleus. Endelig optælle vi anatomiske forskelle mellem mus og mennesker auditive ossicles. Disse metoder ville være nyttig til at analysere patologiske, udviklingsmæssige og evolutionære aspekter af auditive ossicles og mellemøret hos mus.
Introduction
De tre auditive ossicles i mellemøret, nemlig malleus, ambolt og stapes, danner en mammal-specifik auditiv kæde, der sender lyd fra trommehinden til det indre øre, eller cochlea 1,2. Hørefunktion kan vurderes i mus ved at måle Auditory Brainstem Response (ABR) grænseværdier 3-6, og vibration af malleus bag trommehinden kan overvåges ved hjælp Laser Doppler Vibrometry (LDV) 7. Ved at kombinere ABR, LDV, og Distortion otoakustiske Emission (DPOAE) målinger, kan ledende høretab skelnes fra sensorineuralt nedskrivninger 8.
Der er behov for Dyremodeller for øre betingelser, idet det er vigtigt at høre og øre sundhed til trivsel af patienter i alle aldre. For eksempel otitis media er en meget almindelig øreinfektion set i humane spædbørn og børn, og alvorlige, akut otitis media og dens komplikationer kan opstå, hvis betintion ikke behandles med passende antibiotika 9. Musemodeller for otitis media kunne være nyttige til forståelse af patogenesen og til udvikling af behandlinger 10,11.
Murine ossicles, som (med undtagelse af den goniale del af malleus) er dannet af endochondral ossifikation 12,13, er særdeles relevante for studiet af knoglemetabolisme og morfogenese. Først deres lille størrelse giver mulighed for høj opløsning analyse af knogler med en intakt periost ved hjælp af X-ray eller fluorescensmikroskopi 14. For det andet, afvigende knoglemetabolisme, såsom overdreven eller mangelfuld knogleresorption eller forringet interaktioner blandt knogleceller 15, kan analyseres som en potentiel bidragyder til høretab 3,4,7. Tredje, unormal ossicle morfogenese er rapporteret i adskillige gen-deficiente mus, såsom dyr, der mangler Hoxa2 16-19, Msx1 20-22, Prrx1 23, Goosecoid(GSC) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, FGFR1 29, thyroideahormonreceptorer (thrA, Thrb) 5, Bcl2 30 og andre 1,31, eller hos mus overekspression Hoxa2 32. Endelig trods deres lille størrelse, strukturer forbundet med ossicles såsom muskler 33 og led 34,35 er tilgængelige.
Mus øreknoglerne er mindre end humane ossicles, men det er bemærkelsesværdigt, at mus mellemøret er ikke en miniatureudgave af dets menneskelige modstykke. For eksempel i mus, den stapedial arterie, der passerer gennem ringen af stapes, fortsætter gennem hele livet 36, hvorimod i mennesker, forsvinder det embryoniske stapedial arterie under svangerskabet. Desuden morfologien af musen malleus afviger fra the human knogle (se figur 6). Hos mus, det auditive (tympaniske) bulla omslutter luftfyldt mellemørets hulrum, hvorimod hos mennesker, mastoid luftceller sammensat af trabekulær knogle i tindingebenet huser øreknoglerne snarere end en bulla 37. I begge arter, den auditive kapsel (otiske kapsel, benet labyrint) omslutter cochlea og halvrunde kanalerne i det indre øre. Sammenlignende og evolutionær biologi mellemøret er blevet grundigt revideret 38-40.
Protokollen tilvejebragt nedenfor første beskriver, hvordan at dissekere den auditive bulla og kapsel, som består primært af mellemøret og det indre øre. Denne protokol viser også, hvordan man kan isolere malleus, ambolt og stapes fra det auditive bulla. Endelig det viser, hvordan at orientere auditive bulla og kapsel til indlejring i forberedelse til væv sektionering af auditive ossicles.
Protocol
Alle dyreforsøg udført i denne undersøgelse, er godkendt af Keio University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC - godkendelsesnummer: 09.221) og følge Institutionelle retningslinjer for dyreforsøg på Keio University for anvendelse af dyr i forskningen. Humane prøver blev isoleret fra en kadaver doneret til Anatomisk Institut, Keio University School of Medicine, og blev anvendt i overensstemmelse med de institutionelle regler.
1. Isolering af Auditiv Bulla og Capsule
- Aflive mus i en beholder indeholdende en platform over papirhåndklæder gennemvædet i isofluran eller sevofluran indtil respiratorisk ventilation ophører i mere end et minut og derefter udføre cervikal dislokation. Vær omhyggelig med at undgå direkte kontakt af mus med de udblødte papirservietter.
- Lav en lille tværgående indsnit ved dorsale side af halsen og træk huden fra hinanden mod hoved og hale med begge hænder for at eksponere underliggende hals muscle væv.
- Halshugge mus ved den cervikale region hjælp 14 cm skarpe kirurgiske sakse.
- Peel huden helt mod næsen. Skær alle hud sammen med snuden og fortænder.
- Indsæt saks i munden og skære tyggemuskler på begge sider.
- Åbne kæben forsigtigt og fjern tungen og underkæben sammen.
- Brug af skarp saks, split kraniet og kraniet basen i to halvdele langs midsagittal plan (figur 1A, B).
- Ved hjælp af pincet, fjerne de cerebrale og cerebellare halvkugler og hjernestammen. Den auditive bulla og kapslen er placeret lateralt for cerebellum og hjernestammen. Bemærk, at den auditive bulla yderligere lateralt til den auditive kapsel (fig 1C, D).
- Dissekere ud bulla og kapslen med den omgivende kraniet (figur 1E).
- Prøven overføres til en skål indeholdende phosphatbufret saltvand (PBS) pH 7,4 ved stuetemperatur.
- Under en kikkert dissektionsmikroskop, bruge pincet til at trække fra hinanden de omkringliggende knogler og saks til at klippe den løsnede grænse omkring bulla og kapslen (figur 1F). De omkringliggende knogler fjernet er basioccipital (ventrale grænse), exoccipital (Ventro-posterior grænse), supraoccipital (posterior grænse), interparietal, parietal (dorsale kant), squamosal (dorso-forreste kant), alisphenoid (forreste kant), og basisphenoid (antero-ventral grænserne) knogler. Bemærk at styliform fremgangsmåde (Sp), som understøtter den tympaniske åbning af det eustakiske rør 41, er forskellig fra den styloid fremgangsmåden ifølge den temporale knogle.
2. Isolering af Auditiv ossicles: Malleus, ambolt og stigbøjlen
- Malleus
- Brug begge lille saks og pincet, fjern del af den ydre øregang lateralt for sulcus lympanicus så trommehinden er synlig (figur 2A, B).
- Fjern en del af trommehinden og Trommebenet nær malleal processus brevis (orbicular apophysis, se Diskussion), både på den ventrale (punkteret) og posterior (#) vægge (Figur 2C). Den Malleus og tensor tympani muskel bør nu blive udsat (figur 2D, E).
- Løft malleus (figur 2F) og skære tensor tympani musklen med skrå kant af en 27 G nål (figur 2G). Bemærk, at den malleal manubrium fast tillægger trommehinden, som det ses i andre pattedyr.
- Frigør trommehinden grundigt igennem manubrium, som er skrøbelig. Fjern Trommebenet at afsløre de tre auditive ossicles.
- Dislokere malleus fra ambolten ved ossicular led (figur 2H).
- Isoler malleus ved brud den forreste proces på goniale.
- Ambolt og stigbøjlen
- Isoler than ambolt ved at afskære den bageste ligament af ambolten i den korte crus (figur 3A).
- Isoler stigbøjlerne ved at afskære stapedial arterie nær stapes med den affasede kant af en 27 G nål (figur 3B, C). Hvis det er nødvendigt, skæres senen af stapedial muskler på den muskulære processen stapes med nålen.
- Sæt en synål (eller en mærkning ben) ind i obturator foramen af stapes og løft stigbøjlerne. Efter fjernelse stapes, bør det ovale vindue åbning være klart synlig (figur 3D).
3. Indlejring af Auditiv Bulla og Capsule
- Forberedelse til indlejring i paraffinblokke
- Isoler Bulla og kapslen, som beskrevet i afsnit 1.
- Skær den forreste ende af bulla (den styliform processen) af med saks, nedsænkes bulla og kapslen i 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS ved 4 °C, og lad fiksativ til at indgå i bulla. Hvis luften bliver fanget i bulla, fjerne det med en nål og sprøjte. Lad bulla og kapslen i fiksativ ved 4 ° CO / N på et rør rotator.
Advarsel: PFA er giftigt og bør håndteres forsigtigt. - Der vaskes én gang med PBS.
- Afkalkning bulla og kapsel i en uge ved 4 ° C i 10% ethylendiamintetraeddikesyre dinatriumsaltdihydrat (EDTA-2Na), 100 mM Tris-base, pH 7,0, i en 2 ml rør. Skift buffer hver anden dag.
- Der vaskes én gang med PBS. Prøver kan opbevares i 70% ethanol i vand ved 4 ° C. Eventuelt, overførsel til 70% ethanol ved en gradueret alkohol serien (30%, 50%, 70% i vand).
- På et væv processor, dehydrere prøver i en gradueret serie af ethanolopløsninger (70%, 2 x 95%, 3x 100%, hver 1H), klar i xylen (4x, hver 1 time ved 40 ° C), og infiltrere prøver med smeltet paraffinvoks 42. Eventuelt erstatte xylen med kommerciel væv clearing opløsning (f.eks Histo-Clear).
- Losse prøver fra processoren, og fjerne dem fra deres kassetter.
- På et væv indlejring konsol system sted prøver i forme fyldt med smeltet paraffin. Fortsæt til indlejring (afsnit 4).
- Forberedelse til indlejring i frosne blokke (Kawamoto film metode) 43
- Isoler Bulla og kapslen, som beskrevet i afsnit 1.
- Skær den forreste ende af bulla (den styliform processen) af med saks, nedsænkes bulla og kapslen i fiksativ (2% eller 1% PFA ikke 4% i PBS for at bevare antigenicitet) ved 4 ° C. Hvis der kommer luft i bulla, fjerne det ved hjælp af en kanyle og sprøjte. Lad bulla og kapslen i fiksativ ved 4 ° CO / N på et rør rotator.
- Vask bulla og kapsel hurtigt i PBS og straks nedsænkes i flydende cryo-embedding forbindelse ved 4 ° C.
- Vigtigt: Fjern luftbobler, hvis nogen i midtenog ydre øre gennem aspiration af en nål, og ved at lægge indlejring forbindelsen med pincet. Fortsæt til indlejring (afsnit 4).
4. Prøve Orientering og Indlejring
BEMÆRK: Hele bulla og kapsel skal være indrettet i en bestemt orientering under indlejring at skære ønskede sektioner. Procedurerne nedenfor skitserede bruges til afsnittet malleus i forskellige orienteringer.
- Longitudinal (parasagittal) sektionering af malleus
- Sætte den laterale side af bulla eller ydre øregang ned i varmt paraffin (eller kryo-embedding forbindelse). Juster orientering, således at halsen og tværgående lamina af malleus er parallelle med den vandrette bund indlejring skålen (figur 4A - C). Bemærk, at trommehinden hælder i en vinkel på ca. 30 ° med lodret i muse hovedet (figur 4A, figur 59 i Kampen
- Sætte den laterale side af bulla eller ydre øregang ned i varmt paraffin (eller kryo-embedding forbindelse). Juster orientering, således at halsen og tværgående lamina af malleus er parallelle med den vandrette bund indlejring skålen (figur 4A - C). Bemærk, at trommehinden hælder i en vinkel på ca. 30 ° med lodret i muse hovedet (figur 4A, figur 59 i Kampen
- Vandret sektionering af malleus
- Placer dorsale våbenskjold vandret i varm paraffin (eller cryo-embedding forbindelse). Juster orienteringen af bulla og kapslen, så at hals og tværgående lamina af malleus er vinkelret på bunden af indlejringen skålen (figur 4D - F).
- Frontal sektionering (tværsnit) af manubrium og trommehinden 5
- Placer malleal manubrium i varmt paraffin (eller kryo-embedding forbindelse), således at den er vinkelret på bunden af indlejring skålen.
- Køl ned blokken til temperaturer egnede til at hærde paraffin på et væv indlejring konsol-system (alternativt, benytte cryo-indlejring forbindelse i en tøris / hexan bad).
- Proces væv blok og skære sektioner ved hjælp af rutinemæssige procedurer. For eksempel plet paraffinsnit med hematoxylin og eosin (H & #38, E), safranin O (for brusk), eller for tartrat-resistent syrephosphatase (TRAP) aktivitet (for osteoklaster) 3, eller ved immunhistokemi. Afkalkede kryosektioner er egnede til knogle- mærkning under anvendelse fluorochromer 14, alizarinrødt farvning for calcium, og immunfluorescens 42.
Representative Results
Denne protokol viser en fremgangsmåde til isolering ossicles fra muse auditive bulla. Først bliver bulla og kapslen dissekeret ud som et enkelt stykke fra kraniet (figur 1). Det dissekerede bulla anvendes derefter til fremstilling af malleus (figur 2) og ambolten og stapes (figur 3). Seværdigheder i auditive bulla og kapsel er styliform proces på forreste ende af bulla, den dorsale våbenskjold, forreste halvrunde kanalen, og subarcuate fossa (figur 1F). MikroCT tomografi (CT) afbildning afslører ossicles i den auditive bulla samt de optimale retningslinjer for langsgående og vandrette sektionering af disse øreknoglerne (figur 4).
For langsgående paraffin sektionering af malleus, blev den bulla og kapslen afkalket i EDTA ved 4 ° C i en uge, indlejret i en paRAFFIN blok på orienteringen vist i figur 4 A - C, snittet ved 4 um, og derefter farvet under anvendelse af H & E. Den malleus fæstnet til trommehinden i den auditive bulla afslørede igangværende endochondral ossifikation ved P14 (figur 5A). At visualisere ny knogledannelse blev calcein (30 ug / g legemsvægt) peritonealt injiceret i en P20 mus, og bulla og kapslen blev isoleret 24 timer senere ved P21. Prøven uden afkalkning var indlejret frosne og derefter cryosectioned på 6 um bruger en klæbende film baseret på metoden til Kawamoto 43. Efter nuklear farvning med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol), blev afsnittet observeret under et fluorescensmikroskop. Calcein signaler (grøn) afslørede nye knogledannelse i malleus (m), bulla og kapslen (figur 5B). For vandret sektionering af malleus blev den auditive bulla isoleret fra en 5 uger gammel mus indlejret frosne uden afkalkning (fororientering se Figur 4D - F), cryosectioned på 6 um under anvendelse af Kawamoto metode og farvet under anvendelse af H & E. Vandret sektionering af malleal processus brevis (MPB) viser også cochlea (figur 5C).
En medial afbildning af de rette auditive øreknoglerne isoleret fra en P31 mus viser typiske træk ved muse malleus, nemlig "glide-seagull-wing-lignende" (eller persiske sværd-lignende 45) manubrium, en fremtrædende processus brevis (orbicular apophysis , se diskussionen), og den tværgående lamina (figur 6). Bemærk, at den forreste fremgangsmåde (processus anterior) blev afrevet i dissektion procedure omkring goniale og blev separeret fra tympaniske ring (ectotympanic). Dette repræsentativ prøve udviser en intakt incudomalleolar samling mellem malleus og ambolt, mens incudostapedial samling er forvredet. Tendinous insertioner i den malleal ogstapedial muskulære processer kan påvises (figur 6A, asterisk).
Figur 6B sammenligner muse og humane auditive ossicles med samme forstørrelse. Arter forskelle, bortset størrelse, omfatter følgende. Den malleal Manubrium er vingelignende i mus, men club-lignende hos mennesker. Vinklen mellem anatomisk akse (eller rotationsaksen, linjen gennem den forreste fremgangsmåden malleus og den korte proces af ambolt) og manubrium er meget mindre i mus og to er næsten parallelle, i modsætning til næsten vinkelret hos mennesker 6,46-48. I humane ossicles, vibrometric undersøgelser viser, at incudo-malleolar fælles er mobile i stedet funktionelt fast 49. Musen malleus udviser en bred, tynd og flad tværgående lamina ikke synlige i mennesker 47. Hos mus, den processus anterior sikringer til hindeagtige knogler, nemlig goniale og tympanic ring, mens processus anterior i mennesker reduceres til et lille spicule af ben 41. Stapes af mus og mennesker også adskiller: i mus, den forreste crus er krum og den bageste crus er mere lige henviser i mennesker, den forreste crus er mere lige end den posteriore crus. Det er værd at bemærke, at malleus hoved i forhold til kroppens størrelse massivt udvides i arter som den gyldne muldvarp, viser betydelig variation i allometrisk relationer "de mindste" knoglerne 48.
Figur 1. Dissektion af Auditory Bulla og Capsule. (A) Kraniet af en P31 mus er opdelt i højre og venstre halvdele. A, anterior; P, posterior; L, venstre; R, right. (B) Medial overflade af den højre halvdel af bisected, flået hoved. Cx, hjernebark; Cb, cerebellum; Bs, brainstem. D, dorsal; V, ventral. (C) Fjernelse af hjernen med en pincet. (D) Medial visning af den auditive kapsel i den rigtige kraniet. Den dorsale våbenskjold (pilespidser) ligger mellem den midterste kranie fossa (MCF) og posterior kranie fossa (PCF) og adskiller dorso-anterior og Ventro-posterior overflader af det auditive kapsel. Scale bar, 2 mm. (E) Højere forstørrelse af auditive bulla og kapsel (mediale visning). Co, cochlea; VII, facial nerve; VIII, vestibulocochlear nerve; AC, anterior (superior) halvcirkelformet kanal; Sf, subarcuate fossa, som huser cerebellare paraflocculus. Scale bar, 1 mm. (F) Mikrograf af isolerede auditive bulla og kapsel (mediale visning). Sp, styliform proces. Scale bar, 1 mm. (A - E), P31 mus. (F), P33 mus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Dissektion af Malleus. (A) ventrolaterale billede af en ret auditiv bulla og kapsel. Sulcus lympanicus (ST, stiplet pil) er fastgørelsesstedet af trommehinden. Knoglen lateralt for ST er en del af det ydre øre, og knoglen medialt til ST danner gulvet i mellemørets hulrum. A, anterior; P, posterior; D, dorsal; V, ventral. (B) Udsigt efter fjernelse af den ydre øregang at afsløre trommehinden (TM), herunder pars flaccida (PF) og pars Tensa (PT). (C) Fjernelse af dele af Trommebenet (stiplede linier og #) i nærheden af malleal processus brevis (MPB). m, Malleus; mM, malleal manubrium. Pil, luftboble i mellemørets hulrum set gennem trommehinden. (D) Udsat Malleus. Malleus hoved er angivet. punkteretlinje angiver den artikulære overflade af ambolt. (E) sene af tensor tympani musklen (TT) er fastgjort til malleus. (F) Den tensor tympani trækkes når malleus løftes. *, Muskulære proces. (G) Tensor lympani skæres ved anvendelse af en nål. (H) Tre auditive øreknoglerne efter fjernelse af trommehinden. Den incudo-malleolar samling er forvredet. m, Malleus; Jeg, ambolt; s, stapes; Gå, goniale (fusioneret til malleus og trommehinden ring, TR). Alle skala barer, 0,5 mm. (A, H), P33 mus. (B - G), P31 mus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Dissektion af ambolten og stigbøjlen. (A) ambolt ogstapes efter fjernelse af malleus. Den stapedial arterie (SA) passerer gennem stapes (s). Stiplet linje angiver den artikulære overflade af ambolt. Bemærk, at den korte crus (ICB, crus breve) af ambolten (i) er fastgjort ved den bageste ligament (ikke vist). Asterisk, muskulære proces med stapes. (B) stapes efter fjernelse af ambolten. Nålespidsen bruges til at skære den stapedial arterie (SA). Pil, retning af blodstrømmen. Stiplet linje angiver ledflade stapes. (C) Den stapedial arterie fjernes fra stapes. X angiver den afskårne ende af stapedial arterie (SA). (D) Den ovale vindue (Ow, Fenestra ovalis eller Fenestra vestibuli) er synligt efter fjernelse af stapes. Rw, runde vindue (Fenestra rotunde eller Fenestra cochleae). Scale barer, 0,5 mm. Klik her for at se en større version af dennefigur.
Figur 4. Orientering af Auditory Bulla og Capsule under Integrering for Longitudinal (parasagittal, A - C) og Horizontal (D - E) Skæring af Malleus. (A - C) Halsen og tværgående lamina af malleus anbringes parallelt med bunden af indlejring skålen. (A) Side visning: mikro-CT billede for at vise indlejring af retten malleus i bulla (pseudocolored blå). Den Malleus og ambolt er pseudocolored grønt. Stiplet linie, den ønskede skæreplan. Solid line, bunden af indlejring skålen. m, Malleus; pilespidser, dorsale crest. M, medial; L, lateral; D, dorsal; V, ventral. (B) Set ovenfra: Micro-CT-billede. Bemærk, at den forreste ende af bulla (styliform proces) blev fjernet. Jeg, ambolt. (C) fra oven: micrograph (taget med etfarvefilter). AC, anterior (superior) halvcirkelformet kanal; Sf, subarcuate fossa; Sp, styliform proces. A, anterior; P, posterior; D, dorsal; V, ventral. (D - F) Den processus brevis af malleus placeres vinkelret på bunden af indlejring skålen. (D) Side visning: Micro-CT billede for at vise indlejring af retten malleus. Stiplet linie, den ønskede skæreplan. Solid line, bunden af indlejring skålen. (E) Set ovenfra: Micro-CT-billede. mM, malleal manubrium. (F) fra oven: micrograph (taget med et farvefilter). Scale barer, 1 mm. Micro-CT-billeder blev opnået ved en voxel opløsning på 5 um, som tidligere beskrevet 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Histologi. (A) H & E farvning. Longitudinal (parasagittal) afsnit af paraffin-indstøbt højre Malleus (m) i den auditive bulla (stiplet linie) ved P14. TM, trommehinden. (B) Calcein knogle mærkning. Længdesnit af den frosne, uafkalket venstre malleus (m) i den auditive bulla på P21. Counterstain, DAPI. (C) H & E farvning. Vandrette sektion af den frosne, afkalkede efterladt malleal processus brevis (MPB) i den auditive bulla og kapslen (5 uger gamle mus). Co, cochlea. Scale barer, 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Medial Udsigt Auditiv ossicles. (A) højre auditive ossicles P31 mus. A, anterior; P, posterior; D, dorsal; V, ventral. Scale bar, 1 mm. Malleus hoved (Caput mallei, lårbenshovedet mallei); hals (Collum mallei); lamina (tværgående lamina); mM (Manubrium mallei); sort asterisk (muskulær proces af malleus); MPA (Processus anterior, Processus gracilis); MPB (processus brevis); ambolt legeme (Corpus incudis); ICB (Crus breve, kort crus, kort proces); ICL (Crus longum, lang crus, lang proces); IPL (Processus lenticularis, linseformede proces, Sylvian apophysis); stapes hoved (Caput stapedis); hvid stjerne (muskulær proces med stapes); Sca (Crus anterius, forreste crus); scp (Crus posterius, bageste crus); base (Basis stapedis, fodplade); SOF (obturator foramen, intercrural foramen). (B) Højre auditive ossicles af en 76-årig kvindelig (Courtesy af Anatomisk Institut, Keio University School of Medicine). De ossicles af P31 mus (nederst til højre) er afbildet på samme forstørrelse som anvendes for humane ossicles. Curved pile angiver vinklen mellem den anatomiske akse og manubrium (stiplede linjer). Scale bar, 2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her præsenteres en fremgangsmåde nyttigt at isolere den auditive bulla og kapsel i postnatale mus. Forud for P12, væv er skrøbelige og kan blive beskadiget under isolation. Efter P12, kan den auditive bulla og kapsel let isoleres fra omgivende væv. Dissekere bulla fra hovedet før sektionering har flere fordele. Først postnatal kavitation og vækst af den auditive bulla forekomme mest aktivt fra P6 fremefter og er fuldstændig ved P14 50. Den mesenkymale væv mellem trommehinden og cochlear væg erstattes af luft gennem kavitation proces. Den resulterende luft i mellemørets hulrum kan hindre kontakt mellem væv og væsker under fiksering, afkalkning og forankring. Det er lettere at fjerne luft fra den isolerede auditive bulla ved at afskære den forreste ende (styliform processen) snarere end at forsøge at gøre det i den uisolerede bulla. Sekund, orientering af malleus (og trommehinden) er ikke lodreti hovedet. Det er derfor lettere at afsnittet malleus i ønskede planer ved at indlejre den isolerede auditive bulla og kapsel i en given orientering.
Når isoleret, auditiv bulla og kapsler er nyttige for mange analyser. For eksempel kan høj opløsning X-ray micro-CT afslører knogle mikrostruktur morfologi såsom osteogene kapillærer i malleus 14. Den stereofluorescence dissektionsmikroskop er et kraftfuldt værktøj til at visualisere strukturer i evalueringen reporter mus, der udtrykker fluorescerende proteiner i midten eller indre øre 33. Desuden kunne forskellige in vivo eller ex vivo fluorescensmetoder mærkning og hele mount immunfluorescenspåvisningen skal gennemføres. Lys ark fluorescensmikroskopi er også nyttigt for tredimensional analyse 51. Selvom det ikke er beskrevet her, diverse anatomiske strukturer forbundet med den auditive bulla og kapsel såsom perifere nerver, blodkar, ogtrommehinden i mellemøret kan også evalueres ved hjælp af denne protokol.
Bemærk, at paraffin sektionering kræver afkalkning af knoglevæv før indlejring og derfor ikke tillader analyse af mineralisering. Derimod kan den Kawamoto film metode 43 anvendes til fremstilling af frosne sektioner udføres uden afkalkning og er velegnet til mineralisering undersøgelser under anvendelse in vivo teknikker knogle-mærkning eller specielle farvning såsom Alizarin farvning. Cryo-sektionsopdelingen betingelser bør optimeres ifølge baseret på mus alder. For eksempel anbefales en mindre køligt temperaturen inde i kryostatkammeret for ældre mus prøver at minimere skader på sektioner.
I mus, den korrekte betegnelse for den fremtrædende halvkugleformede fremspring i malleus er "orbicular apophysis". Alligevel udtrykket "processus brevis" har været almindeligt anvendt til at angive orbicular apophysis for mere then to årtier, især blandt mus udviklingsmæssige biologer 16,20,22-25. "Processus brevis", der oprindeligt henvist til den laterale proces (processus lateralis), som afviger fra den orbicular apophysis. Hos mennesker, en lateral proces ligner en let konisk fremspring danner den generelle linje for fastgørelse til trommehinden, der strækker sig fra manubrium (ikke ses i figur 6B, mediale visning). Hos mus, den laterale fremgangsmåde er også en projektion af manubrium ved den modsatte ende til umbo 48. Pars flaccida af trommehinden er over den laterale fremgangsmåde i malleus. Orbicular apophysis fremgår ikke i den menneskelige malleus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools/Equipment | |||
| Paper towel | Daio Paper Corporation | 703347 | can be purchased from other vendors |
| Glass Jar | Various | can be purchased from other vendors | |
| 14 cm surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 91400-14 | can be purchased from other vendors |
| Extra fine scissors-straight | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14084-08 | can be purchased from other vendors |
| Fine Forceps Angled 45° | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11063-07 | can be purchased from other vendors |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800N | for routine dissection |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ18 | for movies |
| Injection needle 27 G | TERUMO | NN-2719S | |
| Syringe (1 mL) | TERUMO | SS-01T | |
| Marking Pin | Various | ||
| Tube rotator RT-50 | TAITEC | 0000165-000 | can be purchased from other vendors |
| Cryostat | Leica | CM3050S | http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/ |
| TC-65 Tungsten blade | Leica | 14021626379 | for Kawamoto's firm method |
| Stainless containers | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Cryofilm type IIC | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Silane coated slide (New Silane II) | Muto Pure Chemicals | 511617 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Matsunami | can be purchased from other vendors | |
| Tissue processor | Sakura Finetek | VIP-5 | can be purchased from other vendors |
| Tissue Embedding Console System | Sakura Finetek | Tissue-Tek TEC 5 | can be purchased from other vendors |
| Sliding microtome for paraffin | Yamato Kohki Industrial | REM-710 | can be purchased from other vendors |
| Path Blade+pro for hard tissue | Matsunami | PB3503C | for paraffin section |
| Micro-CT | RIGAKU | R_mCT2 | http://www.rigaku.com/en |
| Fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Isoflurane | Maruishi pharmaceutical Co. Ltd | ||
| NaCl | wako | 191-01665 | for PBS |
| KCl | wako | 285-14 | for PBS |
| Na2HPO4 12H2O | wako | 196-02835 | for PBS |
| KH2PO4 | wako | 287-21 | for PBS |
| Paraformaldehyde (PFA, EM Grade) | TAAB | P001 | |
| EDTA-2Na | wako | 15111-45 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Super Cryoembedding Medium | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Dry Ice | Various | for Kawamoto's firm method | |
| Hexane | wako | 080-03423 | for Kawamoto's firm method |
| Super Cryomouting Medium type R2 | Leica | for Kawamoto's firm method | |
| Paraffin | Sakura Finetek | 781001A0107 | |
| Histo-Clear | NDS | HS-200 | |
| Calcein | DOJINDO | 340-00433 | |
| Hematoxylin | wako | 131-09665 | |
| Eosin | wako | 051-06515 |
References
- Mallo, M. Formation of the middle ear: recent progress on the developmental and molecular mechanisms. Dev Biol. 231, 410-419 (2001).
- Manley, G. A. An evolutionary perspective on middle ears. Hear Res. 263, 3-8 (2010).
- Kanzaki, S., Ito, M., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Resorption of auditory ossicles and hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. Bone. 39, 414-419 (2006).
- Kanzaki, S., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Bisphosphonate therapy ameliorates hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. J Bone Miner Res. 24, 43-49 (2009).
- Cordas, E. A., et al. Thyroid hormone receptors control developmental maturation of the middle ear and the size of the ossicular bones. Endocrinology. 153, 1548-1560 (2012).
- Dong, W., Varavva, P., Olson, E. S. Sound transmission along the ossicular chain in common wild-type laboratory mice. Hear Res. 301, 27-34 (2013).
- Kanzaki, S., et al. Impaired vibration of auditory ossicles in osteopetrotic mice. Am J Pathol. 178, 1270-1278 (2011).
- Qin, Z., Wood, M., Rosowski, J. J. Measurement of conductive hearing loss in mice. Hear Res. , (2009).
- Klein, J. O. Is acute otitis media a treatable disease? N Engl J Med. 364, 168-169 (2011).
- Rosch, J. W., et al. A live-attenuated pneumococcal vaccine elicits CD4+ T-cell dependent class switching and provides serotype independent protection against acute otitis media. EMBO Mol Med. 6, 141-154 (2014).
- Li, X., et al. Otitis media in sperm-associated antigen 6 (Spag6)-deficient mice. PLoS One. 9, e112879 (2014).
- Rodríguez Vázquez, J. F., Mérida Velasco, J. R., Jiménez Collado, J. A study of the os goniale in man. Acta Anat (Basel). 142, 188-192 (1991).
- Tucker, A. S., Watson, R. P., Lettice, L. A., Yamada, G., Hill, R. E. Bapx1 regulates patterning in the middle ear: altered regulatory role in the transition from the proximal jaw during vertebrate evolution. Development. 131, 1235-1245 (2004).
- Matsuo, K., et al. Osteogenic capillaries orchestrate growth plate-independent ossification of the malleus. Development. 142, 3912-3920 (2015).
- Matsuo, K. Cross-talk among bone cells. Curr Opin Nephrol Hypertens. 18, 292-297 (2009).
- Rijli, F. M., et al. A homeotic transformation is generated in the rostral branchial region of the head by disruption of Hoxa-2, which acts as a selector gene. Cell. 75, 1333-1349 (1993).
- Mallo, M., Gridley, T. Development of the mammalian ear: coordinate regulation of formation of the tympanic ring and the external acoustic meatus. Development. 122, 173-179 (1996).
- O'Gorman, S. Second branchial arch lineages of the middle ear of wild-type and Hoxa2 mutant mice. Dev Dyn. 234, 124-131 (2005).
- Santagati, F., Minoux, M., Ren, S. Y., Rijli, F. M. Temporal requirement of Hoxa2 in cranial neural crest skeletal morphogenesis. Development. 132, 4927-4936 (2005).
- Satokata, I., Maas, R. Msx1 deficient mice exhibit cleft palate and abnormalities of craniofacial and tooth development. Nat Genet. 6, 348-356 (1994).
- Zhang, Z., et al. Malleal processus brevis is dispensable for normal hearing in mice. Dev Dyn. 227, 69-77 (2003).
- Houzelstein, D., Cohen, A., Buckingham, M. E., Robert, B. Insertional mutation of the mouse Msx1 homeobox gene by an nlacZ reporter gene. Mech Dev. 65, 123-133 (1997).
- Martin, J. F., Bradley, A., Olson, E. N. The paired-like homeo box gene MHox is required for early events of skeletogenesis in multiple lineages. Genes Dev. 9, 1237-1249 (1995).
- Yamada, G., et al. Targeted mutation of the murine goosecoid gene results in craniofacial defects and neonatal death. Development. 121, 3005-3012 (1995).
- Rivera-Pérez, J. A., Mallo, M., Gendron-Maguire, M., Gridley, T., Behringer, R. R. Goosecoid is not an essential component of the mouse gastrula organizer but is required for craniofacial and rib development. Development. 121, 3005-3012 (1995).
- Coré, N., et al. Tshz1 is required for axial skeleton, soft palate and middle ear development in mice. Dev Biol. 308, 407-420 (2007).
- Li, C., Scott, D. A., Hatch, E., Tian, X., Mansour, S. L. Dusp6 (Mkp3) is a negative feedback regulator of FGF-stimulated ERK signaling during mouse development. Development. 134, 167-176 (2007).
- Hwang, C. H., Wu, D. K. Noggin heterozygous mice: an animal model for congenital conductive hearing loss in humans. Hum Mol Genet. 17, 844-853 (2008).
- Calvert, J. A., et al. A missense mutation in Fgfr1 causes ear and skull defects in hush puppy mice. Mamm Genome. 22, 290-305 (2011).
- Carpinelli, M. R., et al. Anti-apoptotic gene Bcl2 is required for stapes development and hearing. Cell death dis. 3, e362 (2012).
- Chapman, S. C. Can you hear me now? Understanding vertebrate middle ear development. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1675-1692 (2011).
- Kitazawa, T., et al. Distinct effects of Hoxa2 overexpression in cranial neural crest populations reveal that the mammalian hyomandibular-ceratohyal boundary maps within the styloid process. Dev Biol. 402, 162-174 (2015).
- Wang, L., et al. Scleraxis is required for differentiation of the stapedius and tensor tympani tendons of the middle ear. J Assoc Res Otolaryngol. 12, 407-421 (2011).
- Amin, S., Tucker, A. S. Joint formation in the middle ear: lessons from the mouse and guinea pig. Dev Dyn. 235, 1326-1333 (2006).
- Amin, S., Matalova, E., Simpson, C., Yoshida, H., Tucker, A. S. Incudomalleal joint formation: the roles of apoptosis, migration and downregulation. BMC Dev Biol. 7, 134 (2007).
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of anatomy. 201, 15-29 (2002).
- Treuting, P. M., Dintzis, S. M. Ch. 22, Special senses: ear. Comparative Anatomy and Histology: A Mouse and Human Atlas. Treuting, P. M., Dintzis, S. M. 22, Academic Press. 419-432 (2012).
- Mallo, M., Schrewe, H., Martin, J. F., Olson, E. N., Ohnemus, S. Assembling a functional tympanic membrane: signals from the external acoustic meatus coordinate development of the malleal manubrium. Development. 127, 4127-4136 (2000).
- Anthwal, N., Joshi, L., Tucker, A. S. Evolution of the mammalian middle ear and jaw: adaptations and novel structures. Journal of anatomy. 222, 147-160 (2013).
- Takechi, M., Kuratani, S. History of studies on mammalian middle ear evolution: a comparative morphological and developmental biology perspective. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 314, 417-433 (2010).
- Henson, O. W. Jr Ch. 3, Comparative Anatomy of the Middle Ear. Handbook of Sensory Physiology. Keidel, W. D., Neff, W. D. Vol. 1, Auditory System. Anatomy, Physiology (Ear), Springer. Berlin Heidelberg. 39-110 (1974).
- Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. , Humana Press. (2003).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
- Kampen, P. N. V. Gegenbaurs Morphologiesches Jahrbuch. 34, W. Engelmann. 321-722 (1905).
- Lee, J. H., Park, K., Kang, T. C., Choung, Y. H. Three-dimensional anatomy of the temporal bone in normal mice. Anat Histol Embryol. 38, 311-315 (2009).
- Fleischer, G. Evolutionary principles of the mammalian middle ear. Adv Anat Embryol Cell Biol. 55, 3-70 (1978).
- Lavender, D., Taraskin, S. N., Mason, M. J. Mass distribution and rotational inertia of "microtype" and "freely mobile" middle ear ossicles in rodents. Hear Res. 282, 97-107 (2011).
- Mason, M. J. Of mice, moles and guinea pigs: functional morphology of the middle ear in living mammals. Hear Res. 301, 4-18 (2013).
- Willi, U. B., Ferrazzini, M. A., Huber, A. M. The incudo-malleolar joint and sound transmission losses. Hear Res. 174, 32-44 (2002).
- Richter, C. A., et al. Defects in middle ear cavitation cause conductive hearing loss in the Tcof1 mutant mouse. Hum Mol Genet. 19, 1551-1560 (2010).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61, 382-395 (2013).
