Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית

Summary

קריו-סעיפים רצופים נאספים כדי לאפשר יישומים היסטולוגית והעשרה של RNA למדידות ביטוי גנים באמצעות אזורים סמוכים מתוך שרירי שלד יחיד עכבר. RNA באיכות גבוהה מתקבל מ 20 - 30 מ"ג של cryosections ומדידות ונקווה מושווים ישירות בין יישומים.

Abstract

באמצעות שיטה זו, ברציפות cryosections נאספים כדי לאפשר הן יישומים במיקרוסקופ לצורך היסטולוגיה רקמה והעשרה של רנ"א עבור ביטוי גנים באמצעות אזורים סמוכים מתוך שרירי השלד יחיד העכבר. בדרך כלל, אתה עשוי להתקשות להשיג הומוגניזציה נאותה דגימות שריר שלד קטנות בגלל כרכי חיץ עשויים להיות נמוכים מדי עבור יישומי שחיקה יעילים, עדיין ללא הפרעה מכאנית מספיק, ארכיטקטורת הרקמה הצפופה של חדירה לתחום שריר של ריאגנטים חיץ, גורמת בסופו של דבר תשואת RNA נמוכה. על ידי ביצוע הפרוטוקול שדווח כאן, 30 מיקרומטר חלקים נאספים ונקווים המאפשרים cryosectioning ויצירת הומוגניות מחט לאחר מכנית לשבש את השריר, הגדלת שטח הפנים החשוף לחדירת חיץ. המגבלות העיקריות של הטכניקה הן כי זה דורש cryostat, וזה יחסית תפוקה נמוכה. עם זאת, RNA באיכות גבוהה ניתן להשיג דגימות קטנות של מטר ויקווהcryosections uscle, מה שהופך שיטה זו נגישה עבור שרירי שלד ורקמות אחרות רבים ושונים. יתר על כן, טכניקה זו מאפשרת ניתוחים מתאימים (למשל, histopathology רקמות ביטוי גנים) מאזורים סמוכים של שרירי שלד יחידים כך שמדידות ניתן להשוות באופן ישיר בין יישומים כדי לצמצם את אי הוודאות ניסיונית להפחית ניסויים בבעלי חיים בשכפול הדנ"א צורך למקור רקמה קטנה עבור יישומים מרובים.

Introduction

מטרת טכניקה זו היא להפוך ניתוחים ניסיוניים מרובים על ידי שיטות שונות, כגון ביטוי היסטולוגיה גן, נגישות מכל רקמה ממקור שרירי שלד אחת קטנה. יישומים מיקרוסקופים הם הרגישים ביותר כדי לטעום דרכי שימור, אשר חייב להיות מבוקר בקפידה כדי להגביל את ההיווצרות של חפצי גביש הקרח במהלך cryopreservation. לפיכך, פיתוח שיטה מבוסס על קדמי tibialis (ת"א) שריר קפוא מכוסה חלקית עם ההטבעה שרפה באמבט חנקן מקורר נוזל -140 ° C 2-methylbutane כחומר המקור הוא מיקרוסקופיה immunofluorescence ביטוי גני המנתח.

הצורך להשתמש באותו מקור חומר עבור גישות טכניות מגוונות חשוב במיוחד עבור ניסויים מבוססי זריקה תוך שרירית שבו השרירים ימין ועל שמאל מייצגים תנאים שונים, אחד ניסוי ובקרה אחד. לדוגמה, במחקרים התחדשות שריר, mu אחדscle מוזרק עם רעלן לגרום נזק לרקמות נרחבת תוך השריר הנגדי משמש כביקורת הרכב מוזרק ^1. בדומה לכך, מחקרי ריפוי גנטי להפרעות שריר בדרך כלל מתחילים עם אימות של וקטור הריפוי הגנטי על ידי זריקה תוך שרירית להיות לעומת וקטור ריק, וקטור קשור או שליטה ברכב בצד הנגדי ^2. לכן, אין זה אפשרי למקור כל שריר ת"א ליישום אחר.

אסטרטגיות נפוצות להתמודד עם בעיה זו הן: i) להשתמש קבוצת שרירים שונה עבור כל יישום, ii) להשתמש עכברים נוספים, או iii) כדי לחתוך חתיכה של השריר עבור כל יישום. עם זאת, הבדלים משמעותיים בין קבוצות השרירות להקשות להשוות נתונים מיישומים נפרדים, וחיות נוספות להגדיל הוצאה והם גרועים מוצדקים אם קיימות חלופות אחרות. חלוקת השרירים לאחר דיסקציה למקור יישומים שונים היא i האפשרות הטוב ביותרבמקרים רבים n. עם זאת, את החלקים שרירים הם בדרך כלל קטנים מדי לשימוש אִבּוּק תחת חנקן נוזלי או טכניקות שחיקה מכנית עבור המגון ^2-5. כמו שריר היא רקמה מבנית מאוד עמוסה חלבוני מטריקס התכווצות תאיים, המגון מכאני לקוי מוביל בתשואה נמוכה של DNA, RNA או חלבון שלאחר מכן. השיטה המפורטת כאן מאפשרת כמויות קטנות של רקמת שריר מקור אחד לשימוש ביישומים מרובים, וההכללה של טחינה דקה cryosectioning ומחט משפר המגון מכנה תשואת RNA טובה.

Protocol

הנהלים כל חיה אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי חיים מוסדיים גאורגיה ועדת שימוש תחת A2013 פרוטוקול חיה שימוש 07-016 (בידל).

1. Cryopreservation של שרירי שלד מבולבלים

1. הכנה
   1. חותכים הפקק לריבועים קטנים (כ 1 ס"מ x 1 ס"מ) עם סכין גילוח, לכתוב על הפקק בטוש טיפ נאה כי הוא עמיד בפני 2-methylbutane לזהות את מקור העכבר שריר, ולעשות חתך רדוד מאוד (כ 1 מ"מ) על פני המשטח העליון. הכנס coverslip פלסטיק לתוך החתך להשתמש בשביל האוריינטציה הרקמה. חזור על פעולה עד פקק מוכן לכל רקמה להיות cryopreserved.
   2. השג חנקן נוזלי, 2-methylbutane, שרף הטבעה, מדחום טמפרטורה נמוכה, פקקים, כלי לנתיחה, ועכבר מחקר.
      זהירות: חנקן נוזלי הוא גז דחוס שעלולה להתפוצץ אם מחומם. לובש חלוק לבן, כפפות בטמפרטורה נמוכה, וגינת פן בעת ​​טיפול נוזלי nitrogen; במגע עם עור או עיניים עלולות לגרום לכוויות או כוויות קור. 2-Methylbutane היא בריאות, דליק, רעיל מפגע סביבתי. ללבוש ציוד מגן אישי (חלוקים מעבדה, כפפות, משקפי מגן), לפתוח את מכל המניות במנדף, להעביר את הסכום הקטן הדרושים הקפאה (בדרך כלל בין 200 ל- 400 מיליליטר) למכל נפרד שניתן סגור היטב, ולהימנע משאיפה .
   3. להרדים עכברים עם שיטה שאושרה של המתת חסד בהרדמה. בקצרה, הכנס את העכבר לתוך תא משאיפת עם isoflurane 2.5% חמצן מתוך מאדה isoflurane, להמתין עד 20 שניות לאחר העכבר מפסיק לזוז כדי לבדוק רפלקס הדוושה. כשהרפלקס הדוושה הוא שלילי, להרדים את עכבר המחקר שנערך על ידי נקע בצוואר רחם ^6.
      הערה: שיטות המתת חסד טעונה אישור ועדת האתיקה של המוסד הרפואי.
   4. סר עור שמעל hindlimb דיסטלי וחתך את הגידים הקדמיים דיסטלי בדיוק מעל הקרסול עם disse בסדר נקודותמספרי ction. אחוז גידים דיסטלי עם מלקחיים בסדר משוך בעדינות מעלה ולעבר הברך תוך צמצום fascia לרוחב כדי לשחרר את השרירים. משוך את השריר החוצה בניצב מהברך ולעשות חתך סופי שיחתוך את שריר ת"א ^7.
      הערה: שריר ת"א משמש כאן כדוגמא, אבל כל שרירי שלד עכבר או הלב יכולים להיות תחליף ת"א בפרוטוקול זה אם מתאים אל מטרות הניסוי של המשתמש. המגבלה היחידה היא כי רקמות חייבות להיות קטנות מספיק כדי להשיג cryopreservation המהירה לכל עומקו; גודל רקמות המרבי של ס"מ 1 ס"מ x 1 מומלץ.
   5. חזור על הפעולה ברגל הנגדית, לנתח את כל רקמות אחרות שתיגבינה. בצע דיסקציה מהר ככל האפשר להגביל שפלת רקמות לפני cryopreservation.
   6. אוריינט כל שריר סעיפים רוחביים על הפקק מראש שכותרתו שלה. סטנד השריר בניצב הפקק עם גיד דיסטלי נגיעת הפקק העליון של שלוחת השרירוכלה משם, ונתמך coverslip.
   7. Cryopreserve בכל הרקמות לניתוח היסטולוגית בהקדם האפשרי לאחר דיסקציה, רצוי תוך 5 דקות אבל בהחלט לא יותר מ -15 דקות זמן שחלף מאז euthanization של חית המקור.
2. cryopreservation
   1. בגין קירור באמבטיה cryopreservation חמש דקות לפני סוף הניתוח. יוצקים 2-methylbutane לתוך כוס מתכת פתוחה עד לעומק של כ 3 סנטימטר. יוצקי חנקן נוזלי לתוך מכל מבודד עד לעומק של 2 עד 4 סנטימטר. הגדר את המבחנה של 2-methylbutane לתוך החנקן הנוזלי; החנקן יתחיל לרתוח. הימנע מתיז חנקן לתוך כוס 2-methylbutane.
      זהירות: כן מקפיא אמבטיה במנדף או במקום מאוורר היטב.
   2. הכנס במד חום בטמפרטורה נמוכה לתוך-methylbutane 2 לניטור טמפרטורות ומערבבים לעתים קרובות עם מזלג כדי להבטיח קירור אפילו. ממשיכים לערבב ומצננים עד 2-ליthylbutane מגיע -140 ° C, הוספת חנקן נוזלי חדש לאמבטיה החיצונית לפי הצורך.
      הערה: מעלות צלזיוס -140 היא הטמפרטורה האופטימלית כדי למזער חפצי גביש קרח בשריר מפוספס; רקמות אחרות עשויות cryopreserve מיטב בטמפרטורות שונות (למשל, מוח, -90 ° C).
   3. החל שרף הטבעה רק 35 נמוך - 50% של השריר איפה זה פוגש את הפקק מיד ושחרר את הפקק לתוך 2-methylbutane ב -140 מעלות צלזיוס. במהירות לחזור עד 8 רקמות לכל אצווה הקפאה. מערבבים במשך 30 שניות, על תחתית של כוס על מנת להבטיח כי הרקמות לא להקפיא לתוך 2-methylbutane לחיזוק.
   4. בעזרת מזלג, מחוררת כף או מלקחיים גדולים למשוך לכל פקק רקמה מן-methylbutane 2. להסיר במהירות את coverslip, להספיג את 2-methylbutane עודף לתוך כוס, ואחר כך להפיל את הפקק רקמות לאמבטיה חנקן החיצוני. חזור לכל פקקים שנותרו בכוס.
   5. דגימות העברה בחנקן נוזלי או על קרח יבש-80 ° C במקפיא לאחסון.
   6. אם כל רקמות להישאר cryopreservation, חזור על שלבי 1.2.3 עד 1.2.4. מוסיף 2-methylbutane נוסף הכוס או חנקן נוזלי לאמבטיה החיצונית לפי צורך מחדש מגניבה -140 מעלות צלזיוס. השלך 2-methylbutane בשימוש כפסולת מסוכנת.

2. איסוף cryosections עבור יישומים היסטולוגיה ו- RNA

1. הכנה.
   1. טרום לשקול צינור autoclaved DNase / RNase ללא על איזון אנליטית. לאחר מכן, להעביר אותו לתוך תא cryostat כדי precool. חזור על הפעולה עד צינורות מוכנים עבור כל הדגימות cryosection ונקווה שייגבו.
   2. עבור חתך שרירי שלד, לאשר כי טמפרטורת cryostat הקאמרית היא -21 ל -22 מעלות צלזיוס על ידי תרמוסטט הפנימי שלה. להעביר כל מכולות עם רקמות להיחתך ההחדרה ולאפשר מיכל (ים) כדי לאזן את טמפרטורת cryostat במשך 15 דקות לפחות לפני הפתיחה.
   3. הכנס להב cryostat הפנויה חדש. לחילופין, להסיר את הלהב הקיים, לרסס עם פתרון טיהור RNase, לשטוף עם DDH ₂ O, והכנס לתוך cryostat להתקרר. תרסיס רקמות נקייה עם 70% אתנול ובזהירות לנגב את פלטפורמת clamping להב ולהב.
      1. תרסיס רקמות נקייה עם פתרון טיהור RNase ולנגב מברשות cryostat. תרסיס רקמה עם DDH ₂ O, לנגב את המברשות שוב ולהגדיר אותם בתא cryostat על משטח נקי.
         זהירות: להב cryostat צריך להיות מכוסה על ידי שומר הסכין כאשר אינו בשימוש. כמו כן, פתרון טיהור RNase רעיל יקפא לי לגבש המשקע בתא cryostat הקר. לכן, לטפל בזהירות ולהימנע השימוש בו בתא cryostat.
   4. בתוך חדר cryostat, מקום טיפה בגודל מטבע (כ 300 μl) של הטבעה שרפו על צ'אק דגימה חמים, להגדיר פקק רקמות על גבי השרף, לחץ כלפי מטה, ולאחר מכן להגדיר את צ'אק ב freezing רכבת או על אלמנט הקפאה מהר אם הוא זמין.
   5. לאחר מתמצק שרף ההטבעה (הלבנה), להוסיף שרף הטבעה נוסף על גבי הפקק, סביב% 35 התחתונים של הרקמות ולחץ על חולץ החום לתוך שרף ההטבעה להקפאה מהירה לייצב את הרקמה טובה יותר. המתן 5 דקות לפני חתך לאפשר שרף להתקשות לחלוטין.
   6. ודא מהדק הדגימה נמצא בעמדה שלה חזרה בו ביותר, הרחוקה ביותר מן הלהב. הכנס את צ'אק דגימת רקמות לתוך מהדק הדגימה.
2. הכנת cryosection.
   1. שחרר את בעל הספק הלהב, לקבוע את זווית האישור של הלהב 10 ° (או בזווית מתאימה המוביל הלהב בשימוש), מחדש להדק. שחרר את הבלם ולהפוך את ההגה ביד להנמיך את השריר לכיוון הלהב. לאמוד את המרחק הקרוב ביותר בין רקמות הלהב, ולאחר מכן להעביר את הרקמות מן הלהב להעסיק את בלם הגה ביד.
   2. שחרר את leve כוונון גובהr ולעבור מוביל הלהב קדימה או אחורה, בהתאמה, אם בסופו של הרקמה הוא יותר כ -2 מ"מ מן הלהב או אם להב מכת הרקמה. הדק ולהפחית את הרקמה שוב לבדוק מרחק בין הלהב. חזור על התאמות עד שהלהב 1 עד 2 מ"מ מהקצה של הרקמה על ידי הערכה חזותית.
   3. מנמיך את הרקמה כלפי הלהב ולהעריך זווית רקמת סעיפים רוחביים. נעל את ההגה ביד ולשחרר את ידית דגימה המהדקת. דחוף את מהדק הדגימה שמאלה או ימינה עד הכיוון האופקי של הרקמה הוא בניצב להב.
   4. דחוף את הדגימה מהדקת למעלה או למטה כדי לשנות את הכיוון "y" כך בסעיפי רקמות יהיו בניצב לציר הארוך של השריר. הדק את ידית מהדק הדגימה.
   5. השתמש כמובן ולהאכיל קדימה בסדר לקדם את הדגימה עד זה פשוט נוגע להב. אם מחפש קטעים מתוך עומק רקמה מסוים, לאפס את הסכום בעוביי סעיף לאפס (העליון של הרקמות).
   6. הגדר את cryostat אל בפונקציה Trim עם עובי סעיף 30 מיקרומטר. חותכים וזורקים סעיפים עד העומק שנבחר מראש לאיסוף רקמות הוא הגיע (למשל, 400 מיקרומטר מלמעלה).
3. אסוף cryosections להפקת RNA.
   1. פתח את הצינור עבור חלקי איסוף ולמקם אותו ליד ספק הלהב. השתמשו במברשת מראש מקורר, נקי להרים כל קטע כפי שהוא נחתך מהלהב ולהעביר את cryosection לתוך הצינור. חזור על פעולה עד בסעיפים ונקוו שוקלים 30 מ"ג או עומק הרקמות הרצוי הוא הגיע.
      הערה: עבור קדמי tibialis עכבר בוגר, גביית עומק רקמות של כ 400 עד 4,000 מיקרומטר בדרך כלל מניבת 25 - 40 מ"ג. בעזרת מלקחיים מתכת להעביר חלקים אל צינור איסוף אינו מומלץ כמו בסעיפים נוטים מקל גוש על משטח מתכת.
   2. אם הטבעת שרף המקיפה את השריר cryosection, לנעול את בלם היד ולהשתמש בסכין גילוח כדילגלח חתיכות קטנות של שרף עד שיש שכבה דקה רק סביב החלק העליון של השריר. תמיד לחתוך שרף עם הלהב בזווית אל השריר.
      הערה: שכבה דקה של הטבעת שרף לא מקשה על הכנת RNA במורד הזרם באופן משמעותי. אם שרף הטבעה עבה קיים, להשתמש במברשות כדי להקניט אותו הרחק שרירים לפני הזזת cryosection לתוך צינור איסוף.
   3. לחלופין, קטעי ברכה על מוביל הלהב והעברה בתפזורת צינור האיסוף.
      הערה: עם זאת, שיטה זו נוטה להיות איטי, וחתכים סיכויים טובים יותר מקל גוש ביחד, אשר יכול להפחית את היעילות של הומוגניזציה מחט צעדים מאוחר יותר.
   4. במקום צינור cryosection ונקווה במהירות לתוך משקל צינור איזון שיא אנליטי. מיד להחזיר את הצינור לתא cryostat קר כדי לשמור על טמפרטורת סעיף ליד -20 ° C. חשב את המשקל של חלקים נקווה.
      הערה: אם בידוד RNA יתרחש על מודעהifferent יום, לאחסן הצינור cryosection ונקווה ב -80 ° C עד השימוש.
4. אסוף cryosections עבור היסטולוגיה.
   1. לחץ על לחצן עובי סעיף חיצים חתך ושימוש בסדר לקבוע את עובי סעיף cryostat ל -7 מיקרומטר (או עובי סעיף מתאים אחר, בדרך כלל בין 6 ל -10 מיקרומטר).
      הערה: מדלל סעיפים (6 עד 10 מיקרומטר) אמורים לשמש ליישומים היסטולוגית כדי להבטיח כי ריאגנטים מכתימים יכול לחדור לעומק של קטע הרקמה. ניתן לקחת חלקים דקים מכל עומק במהלך cryosectioning, אבל חלקים עמוקים עדיפים בגלל הטבעת שרף, אשר מגדיל עם עומק רקמות, אינו פוגעת מכתים היסטולוגית.
   2. חותכים וזורקים 4 עד 7 סעיפים להשיג משטח רקמה עקבית, אפילו. רשום לעצמך את עומק הרקמה.
   3. חותכים מקטע לכוון אותו על פני השטח של המוביל להב. תרים את הקטע על ידי במהירות ובעדינות לגעת שקופיות מיקרוסקופ (בטמפרטורת חדר) חמותאל החלק שמדבר על מוביל הלהב. החזר את השקופית לטמפרטורת החדר. המשך עד מספר השקופיות רצויות מתקבל. רשום לעצמך את עומק הרקמות הסופי.
      הערה: גביית חלק שני (כפול) לכל רקמות מומלצת.
   4. עם חתך שלם, להעסיק את בלם הגה ביד, להחזיר את הדגימה לעמדה-רוב האחורית, והסר את צ'אק הרקמות. השתמש אלמנט החום cryostat כדי להמיס את שרף הטבעה מחזיק את הפקק רקמות על צ'אק הדגימה. סר פקק רקמות, לייבש עם רקמה, ולחזור אחסון.
   5. חזור משלב 2.1.2 עבור כל רקמה נותרת. אפשר שקופיות להתייבש במשך 20 דקות לאחר הרקמה האחרונה הוא רכובה. לאחר מכן, השתמש שקופיות עבור היסטולוגית או מכתים immunofluorescent או להקפיא ב -80 ° C בתיבת שקופיות עד הצורך.

בידוד RNA 3. מן משולב cryosections

1. מיצוי RNA
   1. צינור העברה (ים) של cryosections ונקווה לקרח. מיד להוסיףמגיב מיצוי RNA אורגני לפי יחס של כ מגיב 1 מ"ל לכל משקל 50 מ"ג cryosection, בדרך כלל 600 μl לכל צינור.
      זהירות: ריאגנטים בידוד RNA הם רעילים, מאכל, ומרגיז. בצע את ההוראות של היצרן עבור טיפול בטוח.
   2. באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 18 מד, לצייר למעלה נוזל מיצוי RNA ולשטוף את הקירות של הצינור עד שכל הרקמה מושעה בתמיסה. נסו לצמצם בועות אוויר במהלך המגון מחט.
   3. השתמש קצה המחט לכתוש ולפזר כל cryosections וחתיכות בכבדות דבקות צינור בקיר. Triturate כדי homogenize ידי העברת המדגם מעלה ומטה דרך המחט עבור חמש משיכות, ולאחר מכן להחזיר את המדגם לקרח. חזור על שני השלבים שלוש עד חמש פעמים, או כמספר הפעמים יש צורך לשבש את כל גושים ולהעביר המדגם בקלות דרך המחט.
   4. הסר את המחט 18 מד ולהחליף אותו עם מחט 22 מד. בזהירות triturate המדגם עבור חמש משיכות, ולאחר מכן להחזיר את המדגם לקרח. חזור על טחינה דקה שלוש עד ארבע פעמים כדי להשיג homogenate רקמות מפוזר מאוד דק.
      הערה: אם חלקיקי רקמות להתחיל לחסום את המחט בעת עריכת המדגם, לגרש את כל המדגם מן המזרק לחזור מחט 18 מד עבור המגון נוסף. צעד טחינה דק נוסף עם מחט מד 25 או 26 ניתן להוסיף להשיג תשואה מקסימלית. עם זאת, את המחט עלולה להיסתם כך קיים סיכון של שפיכת מדגם.
   5. הזז את המדגם מקרח לטמפרטורת החדר. דגירה במשך 5 דקות כדי לשבש קומפלקסים מולקולריים.
   6. במנדף קטר, להוסיף 0.1 מ"ל של 1-bromo-3-chloropentane (BCP) לכל 1 מ"ל של ריאגנט בידוד RNA בשימוש (שלב 3.1.1), בדרך כלל 60 μl לכל צינור. לנער את הצינור במרץ ביד במשך 15 שניות (לא מערבולת). דגירה מדגם בטמפרטורת החדר למשך 2 עד 3 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגות במשך 15 דקות ב XG 12,000 ו -4 מעלות צלזיוס.
      זְהִירוּת:
   7. בזהירות לאסוף את השלב מהימי העליון (צבע) RNA המכיל ולהעביר אותו צינור נקי. הוסף נפח שווה של 70% אתנול (במי DEPC) ו מערבולת לערבב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך עד 10 דקות.
      הערה: שלבי ביניים הבינוניים שלבי פנול BCP נמוכים יכולים להיות מעובד על דנ"א וחלבון גנומית, בהתאמה, על פי הוראות היצרן או שנאספו במכל פסולת מסוכנת פנול BCP לסילוק מתאים.
2. טיהור RNA.
   1. בצע את ההוראות של היצרן עבור מדגם מחייב, כביסה elution בשינויים קלים ^8. לדוגמה:
   2. הוסף aliquot של DNase / RNase ללא מים לתוך אמבט 37 ° C או החממה טרום חם צעד 3.2.4.
   3. מוסיפים את מדגם RNA מן 3.1.8 לעיל כדי טור טיהור צנטריפוגה מדגם במשך 15 שניותב XG 12,000 בטמפרטורת החדר. יוצקים את הזרימה דרך חזרה באותה עמודה מחדש צנטריפוגות. חזור פעם אחת נוספת על מנת למקסם RNA מחייב, ולאחר מכן למחוק את הזרימה הסופית עד וכולל.
   4. בצע שלבים לשטוף פי הוראות היצרן ^8. החל 700 μl של חיץ לשטוף (לא אתנול) לעמודה, ספין למשך 15 שניות ב XG 12,000, וזורקים את הזרימה דרך.
   5. הוסף 500 μl של חיץ לשטוף (עם אתנול) לעמודה, ספין למשך 15 שניות ב XG 12,000, וזורקים את הזרימה דרך. חזור על פעולה זו פעם אחת.
   6. ספין בעמודה הריקה דקות 1 ב XG 12,000 לייבש את הממברנה.
   7. מעבירים את הטור ספין על RNase- נקי, צינור ללא DNase. הוסף 40 μl של מים מחומם מראש DNase / RNase ללא (מ 3.2.1) למרכז הממברנה העמודה. בטמפרטורת החדר, דגירה במשך 2 דקות ולאחר מכן צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 12,000 x ז.
      הערה: נפח elution 40 μl הוא כ 1.3 μl לכל מ"ג המקורירקמה 30 מ"ג של cryosections נקווה. כוון את עוצמת הקול elution בהתאם משקולות רקמות התחלה שונות, אך לא להפחית להלן 32 μl. Elution שני, באמצעות כ 0.7 μl לכל מ"ג של רקמה מקורית, ניתן להוסיף כדי להגדיל את תשואת RNA מוחלטת.
   8. לנתח את הרנ"א (elution טור) לצורך ריכוז טוהר על ידי ספקטרופוטומטר, אלקטרופורזה, ו / או bioanalyzer. אחסן את RNA ב -80 ° C עד הצורך עבור יישומים במורד הזרם, כגון שעתוק לאחור עבור PCR ⁴ כמותית.
      הערה: טיפול DNase מומלץ לפני השימוש RNA ביישומים במורד הזרם. טיפול זה יכול להתבצע על כמה עמודות טיהור RNA לפני השלב לשטוף, בנקודה הספציפית הזו לאחר elution הטור, או על aliquot של RNA כצעד ראשון בכל יישום במורד הזרם. רנ"א צריך להיות יציב במשך כמה שנים.

4. ניתוח היסטולוגית ידי Immunofluorescent Staininגרם של cryosections שרירים

1. פרוטוקול immunofluorescence פשוט.
   1. השתמש בעט הידרופובי להקיף את קבוצת סעיפים על כל שקופית. בעדינות טיפת PBS לאזור בעיגול (כ 80 μl עבור שטח פנים קטן עד 500 μl עבור שטח פנים גדול), נזהרת שלא לגעת רקמות. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: אם אתה משתמש שקופיות קפוא, להסיר שקופיות -80 ° C במקפיא דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 דקות כדי להפשיר ויבש, ולאחר מכן להמשיך כנ"ל. לפחות שתי שקופיות נדרשות: שקופית ניסיוני אחד להיות וטופחה נוגדנים ראשוניים ומשניים; והחלק שליטה אחד שעבורו נוגדן ראשוני מוחרג, השליטה "משנית בלבד".
   2. עצת השקופית לשפוך את PBS. להוסיף חמור בדם 5% ב PBS (פתרון חסימה) לאזור הקיף; להיות זהיר על מנת להבטיח כי לא לייבש חלקי השריר. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות (או עד כמה שעות בתא לחות).
   3. כן פתרון נוגדן ראשוני לנתח התחדשות שריר. מערבבי פתרון לחסימה, עם נוגדן eMHC (01:40) ו נוגדן ColVI (1: 1,000). הכן כ 150 μl, 300 μl או 500 μl לארגונים קטנים, בינוניים, או באזורים שקופיות גדולות, בהתאמה. וורטקס למשך 5 שניות, ואז צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 15,000 XG כדי גלול כל משקע.
   4. עבור מגלשות ניסיון, להטות את השקופית לשפוך את חסימת פתרון ולאחר מכן להוסיף פתרון נוגדן ראשוני מ 4.1.3. עבור שקופית השליטה המשנית, להטות את השקופית לשפוך את חסימת פתרון ולאחר מכן להוסיף פתרון חסימה טרי (לא נוגדן). דגירת שקופיות בתא לחות על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: כאשר pipetting פתרונות נוגדנים על גבי שקופיות, תמיד למשוך נוזל מהחלק העליון של צינור פתרון נוגדן הראשוני, לא לשבש כל משקע בתחתית של התחתית.
   5. טיפ מחליק לשפוך את הפתרון. הוסף PBS dropwise לאזור בעיגול של כל שקופית לשטוף, טיפ לשפוךהנחה, ולאחר מכן להוסיף עוד PBS ו דגירה במשך 3 עד 5 דקות. חזור עבור סכום כולל של שלושה שוטף.
      שים לב: בפעם לשטוף היא גמישה למדי וניתן התארכה עד 20 דקות אם תרצה בכך. באופן כללי, מספר שינויי פתרון חשוב יותר מאשר בפעם.
   6. כן פתרון נוגדנים משני עבור כל השקופיות (כוללים שקופיות שליטה המשניות) באמצעות דילול 1: 500 של נוגדנים משני מצמידי fluorophore אדומים וירוקים לזהות IgG1 עכבר (eMHC) ו IgG ארנב (ColVI) ו -1: 10,000 דילול של גרעין DAPI כֶּתֶם.
      1. לדוגמה, לערבב 1 μl של DAPI עם 9 μl של DDH ₂ O לבצע דילול 1:10 של DAPI. לאחר מכן, במשך 500 נפח סופי μl, להוסיף 1.0 אנטי עכבר μl IgG1-אדום + 1.0 מיקרוליטר נגד ארנב IgG-ירוק + 0.5 μl של 1:10 DAPI כדי 447.5 μl של פתרון לחסימת. וורטקס לערבב צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 15,000 XG כדי גלול כל משקע.
         הערה: באופן אידיאלי, כל הנוגדנים משני צריכות להיות מאותו המין המארח.
   7. עצה השקופיות לשפוך את לשטוף PBS האחרון. הוסף פתרון נוגדנים משני כדי לכסות את כל הרקמות. מכסים את השקופיות כדי להגן עליהם מפני האור דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
      הערה: כל הנוגדנים משני צריכים להיות מאומתים יש תגובתיות צולבת מינימאלית עם מינים אחרים בניסויי תיוג כפולים.
   8. שטפו את השקופיות כמתואר 4.1.5. לאחר לשטוף האחרון, להטות את השקופית לשפוך את PBS ולהגדיר את השקופית על רקמה. הוסף 3 עד 4 טיפות של תקשורת הרכבה מימית לאורך צד אחד.
   9. הגדר את קצה coverslip זכוכית רק אל הקצה החיצוני של תקשורת ההרכבה. בעזרת מלקחיים, מנמיכים את coverslip באיטיות לכיוון רקמות, ולאחר מכן, שחרר את coverslip לטפוח בעדינות אותו למקומו. לבסוף, לחץ בעדינות בכל פינה של coverslip כדי לייצב אותו.
   10. הגנו על שקופיות אור ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש.
       הערה: עבור אחסון לטווח ארוך, למרוח שכבה דקה של לק בשולי הcoverslip דואר כדי לעזור למנוע את השקופית מפני התייבשות.
2. הערכה היסטולוגית.
   1. תמונה שקופיות באמצעות epifluorescent או confocal עם מסננים מתאימים לזהות eMHC (אדום); ColVI (ירוק); וגרעינים מוכתמים DAPI (כחול), בדרך כלל באמצעות 20X ^1,5 אובייקטיבי.
   2. ודא את אות הניאון מ מגלשות ניסיוני שונה משקופית שליטה המשנית להפגין את הספציפיות של זיהוי eMHC ו ColVI ^4.
      הערה: סיבי התחדשות חיוביים eMHC צריכים להיות גלויים מכ 2 עד 7 ימים לאחר פציעת שרירי variably בעכברים עם ניוון שרירים. קולגן VI שוהה תאים מטריקס סביב סיבי שריר, כלי דם ומערכת עצבים ובסופו של חבילות רקמת חיבור הגדולות של peri- ו epimysium. DAPI גרעיני כתם שימושי כדי לזהות סיבי שריר עם גרעינים מרכזיים לעומת גרעינים היקפיים המציין התחדשות סיבים, ואת הנוכחות של infiltrating תאים. סיבי נימקים או פצועים עלולים להכתים חלש עם הנוגדנים משני העכבר IgG בשל זיהוי של IgG אנדוגני חודרת הסיבים דרך ממברנות שרירים פגומות.
   3. כדי לכמת התחדשות, לצלם מיקרוסקופ חופפים עם כל מסנן פלורסנט פני התמונה כולה. מזג את eMHC, תמונות ColVI ו DAPI עבור כל מיקום ולאחר מכן יישר את התמונות לשחזר מפה של הקטע השלם ^1,5.
   4. באמצעות תוכנת ניתוח, לספור את המספר סיבי חיובי eMHC ואת המספר סיבי הכוללים לחשב ההתחדשות אחרונה (100 * (# eMHC + סיבים / סיבים הכוללים #)). כמו כן, לספור את המספר סיבי גרעיני מרכזי מתוך הסיבים הכוללים למדוד התחדשות פני תקופה ארוכה יותר (100 * (# CN + סיבים / סיבים הכוללים #)) ^1,5.

Representative Results

RNA השרירים cryosection הוא באיכות גבוהה ומספק תשואה מספיק עבור מרבית היישומים

ניתוח של שש עשר הכנות RNA שרירי שלד מוצג בלוח 1 באמצעות 19.4 כדי 41 מ"ג קדמי tibialis נקווה (ת"א) שריר מ 8 עכברים שליטים. עזוב שניהם (L) וימין (R) שרירי ת"א נערכו ניסויי התחדשות עם שרירים שנאספו 3 ימים לאחר זריקה תוך שרירית אורך של 25 μl של תמיסת מלח או 10 מיקרומטר cardiotoxin לגרום לפגיעה בשרירים בשיטות שדווחו בעבר ^1. כפי שניתן לראות בטבלה 1, יחסי A260 / 280 עבור RNA cryosection שרירים הם בדרך כלל קרוב ל -2 ומעלה מדגמים מייצגים אלה. כפי RNA "טהור" נחשב לבעל A260 / 280 של 2.0 A260 / 280 של 1.8 עד 2.2, את הטוהר של דגימות רנ"א cryosection מצוין ^9. התאוששות RNA סה"כ הייתה בדרך כלל אובהr 10 מיקרוגרם לדגימה עם תשואות של 0.18 ליותר מ 1 מיקרוגרם של רנ"א הכולל לכל מ"ג החל רקמות, מתן חומר מספיק עבור מרבית היישומים במורד הזרם. יש לציין, ריכוז RNA, RNA סך שחולצו, ואת התשואה RNA לפי מ"ג של רקמה מתחיל מהשרירים ת"א 3 ימים לאחר רעלן פציעה היה גבוה משמעותית מאשר TAS-מוזרק מלוחים. זה מצביע על כך שיש שיפור המגון כאשר מבנה השרירים מופרת על ידי פגיעה נרחבת ו / או כי קיים גידול שעתוק הגנים ו / או יציבות RNA בשריר התחדשות 3 ימים. ההתמדה של איכות RNA הוערכה על ידי TAE 1x פשוט / 1.5% ג'ל אלקטרופורזה agarose של 1 μl של רנ"א cryosection השריר לאחר הדגימות אוחסנו ב -20 מעלות צלזיוס למשך 18 חודשים. 18S הבולטים 28S rRNA להקות עדיין ניכר בדגימות הוכחת איכות RNA גבוהה, גם בתנאי אחסון לא טובים (איור 1 א).

שרירים cryosection RNAתומך ביישומים במורד זרם

אחת מיקרוגרם של RNA לדגימה cryosection ונקווה טופלה DNase הפוכה עיבד מ- פריימרים dT אוליגו. בעקבות טיפול RNase, את הנפח הכולל של ההפוכה עבדה cDNA היה 30 μl. PCR שאינו כמותיים פשוט עם הגברה עודפת נדרס כדי לאשר את הכדאיות של cDNA. גורם 4 רגולטוריות myogenic (Mrf4), גורם שעתוק שהוגברו עם בידול השריר, היה מוגבר באמצעות פריימרים העכבר שדווח בעבר, לחוש 5'-CTACATTGAGCGTCTACAGGACC ו antisense 5'-CTGAAGACTGCTGGAGGCTG ^10, מ 2 μl של תבנית באמצעות תקן ה- PCR. היה הגברה חזקה, ספציפית של שבר 234 נ"ב Mrf4 משני שמאל וימין דגימות cDNA ת"א, אך לא RT- (RNA כלול, אבל לא transcriptase הפוכה), RT DDH ₂ O (שעתוק לאחור ללא תבנית RNA), או DDH ₂ O שולטת PCR (איור 1B). אותו הדגימות נוהלו בשלושה עותקים לבקרת התייחסות Mrf4 ו mOaz1 ⁴ כימות באמצעות הגברה ביחס והתייחסות קרינה פסיבית על מערכת ה- PCR בזמן אמת. Mrf4 התבטאה 0.097 פי במדד ת"א הימנית מוזרק רעלן לעומת ת"א השמאל-מוזרק המלוחה, מחושבת לפי שיטת ΔΔCt ^4. זה דומה לדיווחים קודמים של ביטוי נמוך Mrf4 3 ימים לאחר פציעת רעלן עקב אובדן של סיבי שריר בוגרים ^11. כדי להשוות את העקביות של RNAs cryosection עבור PCR כמותי, ערכי ה- CT הושוו עבור הגן התייחסות mOaz1. מתוך שש דגימות, תמליל mOaz1 זוהה עם Ct הממוצע של 17.242 ± 1.483 SD, לעומת ממוצע ה- CT היה 36.332 ± 3.61 SD בדגימות שליטה RT- (n = 4). את הקבצה ההדוק של אותות ה- CT mOaz1 ברחבי דגימות עולה כי RNA שבודד cryosections שריר ת"א מבצע כצפוי בביטוי RNA במורד זרם המנתח.

לשמור-together.within-page = "1"> הערכת היסטולוגית של cryosections הסמוך.

דוגמאות מכתימות immunofluorescence העקיף של 7 מיקרומטר חלקי שריר קדמיים tibialis מעכברי שליטה להמלטה 3 ימים לאחר הזרקת רעלן מוצגות לזהות סיבי התחדשות (איור 2). שני הסעיפים נאספו שריר פחות מ -150 מיקרומטר מהאזור לשמש לניתוח RNA בעומק של 4.5 עד 4.6 מ"מ מפני שטח השריר הפרוקסימלי. שרשרת כבדת שרירן עוברי (eMHC, אדום) מזהה סיבי התחדשות שלהם, VI קולגן (ColVI, ירוק) מתאר את סיבי השריר, וכתמי DAPI גרעינים כחולים, על פי פרוטוקול 4. אזורים עם חודרים לתוך גרעין מרוכזים (אות כחולה) מצביעים באתרים של פציעת רעלן כפי שבא לידי ביטוי על ידי הפעלת תאי שריר חיובי חדשה eMHC התחדשות. קטע שלם מפות כמו בדוגמא זו משמשות כימות של התחדשות על ידי חישוב שיעור embryoniשרשרת להביע כבד ג שרירן סיבים (אדום, מחדש לאחרונה) או סיבים בעלי הגרעין מרכזי כפי שדווח ¹ בעבר. יש לציין, יש נזק קטן באופן מפתיע בשריר ת"א באיור 2A. אמנם יש וריאציה בין זריקות, זריקות רעלן טיפוסי להשפיע חלק הרבה יותר גדול של תא שריר ^1, כפי שמוצג באיור 2B. לכן, ניתוח היסטולוגית זה מצביע על כך פציעת רעלן באיור 2A הייתה מינימאלית מספק לנו כלי חשוב לפרש נתוני ביטוי גנים מן מדגם RNA cryosection השריר הרציף. אם השריר כולו היה בשימוש במשך הכנת RNA על ידי שיטות טחינה רגילות, באזור הפגיעה הקטן מהצפוי של מדגם זה יעשה את זה נתון חריג כי היה להטות ניתוחים במורד זרם. במקום זאת, זיווג כימות היסטולוגית מאותו השריר מאפשר מדידה ישירה של מידת הפגיעה ממקטעים סמוכים. זה מאפשר את השימוש של incluקריטריונים שיאון / הדרה על מנת להבטיח כי כל הדגימות כללו ב RNA במורד הזרם מנתח לעמוד בסף פגיעה מינימלית או נורמליזציה של RNA ניתוחי פי גודל הפגיעה.

איור 1: איכות הערכת RNA מן משולב שרירים cryosections. א) 18S ו -28 להקות RNA ריבוזומלי בולטות RNA מן cryosections שריר ונקווה 18 חודשים לאחר הכנת RNA. B) ללא PCR כמותי עבור Mrf4 הבאים שעתוק לאחור. 200 ו -300 להקות נ"ב סולם הדנ"א מסומנים. RT-, הפוך תגובת שעתוק עם תבנית RNA אבל לא transcriptase הפוכה. RT-H ₂ O, שעתוק לאחור עם DDH ₂ O, אין תבנית RNA. H ₂ O, אין שליטת תבנית PCR עם DDH ₂ O. בניסויים אלו, רעלן הוזרק קדמי tibialis התקין (RTA) ו ווה המלוחהים מוזרק השמאל (LTA). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: בואו לטעום היסטולוגית מפות שריר התחדשות מחקרים. A, B) מפות מלוקטות סעיפי שריר שוקה קדמי 3 ימים לאחר זריקות של רעל הצגת דוגמאות של עניים (א) ו רגילה (ב) פגיעת נגרמת הרעלן. אזורים התאגרפו לבנים של כל מפת סעיף מוצגים כתמונות הבלעה לצפייה בהגדלה גבוהה, אדום, שרירן עוברי שרשרת כבדה; VI ירוק, קולגן מטריקס חלבון; כתם כחול, DAPI גרעיני. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1: נציג RNA תשואה ומדידות טוהר מן cryosections שרירים נקווה. Sixteen הקדמי tibialis (ת"א) שרירים היו מחולקים ודוגמאות cryosection ויקוו עובדו עבור RNA. RNA המטוהר (1 μl) נותח עם nanospectrophotometer. סטטיסטיקת טור בוצעה בגיליון אלקטרוני, השוואות קבוצה בוצעו באמצעות תוכנה סטטיסטית.

Discussion

כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר עם שיטה זו, לשמור הטבעת השרף המוגבל לנמוך השליש או המחצית של השריר במהלך cryopreservation רקמות בגלל שרף עודף יאט את האוסף של cryosections ונקווה ועלול להגדיל הטבעת זיהום שרף בידוד RNA. כמו כן, תשומת לב קפדנית במהלך המגון מחט חשוב למקסם את התשואה ולהקטין את ההסתברות של סתימת המחט. הפרוטוקול ניתן לשנות באמצעות מזרק Luer-Lok כדי להגן מפני אובדן מדגם אם המחט נחסמה ודורשת בלחץ גבוה כדי לסלק את המחסום. צעד המגון מחט נוסף עם מחט מד 25 או 26 ניתן גם להוסיף לייצר השעית רקמה עדינה נוסף משופרת תשואת RNA. בעוד כלורופורם שאפשר להחליף BCP, זה אינו מומלץ, כיוון BCP הוא פחות רעיל ותוצאות ברמות נמוכות של זיהום הדנ"א הגנומי בשלב המימי במהלך חילוץ אורגני של RNA ^12. גָדֵלעובי סעיף cryosections ונקווה למעלה מ -30 מיקרומטר גם אינו מומלץ כמו המגון יהיה פחות יעיל.

אם תשואת RNA היא מתחת לרמות רצויות, אסטרטגיות שונות עשויים להיות מועסקות על מנת להגדיל את ההתאוששות כגון: i) להגדיל את כמות מיליגרם של חומר המוצא כדי להגדיל את תשואה אפשרית; ii) להפחית את עובי סעיף מתחת ל -30 מיקרומטר לשפר המגון מכני של רקמות; iii) להגדיל את משך הזמן של דגירת מדגם ויצירת הומוגניות מחט מגיב מיצוי האורגני לשפר הפרעה מכאנית ורקמות כימיות; ו- IV) אם גושי רקמה להישאר, לבצע צעד חילוץ שני עם המגון מחט קפדני יותר. לחלופין, ייתכן שיש שיקולים ספציפי רקמות, כגון צעדי הפרדה ומשקעים שלב נוספים עבור דוגמאות עם תוכן proteoglycan גבוה ^13. במהלך הטיהור בעמודת RNA, נפח elution גדול יכול לשמש וביצוע elution שני יכול maximize התאוששות רנ"א הכל, אבל על חשבון ריכוז RNA. משקעים אלכוהול שלאחר עמודה ניתן להשתמש לרכז את RNA אם ריכוז נמוך היא דאגה עם שינוי זה. אם שפלת RNA היא בעיה, צמצום זמן cryopreservation במהלך לנתיחה, ניקוי קפדני יותר של משטחי cryostat וכלים כדי למזער את חשיפת RNase, שיבצע את פעולת המגון מחט בחדר קר, תוספת של מגיב מעכב RNase אל cryosections ^14, ותכופות החלפת פתרונות חינם RNase יכול כל לעזור למנוע או למזער את החשיפה RNases ולהפחית פעילות המחשוף. יתכן רחיצת הרקמה בקצרה מגיב מעכב RNase לאחר דיסקציה, אבל לפני cryopreservation, עשוי לצמצם עוד שפלה מדגמת. עם זאת, ניסויים ראשוניים צריכים להתבצע על מנת להבטיח כי כל טיפול כזה אינו מעלה גבישי קרח או חפצים אחרים בזמן cryopreservation.

בעוד עובריimmunofluorescence עקיפה שרשרת כבדה שרירן / קולגן VI משמש כאן כדוגמה לניתוח השריר של פציעה, cryosections דק רכוב על שקופיות מיקרוסקופ מניסויים אלה יכולים לשמש לכל כתם היסטולוגית רלוונטי שיכול להתנהל על חלקים קפואים, כולל טכניקות immunofluorescent עם הפוסט -fixation מכתים hematoxylin / eosin. ואכן, עיבודים לפרוטוקול immunofluorescent פשוט הניתן כאן עשויים להיות נחוצים. לדוגמא, נוגדנים משני אנטי עכבר המשמשים לאיתור נוגדן עכבר עיקרי (למשל, eMHC) עלול גם לזהות נוגדני עכבר אנדוגני ברקמות היעד. נוגדנים אנדוגני כאלה בדרך כלל מצטברים סיבי שריר פגועים או נמקי בשריר הפגוע או דיסטרופי גרימת מכתים immunofluorescent ברקע. שקופית מלאה משני (עם נוגדן ראשוני מושמט) יש לבחון תמיד להעריך את הספציפיות של מכתים. אם רקע נוגדן אנדוגני הוא בעייתי, צעדים מראש לחסום צריכים להיותצורף לפרוטוקול למנוע או למזער זיהוי של נוגדני עכבר אנדוגני ^15.

המגבלות העיקריות של השיטה הן כי זה דורש cryostat וזה גוזל זמן מה שהופך אותו תפוקה נמוכה יחסית. לדוגמא, מומחה הטכניקה היה מסוגל לעבד עד 16 שרירים במשך cryosections ויקווה ושקופיות מיקרוסקופ (8 מגלשות סעיפים כפולים של כל 16 הרקמות) בכ -9 ל -10 שעות. עבור טירונים Cryosectioning, אוסף של cryosections ונקווה מ 2 עד 4 דגימות יכול להיות משתלטים סביר לאחר האימון cryostat ואחד או שניים תרגולים, במקום, cryosections איכות קבלת היסטולוגיה לקח יותר ניסיון. לכן, ציוד, זמן, או גורמי אימון עשויים להפוך שיטה זו פחות שימושית עבור רקמות רכות, כי יכול להיות גם הומוגני עם homogenizer עלי ידני.

לשם השוואה עם שיטות המגון הלא cryostat, הכנה RNA מפוספס שרירהים דווח ביופסיות שריר עם תשואות RNA של 0.05 כדי 0.7 מיקרוגרם RNA מ"ג מראש של שרירים ^16, ולאחרונה 0.27 כדי 1.08 מיקרוגרם RNA לפי מ"ג של שרירים ^17. לכן, הטכניקה המתוארת כאן מספקת תשואות RNA טובות כמו או טובות יותר מאשר בשיטות שאינן cryostat עם יתרון נוסף המאפשרת היסטולוגית לזווג מנתח מאזור רציף של המדגם הזהה. יש לציין, מחקר קודם גם בשימוש Cryosectioning עבור המגון ברקמות השדרה ומצא דומה כי רקמת Cryosectioning משופרת יעילות הומוגניות עבור בידוד RNA ^13. כאשר טכניקה זו נוסתה בדגימות שרירי שלד שור, תשואת RNA הממוצעת הכנת מדגם הייתה 4.09 ± 0.36 מיקרוגרם, בקצה הנמוך של הטווח הנורמלי דיווח כאן ^13. microdissection ללכוד לייזר הוא אלטרנטיבה אחרת לאיסוף רקמות להפקת RNA מתוך cryosection. לכידת לייזר עדיפה על השיטה cryosection ונקווה זהבכך שהיא מאפשרת את הספציפיות לאסוף קבוצת משנה הרצויה רק של תאים מהמדור וניתן לבצעו אותו על קטע רקמה יחיד עד 50 מיקרומטר ¹⁸ עבה. עם זאת, אוסף של מדגם מיקרו גזור יכול להיות ציוד קשה ומתאים אינו זמין נרחב, מה שהופך המגון cryosection נקווה לנגיש יותר לחוקרים. כאשר שני השיטות זמינות, העדפה לנתח תת-אזור רקמות עבור יישום צורך כמויות RNA קטנים רק יעדיף microdissection ללכוד ליזר תוך המגון cryosection ייקווה הוא טוב ביותר כאשר ניתוח משנה האזור הוא פחות חשוב וכמויות גבוהות של RNA נדרשות.

בעוד שיטות בידוד היסטולוגית ו- RNA הם מוקד כאן, השיטה cryosection נקווה מותאם בקלות להכין lysates חלבון כתם המערבי מנתח או מדידות פעילות האנזים. לדוגמה, cryosections ונקווה מהלב היו solubilized עבור כתם המערבי מנתח ⁴nd ונקווה cryosections מן ת"א היו הומוגני עבור מבחני פעילות dehydrogenase succinate של המיטוכונדריה פונקציה ^5. לחלופין, שברי דנ"א וחלבון גנומי ניתן להפריד בשלבים אחרים במהלך החילוץ האורגני לאחר בידוד RNA, מציע את הפוטנציאל להפיק DNA גנומי, חלבון, RNA, ומדידות היסטולוגית מתוך רקמת יחיד לאחר פגישת cryostat יחידה.

בסך הכל, היתרון העיקרי של שיטה זו הוא להגדיל גמישות ניסיון, בכך שהיא מאפשרת גישות אנליטיות מרובות הדורש הכנת מדגם שונה רקמה אחת. השיטה היא מתאימה ביותר עבור שריר ורקמות אחרות עם תוך נרחב או מבנה תאי המפחית את היעילות של הומוגניזציה רקמות מבוססת עלי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cork	VWR Scientific	23420-708	Cut into small squares with a sharp blade.
Plastic coverslip	Fisher Scientific	12-547	Used to orient the muscle during freezing.
Low temperature thermometer	VWR Scientific	89370-158
2-methylbutane	Sigma	M32631-4L	Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet.
Embedding resin: "cryomatrix"	Thermo Fisher Scientific	6769006	Other embedding resins can be substituted for cryomatrix.
Cryostat	Thermo Fisher Scientific	microm HM550 with disposable blade carrier	Any working cryostat should be sufficient for the protocol.
Disposable cryostat blade	Thermo Fisher Scientific	3052835	Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used.
RNAse decontamination solution: "RNase Zap"	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Analytical balance	Mettler Toledo	XS64
Paint brush	Daler Rowney	214900920	Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies.
Razor blade	VWR Scientific	55411-050
Microscope slide	VWR Scientific	48311600
RNA organic extraction reagent: TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026	Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle.
18 gauge needle	VWR Scientific	BD305185
22 gauge needle	VWR Scientific	BD305155
26 gauge needle	VWR Scientific	BD305115	Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol.
1 ml syringe	VWR Scientific	BD309659	For very high value samples, a Luer-Lok syringe is recommended (e.g., VWR BD309628).
1-bromo-3-chloropentane (BCP)	Sigma	B9673
For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol	Decon Laboratories, Inc.	+M18027161M	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.
For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9922	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.
RNA purification kit: PureLink RNA minikit	Thermo Fisher Scientific	12183018A	Final steps of RNA preparation.
DNase/Rnase-free water	Gibco	10977	DEPC-treated water can also be used.
Spectrophotometer: Nanodrop 2000	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	AM2222	Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications.
Hydrophobic pen	Thermo Fisher Scientific	8899
Dulbecco's PBS	Gibco	14190	PBS for immunofluorescence protocol.
Donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc	017-000-121	Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence.  Normal goat serum can also be used.
eMHC antibody	University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank	F1.652
Collagen VI antibody	Fitzgerald Industries	#70R-CR009x
Donkey anti-rabbit AlexaFluor488	Thermo Fisher Scientific	A21206
Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546	Thermo Fisher Scientific	A21123
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Aqueous mounting media: Permafluor	Thermo Fisher Scientific	TA-030-FM	Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties.
Glass coverslip	VWR Scientific	16004-314	Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl
Image analysis software: ImageProExpress	Media Cybernetics, Inc.	Image-Pro Express, or more advanced products	Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process; e.g., ImageProPremier.
Merge and map section images: Photoshop	Adobe	Photoshop
Cardiotoxin	Sigma	C9659	Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated.
reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system	Thermo Fisher Scientific	18080051	Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used.
Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system	Promega	M8298	Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead.
SYBR green	Thermo Fisher Scientific	S7585	For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers.
ROX: SuperROX, 15 mM	BioResearch Technologies, Inc. Novato CA	SR-1000-10	SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments
Real-time PCR	Applied Biosystems	7900HT