Summary
Ardışık kriyo-bölümleri tek bir fare iskelet kası, bitişik bölgeleri kullanılarak gen ekspresyonu ölçümleri için histolojik uygulamalar ve RNA zenginleştirme sağlamak için toplanır. doğrudan uygulamalar arasında karşılaştırılmıştır toplanmış cryosections ve ölçümlerin 30 mg - Yüksek kaliteli RNA 20 elde edilir.
Abstract
Bu yöntem ile, birbirini takip eden cryosections tek bir fare iskelet kası, bitişik bölgeleri kullanılarak gen ifadesi için doku histolojisi ve RNA zenginleştirilmesi için, her iki mikroskop uygulamaları sağlamak için toplanır. Tipik olarak, tampon hacimleri verimli taşlama uygulamaları için çok düşük olabilir, çünkü henüz yeterli mekanik kesinti olmadan, küçük iskelet kas örneklerinin yeterli homojenizasyonu sağlamak için zorlu, tampon reaktif kas sınırları penetrasyon yoğun doku mimarisi, sonuçta düşük RNA verim neden olur. Burada bildirilen protokolü takip ederek, 30 mikron kesitler toplanır ve tampon penetrasyonu maruz yüzey alanını arttırarak, krio-bölümleme ve sonraki iğne homojenizasyon kas bozabilir mekanik izin toplanmış. tekniğin başlıca kısıtlamaları bir kriyostat gerektirir, ve nispeten düşük bir kapasiteye sahip olmasıdır. Bununla birlikte, yüksek-kalitede RNA toplanmış m küçük örnekler elde edilebiliruscle cryosections, birçok farklı iskelet kaslarında ve diğer dokular için bu yöntem erişilebilir hale getirmek. Ayrıca bu teknik eşleşti sağlayan analizler (örneğin, doku histopatolojik ve gen ifadesi) ölçümleri doğrudan deneysel belirsizliği azaltmak ve küçük bir doku kaynak için gerekli replikatif hayvan deneyleri azaltmak için uygulamalar arasında mukayese edilebilir, böylece tek bir iskelet kası komşu bölgelerden birden çok uygulama.
Introduction
Bu tekniğin amacı, tek bir küçük iskelet kası kaynak dokusundan erişilebilir gibi histoloji ve gen ifadesi olarak farklı modaliteleri, birden fazla deneysel analiz yapmaktır. Mikroskopi uygulamaları dikkatle dondurulması sırasında buz kristali eserler oluşumunu sınırlamak için kontrol edilmelidir koruma yöntemleri, örnek en duyarlıdır. Böylece, yöntem geliştirme tibialis anterior dayanmaktadır (TA) kas kısmen immünfloresan mikroskopi ve gen ifadesi hem analizleri için kaynak materyal olarak -140 ° C sıvı nitrojen soğutmalı 2-metilbütan banyosunda reçine gömme ile kaplı dondurulmuş.
çeşitli teknik yaklaşımlar için aynı kaynak materyal kullanma ihtiyacı sol ve sağ kaslar farklı koşullar, deneysel ve tek kontrol temsil eden kas içi enjeksiyon tabanlı deneyler için özellikle önemlidir. Örneğin, kas yenilenmesi çalışmalarında, tek bir muSistemik lupus karşı kas aracı ile enjekte edilmiş kontrol 1 olarak hizmet ederken yaygın doku hasarına neden olmak için, bir toksin ile enjekte edilir. Benzer bir şekilde, kas Gen tedavisi yapılan çalışmalarda genellikle karşı tarafa 2 boş vektör olmayan vektör veya taşıyıcı kontrol ile karşılaştırıldığında gereken kas içine enjeksiyon ile gen terapi vektörünün doğrulama ile başlar. Nedenle, farklı bir uygulama için her bir ta kas kaynak yapmak mümkün değildir.
Bu konu ile ilgili ortak stratejiler şunlardır: i) ii) Ek fareler kullanmak, veya iii) her uygulama için kas bir parça kesmek için, her uygulama için farklı bir kas grubunu kullanmak için. Ancak, kas grupları arasında önemli farklılıklar zor ayrı uygulamalardan verileri karşılaştırmak için yapmak ve ek hayvanlar gider artırmak ve diğer alternatifler varsa kötü haklı. farklı uygulamalar kaynak diseksiyonu sonrası kas bölme en iyi seçenek in birçok durumda. Bununla birlikte, kas parçalar genellikle homojenleştirme 2-5 için sıvı azot ya da mekanik öğütme teknikleri altında toz haline kullanmak için çok küçüktür. kas hücre dışı matris ve kontraktil proteinlerin ile kaplı olan bir yüksek yapısal doku gibi, yetersiz mekanik homojenleştirme daha sonra, DNA, RNA ya da protein düşük verime yol açar. Burada açıklanan yöntem çoklu uygulamalarda kullanılacak bir kaynak kas dokusunun küçük miktarlarda sağlar ve krio-bölümleme ve iğne toz haline dahil iyi RNA verimi için mekanik homojenizasyon artırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri hayvan kullanımı protokol A2013 07-016 (Beedle) kapsamında Gürcistan Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
Sabitlenmemiş İskelet Kası 1. Kryoprezervasyon
- Hazırlık
- Yaklaşık (küçük kareler bir jilet ile (yaklaşık 1 cm x 1 cm) içine mantar kesti kaynak fare ve kas belirlemek ve bir çok sığ kesim yapmak için 2-metilbütan dayanıklı bir ince uçlu işaretleyici ile mantar yazmak üst yüzeyi boyunca 1 mm). doku yönlendirmek için kullanılacak kesim içine plastik bir lamel yerleştirin. Her doku dondurularak saklanmasına yönelik bir mantar hazır olana kadar tekrarlayın.
- sıvı azot, 2-bromür, gömme reçine, düşük sıcaklık termometre, mantarlar, diseksiyon araçları ve çalışma fare alın.
DİKKAT: Sıvı azot ısındığında patlayabilir sıkıştırılmış bir gazdır. ni sıvı işlerken bir laboratuvar önlüğü, düşük sıcaklık eldiven ve yüz koruyucu giyinTrogen; deri ile temas ya da gözleri yanıklara veya donmalara neden olabilir. 2-Metilbütan yanıcı, toksik, sağlık ve çevresel tehlike. , Kişisel koruyucu donanım (laboratuvar önlüğü, eldiven, koruyucu gözlük) giyin davlumbaz stok kabı açın, sıkıca kapatılmış ayrı bir kaba (genellikle 200 ile 400 ml) dondurma için gereken küçük bir miktar aktarabilir ve solumaktan kaçının . - anestezi altında ötenazi onaylanmış bir yöntem ile fareler Euthanize. Kısaca, bir izofluran buharlaştırıcı gelen oksijen% 2.5 izofluran ile bir inhalasyon odasına fare takın, fare sonra 20 sn pedal refleks kontrol etmek için durana kadar bekleyin. Pedal refleks negatif olduğunda, servikal dislokasyon 6 ile çalışma fare euthanize.
NOT: Ötanazi yöntemler kurumsal etik komitesi tarafından onayı gerekiyor. - Cildi uzak hindlimb örten çıkarın ve sadece iyi nokta disse ile ayak bileği üstünde uzak ön tendonları kesmekction makas. ince forseps ile distal tendon kavrayın ve kas serbest bırakmak için yanal fasya kesim hafifçe yukarı çekin ve diz doğru. Diz dik kas çekin ve TA kas 7 tüketim için son bir kesim yapmak.
NOT: TA kas burada örnek olarak kullanılır, ancak kullanıcının deneysel hedeflerine uygun olduğu takdirde herhangi bir fare iskelet kası ya da kalp Bu protokolde TA için ikame edilebilir. Tek sınırlama doku derinliği boyunca hızlı kriyopreservasyona elde etmek için yeterince küçük olmasıdır; 1 cm x 1 cm maksimum doku boyutu önerilir. - ters bacak tekrarlayın ve tahsil edilecek herhangi bir diğer dokulara teşrih. Dondurmadan önce doku bozulmasını sınırlamak için mümkün olduğunca çabuk diseksiyon.
- Orient öncesi etiketli mantar üzerinde enine kesitler için her kas. mantar ve kas ext üst dokunmadan uzak tendon ile mantar için kas dik durmakuzakta biten lamel ile dik tuttu.
- tercihen kaynak hayvanın euthanization bu yana geçen 5 dakika ama kesinlikle fazla 15 dakika süre içinde, diseksiyonu sonrası en kısa sürede histolojik analiz için tüm dokuları cryopreserve.
- Kriyoprezervasyon
- Diseksiyon bitmeden dondurma Hamamı beş dakika soğutma başlayın. yaklaşık 3 cm derinliğe kadar açık bir metal kap içine 2-metilbütan dökün. 2 ila 4 cm bir derinliğe kadar yalıtılmış bir kap içine sıvı azot dökün. sıvı azot içine 2-metilbütan bir beher ayarlayın; azot kaynamaya başlayacaktır. 2-metilbütan behere azot sıçramasını önlemek.
DİKKAT: Davlumbaz veya iyi havalandırılan bir alanda banyo dondurma hazırlayın. - sıcaklığını izlemek ve soğutma da emin olmak için bir çatal ile sık sık karıştırılmıştır 2-metilbütan bir düşük sıcaklık termometresi yerleştirin. karıştırmaya devam edin ve soğuyana kadar 2-methylbutane gerekli dış banyo yeni sıvı azot ekleyerek, -140 ° C ulaşır.
Not: 140 ° C, çizgili kas, buz kristali eserler en aza indirmek için optimum sıcaklık olan; diğer dokular, farklı ısılarda en cryopreserve (örneğin, beyin, -90 ° C). - o mantar karşılar ve hemen -140 ° C'de 2-metilbütana içine mantar açılan kas% 50 - sadece alt 35 gömme reçine uygulayın. Hızla dondurma parti başına en fazla 8 dokular için tekrarlayın. dokular katılaşan 2-metilbütan içine donma yok sağlamak için kabın alt kazıma 30 saniye boyunca karıştırılır.
- Bir çatal kullanın, 2-metilbütan gelen her doku mantar çekmek için kaşık veya büyük forseps yaptı. Çabuk, lamel kaldırmak behere fazla 2-bromür kapalı kurulamak ve ardından dış azot banyoya doku mantar bırakın. beher kalan tüm mantarları tekrarlayın.
- Sıvı azot ya da kuru buz üzerinde Aktarım örnekleridepolama için -80 ° C derin dondurucu.
- herhangi bir doku dondurulması için kalırsa, tekrar 1.2.4 için 1.2.3 adımları. -140 ° C'ye kadar gerekli ve yeniden serin dış banyo beher veya sıvı azot ilave 2-bromür ekleyin. tehlikeli atık olarak kullanılan 2-metilbütan atınız.
- Diseksiyon bitmeden dondurma Hamamı beş dakika soğutma başlayın. yaklaşık 3 cm derinliğe kadar açık bir metal kap içine 2-metilbütan dökün. 2 ila 4 cm bir derinliğe kadar yalıtılmış bir kap içine sıvı azot dökün. sıvı azot içine 2-metilbütan bir beher ayarlayın; azot kaynamaya başlayacaktır. 2-metilbütan behere azot sıçramasını önlemek.
2. Histoloji ve RNA Uygulamaları için cryosections toplayın
- Hazırlık.
- Bir analitik terazi üzerinde bir DNaz / RNaz ücretsiz otoklava tüp pre-tartın. Daha sonra, ön soğutma kriyostat odasına taşımak. tüm toplanmış cryosection örnekleri toplanacak için tüpler hazır olana kadar tekrarlayın.
- iskelet kası kesit için, kriyostat odası sıcaklığı iç termostat -21 -22 ° C olduğunu teyit etmektedir. odasına kesilecek dokularıyla herhangi bir kap aktarın ve kap (lar) açılmadan önce en az 15 dakika boyunca kriyostat sıcaklığına gelmesini sağlar.
- Yeni bir tek kriyostat bıçağı takın. Alternatif, RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile sprey, mevcut bıçağı kaldırmak GKD 2 O ile durulayın ve soğumaya kriyostat içine takın. % 70 etanol ile temiz bir doku sprey ve dikkatle bıçak ve bıçak sıkıştırma platformu silin.
- Bir RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile temiz bir doku sprey ve Kriyostat fırçaları silin. , GKD 2 O ile bir doku sprey tekrar fırçalar silin ve temiz bir yüzeye kriyostat odasına bunları.
DİKKAT: Kriyostat bıçak kullanılmadığı zaman bıçak koruması kapsamına alınmalıdır. Ayrıca, RNaz dekontaminasyon çözeltisi toksiktir ve soğuk kriyostat bölmesinde bir çökelti oluşturmak üzere donar. Bu nedenle, dikkatli olun ve Kriyostat odasında kullanımını önlemek.
- Bir RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile temiz bir doku sprey ve Kriyostat fırçaları silin. , GKD 2 O ile bir doku sprey tekrar fırçalar silin ve temiz bir yüzeye kriyostat odasına bunları.
- Kriyostat odasının içinde, bir kuruş büyüklüğünde damla sıcak örnek aynası üzerine reçine gömme (yaklaşık 300 ul) yerleştirin, aşağı reçine üst basın bir doku mantar ayarlayın ve sonra fr Chuck setdemiryolu veya varsa hızlı bir dondurma elemanı üzerine eezing.
- gömme reçine katılaşır (beyaz) sonra, doku alt% 35 civarında, mantar üstüne ek gömme reçine ekleyebilir ve daha iyi doku stabilize etmek için hızlı bir dondurma için gömme reçine içine ısı çıkarıcı basın. Reçine tamamen sertleşmesine izin kesit önce 5 dakika bekleyin.
- örnek kelepçe en geri çekilmiş pozisyonda, bıçak en uzak olduğundan emin olun. örnek kelepçe içine doku örneği aynasını takın.
- Cryosection hazırlanması.
- Bıçak taşıyıcı tutucu gevşetin 10 ° (veya kullanılan bıçak taşıyıcı için uygun bir açı) ile bıçağın açıklık açısını ayarlamak ve yeniden sıkın. frenini bırakın ve bıçak doğru kas düşürmek için el çarkını. doku ve bıçak arasında en küçük mesafe tahmin sonra bıçaktan uzak doku taşımak ve el çarkı frenini çekin.
- Yükseklik ayar leve gevşetindoku uç bıçak daha yaklaşık 2 mm'den ise r, sırasıyla, ileri veya geri bıçak taşıyıcı taşımak ve ya bıçak dokusunu vurursa. Sıkın ve bıçak mesafe kontrol etmek için tekrar doku indirin. bıçak, görsel tahminle doku ucundan 1 ila 2 mm kadar ayarlamalar tekrarlayın.
- bıçak doğru doku indirin ve enine kesitler için doku açısını değerlendirmek. El çarkını kilitlemek ve numune kelepçe kolunu serbest bırakın. örnek kelepçe sola veya sağa doku yatay yönlendirme bıçak dik kadar itin.
- Bu doku kesitlerinde kas uzun eksenine dik olacak şekilde "y" yönünü ayarlamak için aşağı yukarı örnek kelepçe veya arkadan itin. örnek kelepçe kolunu sıkın.
- sadece bıçağa dokunana kadar numune ilerlemek için kurs ve ince ileri beslemeyi kullanın. Belirli bir doku derinliği bölümleri arayan varsa, (sıfıra bölüm kalınlıklarının toplamı sıfırlamakdoku üst).
- 30 mikron kesit kalınlığı ile trim fonksiyonu için Kriyostat ayarlayın. Kes ve doku toplama önceden seçilmiş derinlik ulaşılana kadar bölümleri atmak (örneğin, üst 400 mikron).
- RNA ekstraksiyonu için cryosections toplayın.
- toplama bölümler için tüp açın ve bıçak taşıyıcı yakın yerleştirin. o bıçak kesilir her bölümü pick up ve tüpe cryosection aktarmak için daha önceden soğutulmuş, temiz bir fırça kullanın. toplanmış bölümler 30 mg ağırlığında veya istenilen doku derinliğine ulaşılana kadar tekrarlayın.
NOT: - 40 mg bir yetişkin fare tibialis anterior için, yaklaşık 400 mikron 4.000 doku derinliği toplama genellikle 25 verir. bölümler sopa ve metal yüzeyinde gelme eğilimi gibi metal forseps kullanılarak tavsiye edilmez toplama tüpüne bölümleri aktarmak için. - reçine gömme kas cryosection çevreleyen ise, el frenini kilitlemek ve jilet kullanmakkas üst etrafında sadece ince bir tabaka kalmayıncaya kadar reçine küçük parçalar tıraş. bıçak ile her zaman kesilmiş reçine uzak kas açılı.
NOT: esasen aşağı RNA hazırlık bozmaz reçine gömme ince bir tabaka. kalın gömme reçine varsa, toplama tüpünün içine cryosection taşımadan önce uzak kas onu kızdırmak için fırça kullanın. - Alternatif olarak, toplama tüpüne toplu bıçak taşıyıcı ve transfer havuz bölümleri.
Not: Bununla birlikte, bu yöntem daha yavaş olma eğilimindedir ve bölümler sopa ve sonraki adımda iğne homojenleştirme verimini azaltabilir, bir araya gelme olasılığı daha yüksektir. - Hızla analitik terazi ve kayıt tüp ağırlığı içine toplanmış cryosection tüp yerleştirin. Hemen -20 ° C civarındaki bölümü sıcaklığı korumak için, soğuk kriyostat odacığına tüp döner. toplanmış bölümlerinin ağırlığı hesaplanır.
NOT: RNA izolasyonu reklama oluşacak olursaifferent gün -80 ° C'de kullanıma kadar toplanmış cryosection tüpü saklayın.
- toplama bölümler için tüp açın ve bıçak taşıyıcı yakın yerleştirin. o bıçak kesilir her bölümü pick up ve tüpe cryosection aktarmak için daha önceden soğutulmuş, temiz bir fırça kullanın. toplanmış bölümler 30 mg ağırlığında veya istenilen doku derinliğine ulaşılana kadar tekrarlayın.
- histoloji için cryosections toplayın.
- ince kesit ve kullanım okları 7 um (ya da diğer uygun kesit kalınlığı, genellikle 6 ila 10 um) için kriyostat kesit kalınlığı ayarlamak için kesit kalınlığı düğmesine basın.
Not: ince kısımların (6 ila 10 um) ya da doku bölümünün derinlik nüfuz edebilir boyama reaktifleri sağlamak için histolojik uygulamalarda kullanılır. Ince kesitler cryosectioning sırasında herhangi bir derinliğe alınabilir, ancak doku derinliği ile artar reçine, gömme histolojik lekeleme bozmadığı için derin bölümler tercih edilir. - Kes ve tutarlı, hatta doku yüzey elde etmek 4 ila 7 bölümleri atın. Doku derinliği not edin.
- Bir bölümü kes ve bıçak taşıyıcının yüzeyinde yönlendirmek. hızlı ve nazikçe ılık (oda sıcaklığı) mikroskop lamı dokunarak bölümü Pick upbıçak taşıyıcı bölümüne. Oda sıcaklığına kadar slayt dönün. İstenilen slaytlar sayısı elde edilene kadar devam edin. Nihai doku derinliği not edin.
NOT: Her doku için ikinci bir (çift) bölümünde Toplama tavsiye edilir. - tam kesit ile, el çarkı frenini çekin arka çoğu pozisyona örnek dönmek ve doku aynasını çıkarın. örnek aynası üzerinde doku mantar tutan gömme reçine eritmek için Kriyostat ısı elemanı kullanın. Doku mantar kaldırmak doku ile kurulayın ve depolama dönün.
- kalan her doku için adım 2.1.2 itibaren tekrarlayın. Geçen doku monte edildikten sonra slaytlar 20 dakika kurumasını bekleyin. kadar gerekli Sonra, bir slayt kutusunda -80 ° C'de histolojik veya immunofluorescent boyama ya da dondurularak için slaytlar kullanın.
- ince kesit ve kullanım okları 7 um (ya da diğer uygun kesit kalınlığı, genellikle 6 ila 10 um) için kriyostat kesit kalınlığı ayarlamak için kesit kalınlığı düğmesine basın.
Toplanmış cryosections 3. RNA İzolasyon
- RNA ekstraksiyonu,
- buz toplanmış cryosections Taşı tüp (ler). Hemen bir ekleme50 mg cryosection ağırlığı başına yaklaşık 1 ml reaktif, tüp başına tipik olarak 600 ul'lik bir oranda organik RNA ekstraksiyon reaktifi.
DİKKAT: RNA izolasyon reaktifler, zehirli, aşındırıcı, ve rahatsız edici. Güvenli kullanım için üreticinin talimatlarına uyun. - 18 kalibrelik bir iğne ile 1 ml şırınga kullanarak, RNA ekstraksiyonu, sıvıyı çekmek ve doku çözeltisi içinde süspansiyon haline gelene kadar borunun duvarları yıkayın. İğne homojenizasyon sırasında hava kabarcıkları en aza indirmek için deneyin.
- Tüp duvarına yapışan clumped cryosections ve parçaları püre ve dağıtmak için iğne ucu kullanın. Çiğnemek beş vuruş için iğne ile yukarı ve aşağı örnek geçirilerek homojenize ve daha sonra buz numunenin geri dönün. tüm kümeleri bozmak ve iğne ile kolayca örnek geçmek için gerekli olduğu gibi hem üç ila beş kez, ya da birçok kez adımları tekrarlayın.
- 18 iğne çıkarın ve 22 gauge iğne ile değiştirin. dikkatle trBeş vuruş için örnek iturate ve daha sonra buz numunenin geri döner. çok ince dağılmış doku Homojenat elde etmek için toz haline getirildikten üç ya da dört kez tekrarlayın.
NOT: Doku parçacıklar örneği çizerken iğne engellemek başlarsanız, şırınga tüm örnek kovmak ve geri ileri homojenizasyon için 18 gauge iğne geçin. 25 ya da 26 numara iğne ile ek toz haline getirme adımı maksimum verim elde etmek için ilave edilebilir. Numune dökülmesi riski var bu yüzden Ancak, iğne tıkanabilir. - buz, oda sıcaklığına kadar örnek getirin. moleküler kompleksler bozmak için 5 dakika boyunca inkübe edin.
- Bir duman başlığı içinde, tüp başına kullanılan RNA izolasyonu reaktifi 1, ml başına 1-bromo-3-kloropentan (BCP) (aşama 3.1.1), 0.1 mi, tipik olarak 60 ul ekle. (Vorteks yapmak) 15 sn için elle kuvvetlice tüpü çalkalayın. 2 ila 3 dakika boyunca oda sıcaklığında örnek inkübe edin. Daha sonra, 12,000 x g'de 15 dakika 4 ° C'de santrifüjlenir.
DİKKAT: - Dikkatle üst sulu fazı (renksiz) içeren RNA toplamak ve temiz bir tüpe aktarın. % 70 (DEPC su içinde) etanol ve karıştırmak için girdap eşit hacim. En fazla 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
Not: Orta interfaz ve alt fenol-BCP fazlar, üreticinin talimatlarına göre veya uygun bir şekilde bertaraf edilmesi için fenol-BCP tehlikeli atık kapta toplanır göre sırasıyla genomik DNA ve protein için işlenebilir.
- buz toplanmış cryosections Taşı tüp (ler). Hemen bir ekleme50 mg cryosection ağırlığı başına yaklaşık 1 ml reaktif, tüp başına tipik olarak 600 ul'lik bir oranda organik RNA ekstraksiyon reaktifi.
- RNA saflaştırma.
- 8 küçük değişikliklerle bağlayıcı numune, yıkama ve elüsyon için üreticinin talimatlarını izleyin. Örneğin:
- Aşama 3.2.4-sıcak ön 37 ° C banyo veya inkübatör içine DNaz / RNaz içermeyen su bir kısım yerleştirin.
- bir saflaştırma sütunu yukarıda 3.1.8 RNA örneği eklenir ve 15 saniye boyunca numune santrifüjOda sıcaklığında 12.000 xg'de. Aynı sütunda ve yeniden santrifüj geri akışı dökün. RNA bağlayıcı üst düzeye çıkarmak ve sonra üzerinden nihai akışını atmak için ek süre tekrarlayın.
- Üreticinin talimatlarına 8'e göre yıkama adımları uygulayın. 12.000 xg'de 15 sn kolona yıkama tamponu 700 ul (yok etanol), spin uygulayın ve akış atmak.
- 12.000 xg'de 15 sn için kolona (etanol) ile yıkama tamponu 500 ul, sıkma ekleyin ve akış atmak. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
- membran kuru 12,000 xg'de 1 dakika boş sütun dönerler.
- Temiz bir RNase-, DNaz ücretsiz tüp spin kolon aktarın. Sütun membranın merkezi (3.2.1 arasında) önceden ısıtılmış DNaz / RNaz içermeyen su 40 ul ekle. Oda sıcaklığında, 2 dakika süreyle inkübe edilir ve daha sonra, 12.000 x g'de 2 dakika süre ile santrifüjlenir.
Not: 40 ul elüsyon hacmi, orijinal mg başına yaklaşık 1.3 ultoplanmış cryosections 30 mg doku. farklı başlangıç doku ağırlıkları için uygun sağım ses seviyesini ayarlamak, ancak 32 ul altına düşürmek yok. orijinal dokunun mg başına yaklaşık 0.7 ul kullanarak ikinci bir yıkama, toplam RNA, verimi artırmak için ilave edilebilir. - Bir spektrofotometre, elektroforez ve / veya Bioanalyzer ile konsantrasyon ve saflık için RNA (sütun elüsyon) analiz eder. Bu kantitatif PCR 4 ters transkripsiyon alt-uygulamalar için gerekli olana kadar -80 ° C'de RNA saklayın.
NOT: Bir DNaz tedavi aşağı uygulamalarda RNA kullanmadan önce tavsiye edilir. Bu tedavi kolon yıkaması, sonra bu belirli bir noktada, yıkama aşamasından önce bir RNA saflaştırma kolon üzerinde gerçekleştirilmiştir ya da herhangi bir alt uygulamada ilk adım olarak RNA bir tümbölen üzerinde olabilir. RNA, birkaç yıl için kararlı olmalıdır.
Immunofluorescent lekelenme tarafından 4. Histolojik AnaliziKas cryosections g
- Basit immünofloresan protokolü.
- Her bir slayt bölümlere grup daire için bir hidrofobik kalem kullanın. Yavaşça dokuları dokunmamaya dikkat ederek, daire içine alana (geniş bir yüzey alanı için 500 ul kadar küçük bir yüzey alanı için yaklaşık 80 ul) PBS bırakın. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
NOT: Dondurulmuş slaytlar kullanıyorsanız, -80 ° C derin dondurucuda slaytları çıkarın ve 20 ila 30 dakika çözülme ve kuru, daha sonra yukarıdaki gibi devam etmek için oda sıcaklığında kuluçkaya yatmaktadır. En az iki slaytlar ihtiyaç vardır: Biri deneysel slayt birincil ve ikincil antikor inkübe edilecek; ve primer antikor için bir kontrol slayt, "ikincil sadece" kontrol hariçtir. - PBS kapalı dökmek için slayt İpucu. daire alana PBS (engelleme çözeltisi)% 5 eşek serumu ekleyin; kas bölümleri kurumasına etmemelerini sağlamak için dikkatli olun. bir nem odası birkaç saat kadar 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin (ya da).
- kas rejenerasyonu analiz etmek birincil antikor çözeltisi hazırlayın. Bir eMHC antikoru (01:40) ile bir COLVI antikor (: 1.000 1) ile, bloke etme çözeltisi karıştırın. sırasıyla küçük, orta veya büyük slayt alanlar için, 300 ul veya 500 ul yaklaşık 150 ul hazırlayın. Vorteks 5 saniye için, ve daha sonra bir çökelti pelet 15,000 x g'de 2 dakika süre ile santrifüjlenir.
- Deneysel slaytlar için, engelleme çözümü kapalı dökün ve sonra 4.1.3 birincil antikor çözümü eklemek için slayt ipucu. İkincil kontrol slayt için, engelleme çözümü kapalı dökün ve sonra taze engelleme çözümü (hiçbir antikor) eklemek için slayt ipucu. gece boyunca 4 ° C'de bir nem odasında slaytlar inkübe edin.
NOT: Slaytlarınıza antikor çözümler pipetleme, her zaman tüpün alt kısmında herhangi bir çökelti bozmak yok, primer antikor çözüm tüpünün üst sıvıyı çekin. - İpucu çözümü kapalı dökmek için slaytlar. yıkamak için her slaytın daire içine bölgeye PBS damla damla ekleyin, ucu dökmek içinkapalı daha sonra PBS ilave edin ve 3 ila 5 dakika boyunca inkübe edin. üç yıkamadan toplam tekrarlayın.
NOT: yıkama süresi oldukça esnektir ve istenirse 20 dakikaya kadar uzatılabilir. Genel olarak, çözelti değişim sayısı zaman daha önemlidir. - DAPI nükleer 10,000 seyrelti: fare IgG1 (eMHC) ve tavşan IgG (COLVI) ve 1 ile tespit etmek için kırmızı ve yeşil fluorofor-bağlı ikincil antikor: 500 oranında seyreltilmiş 1 kullanılarak (ikincil kontrol slayt dahil) slaytlar için ikincil antikor çözeltisi hazırlayın leke.
- Örneğin, DAPI 1:10 seyreltme yapmak GKD 2 O 9 ul DAPI 1 ul karıştırın. Daha sonra, 500 ul nihai hacim için, bloklama çözeltisi 447,5 ul 1:10 DAPI 1.0 ul 1.0 + anti-fare IgG1-kırmızı ul anti-tavşan IgG-Yeşil + 0.5 ul ekleyin. Girdap herhangi bir çökelti pelet 15,000 x g'de 2 dakika süre ile karıştırılır ve santrifüjlenir için.
NOT: İdeal olarak, tüm ikincil antikorlar aynı ana türlerinden olmalıdır.
- Örneğin, DAPI 1:10 seyreltme yapmak GKD 2 O 9 ul DAPI 1 ul karıştırın. Daha sonra, 500 ul nihai hacim için, bloklama çözeltisi 447,5 ul 1:10 DAPI 1.0 ul 1.0 + anti-fare IgG1-kırmızı ul anti-tavşan IgG-Yeşil + 0.5 ul ekleyin. Girdap herhangi bir çökelti pelet 15,000 x g'de 2 dakika süre ile karıştırılır ve santrifüjlenir için.
- Geçen PBS yıkama kapalı dökmek için slaytlar İpucu. tüm dokuları kapsayacak şekilde ikincil antikor çözüm ekleyin. ışıktan korumak ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe slaytlar örtün.
NOT: Tüm ikincil antikorlar ikili etiketleme deneylerinde diğer türler ile minimum çapraz reaktivite sahip valide edilmelidir. - 4.1.5 tarif edildiği gibi slaytlar yıkayın. Son yıkamadan sonra, PBS dökün ve bir doku üzerinde slayt ayarlamak için slayt ipucu. bir tarafı boyunca bir sulu montaj ortamı 3 ila 4 damla ekleyin.
- Sadece montaj medya dış kenarına cam lamel kenarına ayarlayın. forseps kullanarak, yavaş yavaş, sonra, dokulara doğru lamel alt lamel bırakın ve yavaşça yerine dokunun. Son olarak, hafifçe stabilize etmek için lamel her köşesini basın.
- kullanılana kadar 4 ° C'de ışık ve mağaza slaytlar koruyun.
NOT: Uzun süreli depolama için, th kenarı boyunca oje ince bir tabaka uygulayıne lamel kurumasını slayt önlemeye yardımcı olur.
- Her bir slayt bölümlere grup daire için bir hidrofobik kalem kullanın. Yavaşça dokuları dokunmamaya dikkat ederek, daire içine alana (geniş bir yüzey alanı için 500 ul kadar küçük bir yüzey alanı için yaklaşık 80 ul) PBS bırakın. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
- Histolojik değerlendirme.
- Görüntü uygun filtreler ile bir Epifluorescent veya konfokal mikroskop kullanılarak slaytlar eMHC (kırmızı) tespit etmek; COLVI (yeşil); ve tipik bir 20X objektif 1,5 kullanarak, çekirdekleri (mavi) DAPI ile boyanmış.
- Deneysel slaytlar floresan sinyal eMHC ve COLVI tespiti 4 özgünlüğünü göstermek için ikincil kontrol slayt farklı olduğundan emin olun.
NOT: eMHC pozitif canlandırıcı lifleri kas yaralanma sonrası ve değişken müsküler distrofi ile farelerde yaklaşık 2 ila 7 gün arasında görünür olmalıdır. Kollajen VI kas lifleri, kan damarları ve sinirler çevreleyen hücre dışı matrisin ve peri- ve epimysium büyük bağ dokusu demetleri mevcuttur. DAPI nükleer leke kas lifi rejenerasyon gösteren periferik çekirdeklerin karşı santral nükleuslu lifleri ve i varlığını tespit etmek yararlıdırhücrelerin nfiltrating. Nekrotik veya yaralı elyaflar nedeniyle hasar kas zarlardan lifleri nüfuz endojen IgG deteksiyonuna fare IgG ikincil antikor ile zayıf leke yapabilir. - rejenerasyon ölçmek için, tüm görüntü boyunca her floresan filtre ile örtüşen mikroskop fotoğraf çekmek. Tüm bölüm 1,5 haritasını yeniden resim hizaya sonra her bir yer için eMHC, COLVI ve DAPI görüntüleri birleştirme ve.
- analiz yazılımı kullanılarak, eMHC pozitif liflerin sayısı ve son yenilenme (100 * (# eMHC + lifler / # toplam lifler)) hesaplamak için toplam elyaf sayısını saymak. Ayrıca, (100 * (# CN + elyaf / toplam # elyaflar)) 1,5 uzun bir süre boyunca rejenerasyon ölçmek için toplam elyafın üzerinden merkezi çekirdekli elyafların sayısı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kas cryosection RNA kalitesi yüksek ve uygulamaların çoğu için yeterli verim sağlar
On altı çizgili kas RNA preparatları analizleri 8 kontrol farelerinden alınan havuzlanmış tibialis anterior (TA), kas 19.4 41 mg kullanılarak Tablo 1 'de gösterilmiştir. Hem sol (L) ve sağ (R) ta kasları yöntemlerle kas yaralanmasına neden 3 gün tuz veya 10 uM cardiotoxin 25 ul uzunlamasına kas içinden enjeksiyondan sonra alınmış kaslar ile yenilenmesi deneylerde hazırlandı önce 1 rapor etmiştir. Tablo 1 'de gösterildiği gibi, kas cryosection RNA A260 / 280 oranları, bu Örnek örneklerde tipik olarak 2 yakın veya daha yüksek bulunmaktadır. "Saf" RNA 2.2 / 2.0 ve A260 arasında 280 / 1.8 280 A260 sahip olduğu kabul edilir olarak, cryosection RNA örnekleri saflığı 9 mükemmeldir. Toplam RNA, geri kazanımı tipik olarak ove olduEn aşağı uygulamalar için yeterli malzeme sağlayan doku başlangıç mg başına toplam RNA mikrogram üzerinde 1 0,18 verimi ile numune başına r 10 ug. Özellikle, RNA konsantrasyonu, çıkarılan toplam RNA ve 3 gün sonrası toksin yaralanma TA kaslar başlayarak doku mg başına RNA verim salin enjekte TA dan anlamlı olarak daha yüksek idi. Bu, kas yapısı 3 gün rejenere kas gen transkripsiyonu ve / veya RNA stabilite bir artış olduğu ve / ya da geniş bir yaralanma bozulduğu zaman homojenizasyon düzelmeler olduğunu göstermektedir. Numuneler 18 ay boyunca -20 ° C 'de muhafaza edildikten sonra, RNA kalitesi devam etmesi, basit 1x TAE / kas cryosection RNA'nın 1 | il% 1.5 agaroz jel elektroforez işlemi aracılığı ile değerlendirilmiştir. Tanınmış 18S ve 28S rRNA bantları bile optimal saklama koşulları (Şekil 1A) altında, hala yüksek RNA kalitesini gösteren örneklerde açıkça görülmektedir.
Kas cryosection RNAaşağı uygulamalarını destekler
toplanmış cryosection örnek başına RNA bir mikrogram DNaz ile muamele edilmiş ve oligo dT primerleri ters transkribe. RNaz işlemini takiben, cDNA, ters transkribe toplam hacmi 30 ul idi. Aşırı büyütme Basit olmayan kantitatif PCR cDNA canlılığı teyit etmek çalıştırıldı. Miyojenik düzenleme faktörü 4 (Mrf4), kas farklılaşması ile yukarı regüle bir transkripsiyon faktörü, standart PCR kullanılarak şablon 2 ul arasında, 5'-CTGAAGACTGCTGGAGGCTG 10 5'-CTACATTGAGCGTCTACAGGACC duyu ve anti duyu, daha önce rapor edilmiş bulunan fare primerler kullanılarak büyütülmüştür. RT GKD 2 O (hiçbir RNA şablonu ile ters transkripsiyon), ya da GKD, (RNA dahil, ancak hiçbir ters transkriptaz) Orada sağ ve sol TA cDNA örneklerinden hem 234 bp Mrf4 fragmanının sağlam, spesifik amplifikasyon, ama RT değil 2 O PCR kontrol (Şekil 1B).Aynı örnekler Mrf4 ve mOaz1 referans kontrolü için üç kopya halinde gerçek zamanlı PCR sisteminin göreceli amplifikasyon ve pasif floresans referans kullanarak 4 ölçümü gerçekleştirilmiştir. Mrf4 ΔΔCt yöntemiyle 4 hesaplanan salin enjekte sol TA karşılaştırıldığında, toksin enjekte sağ ta 0.097 kat ifade edildi. Bu durum, gelişmiş kas lifleri 11 kaybına 3 gün toksin yaralanma sonrası düşük Mrf4 ifade önceki raporlar ile benzerdir. Nicel PCR için cryosection RNA'lar tutarlılığını karşılaştırmak için, Ct değerleri mOaz1 referans geni için karşılaştırıldı. Altı numune kaynaktan, mOaz1 transkript Ct RT kontrol örneklerinde 36,332 ± 3.61 SD olarak ortalama ise, 17.242 ± 1.483 SD ortalama Ct ile tespit edildi (n = 4). numuneler arasında mOaz1 Ct sinyallerinin sıkı gruplama TA kas cryosections izole RNA aşağı RNA ifade analizleri beklendiği gibi performans göstermektedir.
3 gün toksin enjeksiyonundan sonra yavru kontrol farelerinden 7 mikron tibialis anterior kas bölümlerinin dolaylı immünofloresan boyama örnekleri (Şekil 2) yenileyici lifleri tespit etmek için gösterilmiştir. Her iki bölüm bölgeden 150 mikrometreden daha yakın kas yüzeyinden 4,6 mm 4,5 ila derinlikte RNA analizi için kullanılacak kas toplanmıştır. Embriyonik miyozin ağır zincir (eMHC, kırmızı) yenileyici lifleri, kolajen VI algılar (yeşil COLVI) kas lifleri özetliyor ve DAPI lekeleri konsantre nükleer infiltratla (mavi sinyali) ile 4. Bölgeler toksin yaralanma siteleri gösterir protokole göre, mavi çekirdekler , eMHC pozitif yeni rejenere kas hücrelerinin aktivasyonu ile belirgin olarak. Bu örnekte olduğu gibi tüm bölüm haritaları embryoni oranını hesaplayarak yenilenme ölçümü için kullanılanc miyozin ağır zincir ifade eden lifler (yeni rejenere kırmızı,) ya da merkezi çekirdekli liflerin daha önce 1 olarak bildirdi. Özellikle, Şekil 2A TA kasta şaşırtıcı derecede küçük hasar var. Enjeksiyonlar arasında farklılık vardır da Şekil 2B'de gösterildiği gibi, tipik bir toksin enjeksiyonu, kas bölmesinin 1 çok daha büyük bir oranda etkiler. Bu nedenle, bu histolojik analiz Şekil 2A toksin yaralanması az olduğunu göstermektedir ve bitişik kas cryosection RNA örnek gen ifadesi verileri yorumlamak için önemli bir araç sağlar. Bütün kas standart öğütme yöntemlerle RNA hazırlanmasında kullanılan olsaydı, bu örnek beklenmedik küçük yaralanma alanı, mansap analizler çarpık olacak bir uç değer yapar. Bunun yerine, aynı kas histolojik kantifikasyonunu eşleştirme bitişik bölümlerden yaralanma ölçüde doğrudan ölçülmesini sağlar. Bu inclu kullanımını sağlarsion / dışlama kriterleri yaralanma büyüklüğüne göre analizleri asgari yaralanma eşiğine veya RNA normalleşme karşılamak analizleri bütün numuneler aşağı RNA dahil olmasını sağlamak için.
Şekil 1: Toplanmış Muscle cryosections RNA Kalite Değerlendirmesi. A) 18S ve 28S ribozomal RNA bantları 18 ay RNA hazırlandıktan sonra havuza kas cryosections RNA belirgindir. B) ters transkripsiyon Aşağıdaki PCR Mrf4 Non-nicel. DNA merdiveninin 200 ve 300 bp bantları gösterilir. RT-, RNA şablonundan ama hiçbir ters transkriptaz ile transkripsiyon reaksiyonu ters. RT-H2O, GKD 2, O, Resim RNA şablonu ile ters transkripsiyon. H2O, bu deneylerde, GKD 2 O ile bir şablon PCR kontrolü, toksin doğru tibialis ön (RTA) ve tuzlu su wa enjekte edilmiştirs sola (LTA) enjekte. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Kas Rejenerasyon Çalışmaları Histolojik Haritalar tadın. A, B) 3 gün kötü (A örneklerini gösteren toksin enjeksiyonu) ve normal (B) toksin kaynaklı yaralanma sonrası tek anterior tibial kas bölümden Derleyen haritalar. Her bölüm haritanın beyaz kutulu bölgeler yüksek büyütme görüntüleme, Kırmızı, embriyonik miyozin ağır zincir için ilave görüntü olarak gösterilir; Yeşil, kollajen VI hücre dışı matris proteini; mavi, DAPI nükleer leke. Ölçek çubuğu, 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: toplanan kas cryosections Temsilcisi RNA Verim ve Saflık Ölçümleri. On altı tibialis anterior (TA) kas kesitler alındı ve bir araya cryosection örnekleri RNA için işlenmiştir. Arındırılmış RNA (1 ul), bir nanospectrophotometer ile analiz edilmiştir. Sütun istatistikleri bir elektronik tabloya yapıldı, grup karşılaştırmaları istatistiksel yazılım kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
fazlalık reçine toplanmış cryosections toplanması yavaş olacak ve RNA izolasyonu reçine kirlenme gömme artabilir, çünkü bu yöntem ile en iyi sonuçları elde etmek için, doku kriyoprezervasyon sırasında kas alt üçüncü ya da yarısına sınırlı reçine gömme tutun. Ayrıca, iğne homojenizasyon sırasında dikkatli dikkat verimi en üst düzeye çıkarmak ve iğneyi tıkanma olasılığını en aza indirmek için önemlidir. protokol iğne bloke ve yapışmasına neden çıkarmak için yüksek basınç gerektiren hale gelirse örnek kaybına karşı korumak için bir Luer-Lok şırınga kullanılarak modifiye edilebilir. 25 ya da 26 gauge iğne ile bir ek iğne homojenleştirme aşaması, bundan başka, RNA verimi gelişmiş bir ince doku süspansiyonu üretmek için ilave edilebilir. Kloroform BCP yerine kullanılabilir ise BCP daha az toksik olan ve RNA 12 organik ekstraksiyon sırasında, sulu faz içinde, genomik DNA kontaminasyonu alt seviyeleri ile sonuçlanır, bu tavsiye edilmez. Artanhomojenizasyon daha az verimli olacak gibi toplanmış cryosections mikron üzerinde 30 için kesit kalınlığı da tavsiye edilmez.
RNA verimi oldukça düşüktür ise, çeşitli stratejiler örneğin kurtarma geliştirmek için kullanılabilir: i) muhtemel bir ürün artışının başlangıç malzemesi miligram miktarını arttırmak; ii) doku mekanik homojenizasyonu artırmak için 30 mikron aşağıdaki bölüm kalınlığının azaltılması; iii) mekanik ve kimyasal doku bozulması geliştirmek için organik ekstraksiyon reaktifi örnek inkübasyon ve iğne homojenizasyon süresini artırmak; Doku parçaları kalırsa ve iv), daha sıkı iğne homojenizasyon ile ikinci ekstraksiyon adımı gerçekleştirmek. Alternatif olarak, yüksek proteoglikan içeriği 13 numune için ek faz ayrılması ve çökeltme adımları gibi doku-özel hususlar, olabilir. RNA, kolon saflaştırması sırasında daha büyük bir elüsyon hacmi ma Kullanılan ve bir ikinci elüsyon performans olabilirtotal RNA kurtarma ximize, ancak RNA konsantrasyonu pahasına. Bir post-kolon alkol yağış düşük konsantrasyonda bu değişiklik ile bir endişe ise RNA konsantre kullanılabilir. RNA bozulması diseksiyonu sırasında dondurarak saklama süresini azaltarak bir sorun ise, kriyostat yüzeyleri ve aletleri daha titiz temizlik iğne homojenizasyon soğuk bir odada adım, cryosections 14 bir RNaz inhibitör reaktif eklenmesi ve sık yapılması, RNaz maruziyeti en aza indirmek için RNaz ücretsiz çözümler yerine, her önlemek veya RNases maruz kalma en aza indirmek ve bölünme aktivitesini azaltmaya yardımcı olabilir. Kısaca diseksiyonu sonrası bir RNaz inhibitör reaktifi doku banyo, ancak dondurarak saklama önce, daha örnek bozulmasını azaltmak mümkündür. Bununla birlikte, ön deneyler, bu tür bir tedavi dondurarak saklama işlemi sırasında buz kristalleri veya diğer bozulmaları artmaz sağlamak için gerçekleştirilmelidir.
embriyonik ikenmiyozin ağır zincir / kollajen VI dolaylı immünofloresans yaralanma kas analizi için bir örnek olarak burada kullanılan, ince cryosections mikroskop üzerine monte post immünofloresan teknikleri dahil olmak üzere dondurulmuş kesitler üzerinde yapılabilir ilgili herhangi bir histolojik boyama için de kullanılabilir, bu deneylerden slaytlar -fixation ve hematoksilen / eozin boyama. Nitekim, burada sağlanan basit immunofluorescent protokolüne uyarlamalar gerekli olabilir. Örneğin, anti-fare ikincil antikorlar, hedef dokuda endojen fare immünoglobülinleri algılayabilir fare birincil antikor (ör eMHC) tespit etmek için kullanılır. Böyle endojen antikorlar genellikle arka plan immunofluorescent boyama neden yaralı veya distrofik kas hasarlı veya nekrotik kas liflerinde birikir. (Atlanmış primer antikor ile) bir ikincil kontrol slayt hep lekelenme özgünlüğünü değerlendirmek için muayene edilmelidir. endojen antikor arka plan sorunlu ise, ön blok adımlar olmalıdırönlemek veya endojen fare immünoglobülinler 15 tespitini en aza indirmek için protokole ekledi.
yöntemin temel sınırlamalar bir Kriyostat gerektirdiğini ve bunun nispeten düşük verim yapar zaman tüketen vardır. Örneğin, teknik bir uzman yaklaşık 9 ila 10 saat içinde toplanmış cryosections ve mikroskop lamı 16 kas (16 dokuların yinelenen bölümleri ile 8 slaytlar) kadar işlemek için başardı. acemiler cryosectioning için, 2 ila 4 örneklerinden toplanmış cryosections toplanması makul yerine, histoloji için elde kaliteli cryosections daha fazla deneyim aldı, kriyostat eğitim ve bir ya da iki uygulama seans sonra hakim olabilir. Bu nedenle, ekipman, zaman, ya da eğitim faktörleri manuel havaneli homojenleştirici iyi homojenize olabilir yumuşak dokular için bu yöntem daha az kullanışlı hale getirebilir.
olmayan Kriyostat homojenizasyon yöntemleri ile karşılaştırıldığında, çizgili kas, RNA hazırlanmasıs 0.7 ug RNA, ön kas 16 mg ve kas 17 mg'ı başına daha yakın 0.27 ug 1.08 RNA 0.05 RNA kazançları, kas biyopsilerinden bildirilmiştir. Bu nedenle, burada açıklanan teknik eşleştirilmiş histolojik sağlayan aynı örnek bitişik bir bölge analizleri ekledi avantajı ile olmayan Kriyostat yöntemlere göre kadar iyi ya da daha iyi RNA verimi sağlar. Özellikle, bir önceki çalışma da omur dokuda homojenizasyon için cryosectioning kullanılan ve benzer cryosectioning doku RNA izolasyonu 13 homojenizasyon verimliliğini arttırdığı bulunmuştur. Bu teknik sığır iskelet kası örneklerinde test edildiğinde, numune hazırlama başına ortalama RNA verimi burada 13 rapor normal aralığın düşük sonunda, ± 0.36 ug 4.09 oldu. Lazer yakalama mikrodiseksiyon bir cryosection RNA ekstraksiyonu için doku toplanması için bir alternatiftir. Lazer yakalama bu havuza cryosection yönteminde üstündürBu izin verdiği özgüllük kısmından hücrelerin sadece arzu edilen bir alt kümesi toplamak ve 50 um kalınlığında 18 kadar tek bir doku bölümünde gerçekleştirilebilir. Ancak, mikro-disseke örnek toplama olabilir zor ve uygun ekipman araştırmacılara toplanmış cryosection homojenizasyon daha erişilebilir hale yaygın değildir. Her iki yöntem de kullanılabilir olduğunda, bir tercih bir uygulama alt bölge analizi daha az önemlidir ve RNA yüksek miktarlarda ihtiyaç duyulduğunda havuza cryosection homojenizasyon iyi iken lazer yakalama mikrodiseksiyon lehine olurdu sadece küçük RNA miktarlarda ihtiyacı için bir doku alt bölgesini analiz etmek.
Histolojik ve RNA izolasyon yöntemleri odak burada da, havuzlanmış cryosection yöntemi kolayca Western blot analizleri veya enzim etkinlik ölçümleri protein lizatları hazırlamak için uyarlanmıştır. Örneğin, kalp toplanan cryosections Western Blot için çözülmüştür 4 a analizleriND ta havuzlanmış cryosections mitokondriyal fonksiyonun 5 sukinat dehidrogenaz aktivitesi deneyleri için homojenize edilmiştir. Alternatif olarak genomik DNA ve protein fraksiyonları tek kriyostat seansından sonra, tek bir dokudan, genomik DNA, protein, RNA ve histolojik ölçümler elde etmek için bir potansiyel sunar RNA izole edildikten sonra, organik ekstre sırasında diğer fazlardan ayrılabilir.
Genel olarak, bu yöntemin en önemli avantajı, tek bir dokudan farklı numune hazırlık gerektiren birden fazla analitik yaklaşımlar sağlayarak deneysel esnekliği artırmaktır. yöntem kas ve havan eli tabanlı doku homojenizasyon verimini düşürür geniş hücre içi veya dışı yapısı ile diğer dokular için en uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cork | VWR Scientific | 23420-708 | Cut into small squares with a sharp blade. |
| Plastic coverslip | Fisher Scientific | 12-547 | Used to orient the muscle during freezing. |
| Low temperature thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631-4L | Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet. |
| Embedding resin: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Other embedding resins can be substituted for cryomatrix. |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 with disposable blade carrier | Any working cryostat should be sufficient for the protocol. |
| Disposable cryostat blade | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used. |
| RNAse decontamination solution: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS64 | |
| Paint brush | Daler Rowney | 214900920 | Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies. |
| Razor blade | VWR Scientific | 55411-050 | |
| Microscope slide | VWR Scientific | 48311600 | |
| RNA organic extraction reagent: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle. |
| 18 gauge needle | VWR Scientific | BD305185 | |
| 22 gauge needle | VWR Scientific | BD305155 | |
| 26 gauge needle | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol. |
| 1 ml syringe | VWR Scientific | BD309659 | For very high value samples, a Luer-Lok syringe is recommended (e.g., VWR BD309628). |
| 1-bromo-3-chloropentane (BCP) | Sigma | B9673 | |
| For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water. |
| For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water. |
| RNA purification kit: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Final steps of RNA preparation. |
| DNase/Rnase-free water | Gibco | 10977 | DEPC-treated water can also be used. |
| Spectrophotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications. |
| Hydrophobic pen | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS for immunofluorescence protocol. |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence. Normal goat serum can also be used. |
| eMHC antibody | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| Collagen VI antibody | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Aqueous mounting media: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties. |
| Glass coverslip | VWR Scientific | 16004-314 | Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl |
| Image analysis software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, or more advanced products | Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process; e.g., ImageProPremier. |
| Merge and map section images: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated. |
| reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used. |
| Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system | Promega | M8298 | Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead. |
| SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments |
| Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |
References
- Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049 (2016).
- Bartoli, M., et al. Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies. Gene Ther. 13, 20-28 (2006).
- Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies. Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).
- Beedle, A. M., et al. Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy. J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).
- Foltz, S. J., et al. Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy. Skeletal Muscle. 6, 20 (2016).
- AVMA Guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). Available from: www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx 1-102 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).
- Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells. BMC Res. Notes. 3, 211 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
- Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4. Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).
- Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4. Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).
- Chomczynski, P., Mackey, K. Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).
- Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation. J. Biol. Methods. 2 (2), 20 (2015).
- Guo, D., Catchpoole, D. R. Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue. BioTechniques. 34, 48-50 (2003).
- Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining. J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).
- Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis. Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).
- Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
