Summary
Consecutivos crio-secciones se recogen para permitir que las aplicaciones histológicas y enriquecimiento de ARN para mediciones de la expresión de genes usando las regiones adyacentes de un músculo esquelético solo ratón. ARN de alta calidad se obtiene a partir de 20 - 30 mg de cryosections y mediciones agrupadas están directamente comparación entre aplicaciones.
Abstract
Con este método, cryosections consecutivas se recogen para permitir que las aplicaciones de microscopía para histología de tejido y el enriquecimiento de ARN para la expresión de genes utilizando las regiones adyacentes de un músculo esquelético solo ratón. Por lo general, es difícil lograr una homogeneización adecuada de pequeñas muestras de músculo esquelético debido a los volúmenes de tampón puede ser demasiado baja para aplicaciones de molienda eficiente, pero sin la suficiente alteración mecánica, la arquitectura del tejido denso de los límites del músculo penetración de los reactivos de amortiguamiento, en última instancia, causando bajo rendimiento de ARN. Siguiendo el protocolo informado aquí, 30 micras secciones se recogen y se agruparon permitiendo cryosectioning y posterior homogeneización aguja para interrumpir mecánicamente el músculo, aumentar el área de superficie expuesta para la penetración buffer. Las limitaciones principales de la técnica son que requiere un criostato, y es relativamente bajo rendimiento. Sin embargo, el ARN de alta calidad puede obtenerse a partir de pequeñas muestras de m agrupadocryosections uscle, haciendo de este método accesible para muchas diferentes músculos esqueléticos y otros tejidos. Análisis Además, esta técnica permite adaptado (por ejemplo, la histopatología de tejidos y la expresión de genes) de las regiones adyacentes de un solo músculo esquelético de modo que las mediciones se pueden comparar directamente entre aplicaciones para reducir la incertidumbre experimental y para reducir los experimentos con animales replicativos necesario a la fuente de un pequeño tejido para múltiples aplicaciones.
Introduction
El objetivo de esta técnica es hacer múltiples análisis experimentales por diferentes modalidades, como la histología y la expresión génica, accesible desde un solo pequeño tejido fuente músculo esquelético. aplicaciones de microscopía son los más sensibles a la muestra métodos de conservación, que deben ser controladas cuidadosamente para limitar la formación de artefactos de cristales de hielo durante la criopreservación. Por lo tanto, el desarrollo del método se basa en el tibial anterior (TA) de músculo congelado parcialmente cubierta con incrustación de resina en un baño de 2-metilbutano enfriado con nitrógeno líquido -140 ° C como el material de origen tanto para microscopía de inmunofluorescencia y análisis de la expresión génica.
La necesidad de utilizar la misma fuente de material para diversos enfoques técnicos es particularmente importante para los experimentos basados en la inyección intramuscular donde los músculos izquierda y derecha representan diferentes condiciones, uno experimental y uno de control. Por ejemplo, en estudios de regeneración del músculo, uno muSCLE se inyecta con una toxina para causar daño tisular generalizado mientras que el músculo contralateral sirve como control 1 del vehículo de inyección. Del mismo modo, los estudios de terapia génica para trastornos musculares comienzan típicamente con la validación del vector de terapia génica mediante inyección intramuscular a ser comparado con el vector vacío, vector no relacionado o de control del vehículo en el lado contralateral 2. Por lo tanto, no es posible a la fuente de cada músculo TA para una aplicación diferente.
Las estrategias comunes para hacer frente a este problema son: i) utilizar un grupo muscular diferente para cada aplicación, ii) utilizar los ratones adicionales, o iii) para cortar un trozo de músculo para cada aplicación. Sin embargo, las diferencias sustanciales entre los grupos musculares hacen que sea difícil comparar los datos de aplicaciones por separado, y los animales adicionales aumentan los gastos y son poco justificada si existen otras alternativas. Dividiendo el músculo después de la disección a la fuente de las diferentes aplicaciones es la mejor opción in muchos casos. Sin embargo, las piezas musculares son a menudo demasiado pequeñas para ser usadas pulverización en atmósfera de nitrógeno líquido o técnicas de molienda mecánica para la homogeneización 2-5. Como el músculo es un tejido altamente estructural lleno de proteínas de la matriz extracelular y contráctiles, inadecuado homogeneización mecánica conduce a un bajo rendimiento de ADN posterior, ARN o proteína. El método detallado aquí permite a las pequeñas cantidades de tejido de un músculo fuente para el uso en varias aplicaciones, y la inclusión de cryosectioning y la aguja trituración mejora la homogeneización mecánica para un mejor rendimiento de ARN.
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Protocol
Todos los animales procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Georgia Institucional Cuidado de Animales y el empleo en condiciones de uso de animales protocolo A2013 07-016 (Beedle).
1. La criopreservación del músculo esquelético no fijado
- Preparación
- Cortar el corcho en cuadrados pequeños (aproximadamente 1 cm x 1 cm) con una hoja de afeitar, escriba en el corcho con un marcador de punta fina que es resistente a 2-metilbutano para identificar el ratón fuente y el músculo, y haga un corte poco profundo (aproximadamente 1 mm) a través de la superficie superior. Inserte un cubreobjetos de plástico en el corte de utilizar para orientar el tejido. Repita hasta que un corcho está listo para todos los tejidos que se criopreservados.
- Obtener nitrógeno líquido, 2-metilbutano, resina de incrustación, termómetro de baja temperatura, corchos, herramientas de disección, y el ratón estudio.
PRECAUCIÓN: Líquido de nitrógeno es un gas comprimido que puede explotar si se calienta. Llevar bata de laboratorio, guantes de baja temperatura, y la protección facial al manipular el líquido nitrogen; en contacto con la piel o los ojos puede provocar quemaduras o congelación. 2-metilbutano es un inflamable, tóxico, salud y riesgo medioambiental. Use equipo de protección personal (bata de laboratorio, guantes, gafas de seguridad), abrir el recipiente de pasta en una campana extractora, transferir la pequeña cantidad necesaria para la congelación (normalmente de 200 a 400 ml) a un recipiente separado que puede ser bien cerrado, y evitar la inhalación . - La eutanasia a los ratones con un método aprobado de la eutanasia bajo anestesia. En pocas palabras, insertar el ratón en una cámara de inhalación con 2,5% de isoflurano en oxígeno de un vaporizador de isoflurano, espere hasta 20 segundos después de que el ratón deja de moverse para verificar el reflejo de pedal. Cuando el reflejo pedal es negativo, la eutanasia el ratón estudio realizado por dislocación cervical 6.
NOTA: los métodos de eutanasia requieren la aprobación del comité de ética institucional. - Retire la piel que recubre la extremidad posterior distal y cortar los tendones anterior distal justo encima del tobillo con punta fina dissetijeras cción. Agarre los tendones distales con unas pinzas finas y tire suavemente hacia arriba y hacia la rodilla mientras se corta la fascia lateral para liberar el músculo. Tire del músculo perpendicularmente desde la rodilla y hacer un corte final para cortar el músculo TA 7.
NOTA: El músculo TA se utiliza aquí como un ejemplo, pero cualquier músculo esquelético del ratón o el corazón puede ser sustituido por el TA en este protocolo en su caso a los objetivos experimentales del usuario. La única limitación es que un tejido debe ser lo suficientemente pequeño para lograr una rápida criopreservación en toda su profundidad; Se recomienda un tamaño máximo de tejido de 1 cm x 1 cm. - Repita con la otra pierna, y diseccionar a cabo ningún otro tejido para ser recogidos. Realizar la disección lo más rápidamente posible para limitar la degradación del tejido antes de la crioconservación.
- Oriente cada músculo para las secciones transversales en su corcho pre-marcado. Soportar el músculo perpendicular al corcho con el tendón distal tocar el corcho y la parte superior de la extensión del músculoponer fin a distancia, que se celebró en posición vertical por el cubreobjetos.
- Criopreservar todos los tejidos para el análisis histológico lo más pronto posible después de la disección, preferiblemente dentro de 5 min, pero definitivamente no más de 15 min de tiempo transcurrido desde la eutanasia del animal fuente.
- criopreservación
- Comience enfriar el baño de criopreservación cinco minutos antes del final de la disección. Verter 2-metilbutano en un vaso de precipitados de metal abierto a una profundidad de aproximadamente 3 cm. Verter nitrógeno líquido en un recipiente aislado a una profundidad de 2 a 4 cm. Ajuste el vaso de precipitados de 2-metilbutano en el nitrógeno líquido; el nitrógeno comenzará a hervir. Evitar las salpicaduras de nitrógeno en el vaso 2-metilbutano.
PRECAUCIÓN: Prepare la congelación de baño en una campana de humos o un área bien ventilada. - Inserte un termómetro de baja temperatura en el 2-metilbutano para controlar la temperatura y revuelva con frecuencia con un tenedor para asegurar un enfriamiento uniforme. Continuar en agitación y enfriamiento hasta el 2-methylbutane llega a -140 ° C, la adición de nuevo en nitrógeno líquido para el baño exterior como sea necesario.
NOTA: -140 ° C es la temperatura óptima para reducir al mínimo los artefactos de cristal de hielo en el músculo estriado; otros tejidos pueden criopreservar mejor a diferentes temperaturas (por ejemplo, cerebro, -90 ° C). - Aplicar resina incrustar solamente a la parte inferior 35 - 50% del músculo donde se encuentra con el corcho y de inmediato caer el corcho en el 2-metilbutano a -140 ° C. Rápidamente repetir para un máximo de 8 tejidos por lote congelación. Se agita durante 30 seg, raspando el fondo del vaso de precipitados para asegurar que los tejidos no se congelan en la solidificación de 2-metilbutano.
- Use un tenedor, cuchara ranurada o grandes pinzas para tirar de cada tejido del corcho 2-metilbutano. eliminar rápidamente el cubreobjetos, aplique el exceso de 2-metilbutano en el vaso, y luego dejar caer el corcho tejido en el baño de nitrógeno externa. Repita este procedimiento para todos los corchos que quedan en el vaso de precipitados.
- Transferir las muestras en nitrógeno líquido o en hielo seco paraun congelador a -80ºC para su almacenamiento.
- Si todos los tejidos se mantienen para la crioconservación, repita los pasos 1.2.3 a 1.2.4. Añadir adicional de 2-metilbutano al vaso de precipitados o nitrógeno líquido para el baño que sea necesaria y volver a enfriar a -140 ° C. Disponer de utilizado 2-metilbutano como residuos peligrosos.
- Comience enfriar el baño de criopreservación cinco minutos antes del final de la disección. Verter 2-metilbutano en un vaso de precipitados de metal abierto a una profundidad de aproximadamente 3 cm. Verter nitrógeno líquido en un recipiente aislado a una profundidad de 2 a 4 cm. Ajuste el vaso de precipitados de 2-metilbutano en el nitrógeno líquido; el nitrógeno comenzará a hervir. Evitar las salpicaduras de nitrógeno en el vaso 2-metilbutano.
2. Recoger criosecciones de Histología y ARN Aplicaciones
- Preparación.
- Pre-sopesar un tubo en autoclave DNasa / RNasa libre en una balanza analítica. A continuación, pasar a la cámara de criostato para pre-enfriar. Repetir hasta que los tubos están dispuestos para todas las muestras cryosection agrupados para ser recogidos.
- Para seccionar el músculo esquelético, confirme que la temperatura de la cámara del criostato es un -21 a la -22ºC por su termostato interno. Transferencia de los contenedores con los tejidos a ser cortado en la cámara y permitir que el recipiente (s) se equilibre a la temperatura criostato durante al menos 15 min antes de la apertura.
- Insertar una nueva hoja de criostato desechable. Como alternativa, retire la lámina existente, rociar con la solución de descontaminación RNasa, enjuague con ddH2O, y vuelva a insertar en el criostato enfriar. Rociar un paño limpio con un 70% de etanol y limpie con cuidado la plataforma de sujeción de la hoja y la cuchilla.
- Rociar un paño limpio con una solución de descontaminación RNasa y limpie los cepillos de criostato. Rociar un tejido con ddH2O, limpie los cepillos de nuevo y ponerlos en la cámara del criostato sobre una superficie limpia.
PRECAUCIÓN: La cuchilla criostato debe ser cubierta por el protector de dedos cuando no esté en uso. Además, la solución de descontaminación RNasa es tóxico y se congela para formar un precipitado en la cámara del criostato frío. Por lo tanto, manejar con cuidado y evitar su uso en la cámara del criostato.
- Rociar un paño limpio con una solución de descontaminación RNasa y limpie los cepillos de criostato. Rociar un tejido con ddH2O, limpie los cepillos de nuevo y ponerlos en la cámara del criostato sobre una superficie limpia.
- Dentro de la cámara del criostato, colocar una gota tamaño de una moneda (aproximadamente 300 l) de la incrustación de resina sobre un mandril espécimen caliente, establecer un corcho de tejido en la parte superior de la resina, presione hacia abajo, y luego ponga el mismo en la freezing ferrocarril o sobre un elemento de congelación rápida si está disponible.
- Después de que solidifica la resina de incrustación (blanco), añadir resina de incrustación adicional en la parte superior del corcho, alrededor de la parte inferior 35% del tejido y pulse el extractor de calor en la resina de inclusión para un congelamiento rápido para estabilizar mejor el tejido. Esperar 5 minutos antes de seccionar para que la resina se endurezca completamente.
- Asegúrese de que la pinza está en su posición más retraída, más alejada de la cuchilla. Insertar el mandril muestra de tejido en la pinza.
- cryosection preparación.
- Afloje el titular de soporte de la cuchilla, ajuste el ángulo de incidencia de la cuchilla a 10 ° (o un ángulo apropiado para el soporte de la cuchilla utilizada), y vuelva a apretar. Suelte el freno y girar la rueda de manos para disminuir el músculo hacia la cuchilla. Estimar la distancia más cercana entre el tejido y la cuchilla, a continuación, pasar el tejido lejos de la hoja y activar el freno de la rueda de mano.
- Afloje el leve ajuste de alturar y mover el soporte de la cuchilla hacia adelante o hacia atrás, respectivamente, si el extremo del tejido es más de aproximadamente 2 mm de la hoja o si la cuchilla golpea el tejido. Apretar y bajar el tejido de nuevo para comprobar la distancia de la hoja. Repita los ajustes hasta que la hoja es de 1 a 2 mm desde el extremo del tejido por estimación visual.
- Bajar el tejido hacia la cuchilla y evaluar ángulo de tejido para las secciones transversales. Bloquear el volante de mano y suelte la palanca de fijación de la muestra. Empuje la pinza hacia la izquierda o derecha hasta que la orientación horizontal del tejido es perpendicular a la hoja.
- Empujan la muestra de la abrazadera hacia arriba o hacia abajo para ajustar la orientación "y" de modo que los cortes de tejido serán perpendiculares al eje longitudinal del músculo. Apriete la palanca de fijación de la muestra.
- Utilice el curso y avance bien para avanzar en la muestra hasta que toque la hoja. Si la búsqueda de secciones de una profundidad tejido particular, restablecer la suma de espesores de sección a cero (la parte superior del tejido).
- Ajuste el criostato a la función de cortar con espesor de corte a 30 micras. Cortar y desechar las secciones hasta que se alcanza la profundidad preseleccionada para la recogida de tejidos (por ejemplo, 400 micras desde la parte superior).
- Recoger criosecciones para la extracción de RNA.
- Abrir el tubo de recogida de secciones y colocarlo cerca del soporte de la cuchilla. Use un cepillo de pre-enfriado, limpio para recoger cada sección, ya que se corta de la hoja y transferir la sección criogénica en el tubo. Repita hasta que las secciones agrupadas pesan 30 mg o se alcanza la profundidad deseada del tejido.
NOTA: Para un músculo tibial anterior de ratones adultos, la recogida de profundidad del tejido de aproximadamente 400 a 4.000 micras produce típicamente 25 - 40 mg. Con unas pinzas de metal para transferir tramos de tubo de recogida, no se recomienda que las secciones tienden a pegarse y formar grumos en la superficie metálica. - Si la incrustación de resina rodea la sección criogénica muscular, bloquee el freno de mano y utilizar una hoja de afeitar paraafeitar de pequeñas piezas de resina hasta que sólo quede una capa fina alrededor de la parte superior del músculo. resina Siempre corte con la cuchilla en ángulo lejos del músculo.
NOTA: Una capa delgada de la incrustación de resina no perjudica sustancialmente la preparación de ARN aguas abajo. Si más gruesa de resina incrustación está presente, use cepillos para molestar a la basura desde el músculo antes de mover la sección criogénica dentro del tubo colector. - Como alternativa, las secciones de la piscina en el soporte de la cuchilla y la transferencia a granel hasta el tubo de recogida.
NOTA: Sin embargo, este método tiende a ser más lento, y las secciones son más probable que se adhieren y aglutinarse, lo que puede reducir la eficiencia de la homogeneización de la aguja en pasos posteriores. - colocar rápidamente el tubo de sección criogénica agrupado en un tubo de equilibrio y registrar el peso analítico. Inmediatamente devolver el tubo a la cámara del criostato frío para mantener la temperatura cerca de la sección de -20 ° C. Calcular el peso de las secciones agrupados.
NOTA: Si el aislamiento de ARN se producirá el anuncioifferent día, almacenar el tubo cryosection agrupado a -80 ° C hasta su uso.
- Abrir el tubo de recogida de secciones y colocarlo cerca del soporte de la cuchilla. Use un cepillo de pre-enfriado, limpio para recoger cada sección, ya que se corta de la hoja y transferir la sección criogénica en el tubo. Repita hasta que las secciones agrupadas pesan 30 mg o se alcanza la profundidad deseada del tejido.
- Recoger cryosections para histología.
- Presione el botón de espesor de corte para seccionar y uso finas flechas para ajustar el espesor de la sección criostato a 7 m (u otro espesor de la sección apropiada, por lo general de 6 a 10 micras).
NOTA: Diluyente secciones (6-10 micras) se deben utilizar para aplicaciones histológicas para asegurar que los reactivos de tinción puede penetrar en la profundidad de la sección de tejido. Las secciones finas se pueden tomar de cualquier profundidad durante el cryosectioning, pero secciones más profundas se prefieren debido a la incrustación de resina, que aumenta con la profundidad del tejido, no perjudica la tinción histológica. - Cortar y desechar 4 a 7 secciones para obtener una superficie coherente, incluso tejido. Tome nota de la profundidad del tejido.
- Cortar una sección y orientarla en la superficie de soporte de la cuchilla. Recoge la sección tocando de forma rápida y suavemente con agua tibia (temperatura ambiente) portaobjetos de microscopioa la sección de soporte de la cuchilla. Devolver la diapositiva a la temperatura ambiente. Continuar hasta que se obtiene el número de diapositivas que desee. Tome nota de la profundidad final de tejido.
NOTA: La toma de una segunda sección (duplicado) para cada tejido se recomienda. - Con el corte completo, ponga el freno de la rueda lado, devolver el espécimen a la posición más posterior, y quite la pinza de sujeción del tejido. Utilice el elemento de calor criostato para fundir la resina incrustación sosteniendo el corcho tejido en el mandril de la muestra. Retire el tejido de corcho, secar con el tejido, y volver al almacenamiento.
- Repita desde el paso 2.1.2 para cada tejido restante. Permitir que se sequen durante 20 minutos después de que se monta el último tejido. A continuación, utilice diapositivas para histológico o la tinción de inmunofluorescencia o congelación a -80 ° C en una caja de portaobjetos hasta que se necesite.
- Presione el botón de espesor de corte para seccionar y uso finas flechas para ajustar el espesor de la sección criostato a 7 m (u otro espesor de la sección apropiada, por lo general de 6 a 10 micras).
3. Aislamiento de ARN a partir agrupado criosecciones
- La extracción de RNA
- tubo (s) se mueven de cryosections agrupados en hielo. Inmediatamente añadir unareactivo de extracción de ARN orgánico en una proporción de aproximadamente 1 ml de reactivo por cada 50 mg de peso sección criogénica, típicamente 600 l por tubo.
PRECAUCIÓN: reactivos de aislamiento de ARN son tóxicos, corrosivos, e irritante. Siga las instrucciones del fabricante para un manejo seguro. - Usando una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 18, dibujar el ARN extracción líquido y enjuagar las paredes del tubo hasta que todo el tejido se suspende en la solución. Trate de minimizar las burbujas de aire durante la homogeneización de la aguja.
- Use la punta de la aguja para triturar y dispersar cualquier cryosections agrupadas y piezas que se adhieren a la pared del tubo. Se tritura para homogeneizar la muestra mediante el paso hacia arriba y abajo a través de la aguja de cinco golpes, y luego reintroducir la muestra en hielo. Repita ambos pasos tres a cinco veces, o tantas veces como sea necesario para interrumpir todos los grumos y pasar la muestra fácilmente a través de la aguja.
- Retire la aguja de calibre 18 y reemplazarlo con una aguja de calibre 22. Con cuidado, triturate la muestra durante cinco golpes, y luego reintroducir la muestra en hielo. Repetir la trituración de tres a cuatro veces para lograr un homogeneizado de tejido muy finamente dispersa.
NOTA: Si las partículas de tejido comienzan a bloquear la aguja en la elaboración de la muestra, expulsar a todas las muestras de la jeringa y volver a la aguja de calibre 18 para una mayor homogeneización. Un paso trituración adicional con una aguja de 25 o de calibre 26 puede ser añadido para obtener el rendimiento máximo. Sin embargo, la aguja puede quedar obstruido por lo que hay un riesgo de derramamiento de la muestra. - Mover la muestra de hielo a temperatura ambiente. Incubar durante 5 min para interrumpir complejos moleculares.
- En una campana de humos, añadir 0,1 ml de 1-bromo-3-cloropentano (BCP) por 1 ml de reactivo de aislamiento de ARN utilizado (etapa 3.1.1), típicamente 60 l por tubo. Agitar vigorosamente a mano durante 15 segundos (no vórtice). Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 2 a 3 min. A continuación, se centrifuga durante 15 minutos a 12.000 x g y 4 ° C.
PRECAUCIÓN: - Recoger cuidadosamente la fase acuosa superior (incoloro) ARN que contiene y la transfiere a un tubo limpio. Añadir un volumen igual de etanol al 70% (en agua DEPC) y agitar para mezclar. Se incuba a temperatura ambiente durante un máximo de 10 minutos.
NOTA: la interfase media y fases inferiores de fenol-BCP se pueden procesar para el ADN genómico y de proteína, respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante o se recoge en un contenedor de desechos peligrosos fenol-BCP para su correcta eliminación.
- tubo (s) se mueven de cryosections agrupados en hielo. Inmediatamente añadir unareactivo de extracción de ARN orgánico en una proporción de aproximadamente 1 ml de reactivo por cada 50 mg de peso sección criogénica, típicamente 600 l por tubo.
- purificación de ARN.
- Siga las instrucciones del fabricante para la unión de la muestra, lavado y elución con variaciones menores 8. Por ejemplo:
- Colocar una alícuota de agua DNasa / RNasa libre en un baño de 37 ° C o una incubadora para pre-calentamiento para el paso 3.2.4.
- Añadir la muestra de ARN a partir de 3.1.8 anterior a una columna de purificación y se centrifuga la muestra durante 15 seca 12.000 xg a la temperatura ambiente. Verter el flujo a través de nuevo en la misma columna y re-centrífuga. Repetir una vez adicional para maximizar la unión de ARN, y luego desechar el flujo final a través.
- Realizar los pasos de lavado de acuerdo con las instrucciones del fabricante 8. Aplicar 700 l de tampón de lavado (sin etanol) a la columna, vuelta durante 15 segundos a 12.000 xg, y desechar el flujo a través.
- Añadir 500 l de tampón de lavado (con etanol) a la columna, vuelta durante 15 segundos a 12.000 xg, y desechar el flujo a través. Repita este paso una vez.
- Girar la columna vacía durante 1 min a 12.000 xg para secar la membrana.
- Transferir la columna de centrifugación a una RNasa limpia, libre de DNasa tubo. Añadir 40 l de agua pre-calentada DNasa / RNasa libre (de 3.2.1) para el centro de la membrana de la columna. A temperatura ambiente, se incuba durante 2 min y centrifugar durante 2 minutos a 12.000 x g.
NOTA: El volumen de elución de 40 l es de aproximadamente 1,3 l por mg de originalestejido para 30 mg de cryosections agrupados. Ajustar el volumen de elución según sea apropiado para diferentes pesos de los tejidos de partida, pero no reducen por debajo de 32 l. Una segunda elución, utilizando aproximadamente 0,7 l por mg de tejido original, se puede añadir para incrementar el rendimiento de ARN total. - Analizar el ARN (elución de la columna) para la concentración y pureza mediante un espectrofotómetro, electroforesis, y / o un Bioanalyzer. Almacenar el ARN a -80 ° C hasta que se necesite para aplicaciones aguas abajo, tales como la transcripción inversa para PCR cuantitativa 4.
NOTA: Un tratamiento con DNasa se recomienda antes de utilizar el ARN en las aplicaciones posteriores. Este tratamiento se puede realizar en algunas columnas de purificación de ARN antes de la etapa de lavado, en este punto específico siguiente elución de la columna, o en una parte alícuota de la ARN como el primer paso en cualquier aplicación de aguas abajo. El ARN debe ser estable durante varios años.
4. Análisis histológico mediante inmunofluorescencia Staining de criosecciones musculares
- protocolo de inmunofluorescencia simple.
- Utilice un bolígrafo hidrófobo dar la vuelta al grupo de secciones en cada diapositiva. deje caer suavemente PBS en el área de un círculo (aproximadamente 80 l de una pequeña área de superficie de hasta 500 l de una gran superficie), teniendo cuidado de no tocar los tejidos. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
NOTA: Si está utilizando diapositivas congeladas, eliminar diapositivas desde -80 ° C congelador y se incuba a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos para descongelar y seco, a continuación, seguir las indicaciones anteriores. Se necesitan al menos dos correderas: una diapositiva experimental que se incubó en anticuerpo primario y secundario; y se excluye una corredera de control para el que el anticuerpo primario, la "única secundaria" de control. - Inclinar la diapositiva para verter PBS. Añadir 5% de suero de burro en PBS (solución de bloqueo) a la zona de un círculo; tener cuidado para asegurar que las secciones de músculo no se sequen. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min (o hasta varias horas en una cámara de humedad).
- Preparar la solución de anticuerpo primario para analizar la regeneración muscular. Mezclar la solución de bloqueo, con un anticuerpo EMHC (01:40) y un anticuerpo ColVI (1: 1000). Preparar aproximadamente 150 l, 300 l o 500 l para pequeñas, medianas o grandes áreas de las diapositivas, respectivamente. Vortex durante 5 segundos y, a continuación, se centrifuga durante 2 minutos a 15.000 xg para sedimentar cualquier precipitado.
- Para las diapositivas experimentales, la punta de la diapositiva para verter la solución de bloqueo y añadir a continuación solución de anticuerpo primario 4.1.3. Para la corredera de distribución secundaria, la punta de la diapositiva para verter la solución de bloqueo y luego añadir solución de bloqueo fresca (sin anticuerpo). Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda a 4 ° C durante la noche.
NOTA: Cuando el pipeteado de soluciones de anticuerpos en portaobjetos, tire siempre líquido desde la parte superior del tubo de solución de anticuerpo primario, no interrumpir cualquier precipitado en la parte inferior del tubo. - Punta se desliza a verter solución. Añadir PBS gota a gota a la región de un círculo de cada diapositiva para lavar, punta para verterapagado, a continuación, agregar más PBS y se incuba durante 3 a 5 min. Repita para un total de tres lavados.
NOTA: El tiempo de lavado es bastante flexible y puede alargarse hasta 20 minutos si se desea. En general, el número de cambios de la solución es más importante que el tiempo. - Preparar la solución de anticuerpo secundario para todas las diapositivas (incluyendo la corredera de control secundaria) utilizando una dilución 1: 500 de anticuerpos secundarios rojo y verde fluoróforo acoplado para detectar IgG1 de ratón (EMHC) e IgG de conejo (ColVI) y 1: 10.000 dilución de DAPI nuclear manchar.
- Por ejemplo, mezclar 1 l de DAPI con 9 l de ddH2O para hacer una dilución 1:10 de DAPI. Entonces, para un volumen final l 500, agregar 1.0 l anti-ratón IgG1-roja + 1,0 l anti-IgG de conejo-verde + 0,5 l de 01:10 DAPI a 447.5 l de solución de bloqueo. Vortex para mezclar y centrifugar durante 2 minutos a 15.000 xg para sedimentar cualquier precipitado.
NOTA: Lo ideal sería que todos los anticuerpos secundarios debe ser de la misma especie hospedadora.
- Por ejemplo, mezclar 1 l de DAPI con 9 l de ddH2O para hacer una dilución 1:10 de DAPI. Entonces, para un volumen final l 500, agregar 1.0 l anti-ratón IgG1-roja + 1,0 l anti-IgG de conejo-verde + 0,5 l de 01:10 DAPI a 447.5 l de solución de bloqueo. Vortex para mezclar y centrifugar durante 2 minutos a 15.000 xg para sedimentar cualquier precipitado.
- Inclinar las diapositivas para verter fuera el último lavado PBS. Añadir solución de anticuerpo secundario para cubrir todos los tejidos. Cubrir las diapositivas para protegerlas de la luz y se incuba a temperatura ambiente durante 30 min.
NOTA: Todos los anticuerpos secundarios deben ser validado para tener reactividad cruzada mínima con otras especies en experimentos de doble etiquetado. - Se lavan los portas como se describe en 4.1.5. Después del último lavado, la punta de la diapositiva para verter el PBS y fijar el porta sobre un pañuelo de papel. Añadir 3 a 4 gotas de un medio de montaje acuoso a lo largo de un lado.
- Ajuste el borde de un cubreobjetos de vidrio sólo para el borde exterior de los medios de montaje. Con unas pinzas, baje lentamente el cubreobjetos hacia los tejidos, a continuación, suelte el cubreobjetos y golpear suavemente en su posición. Por último, presione suavemente cada esquina del cubreobjetos para estabilizarlo.
- Proteger a las diapositivas de la luz y se almacena a 4 ° C hasta su uso.
NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo, que aplica una fina capa de esmalte de uñas a lo largo del borde de THe cubreobjetos para ayudar a prevenir la diapositiva de secado.
- Utilice un bolígrafo hidrófobo dar la vuelta al grupo de secciones en cada diapositiva. deje caer suavemente PBS en el área de un círculo (aproximadamente 80 l de una pequeña área de superficie de hasta 500 l de una gran superficie), teniendo cuidado de no tocar los tejidos. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- La evaluación histológica.
- Imagen de las diapositivas utilizando un microscopio confocal de epifluorescencia o con filtros adecuados para detectar EMHC (rojo); ColVI (verde); y núcleos (azul) DAPI-manchado, normalmente utilizando un objetivo 20X 1,5.
- Confirmar que la señal fluorescente a partir de diapositivas experimentales es diferente de la corredera de control secundario para demostrar la especificidad de la detección EMHC y ColVI 4.
NOTA: fibras regeneradoras EMHC positivos deben ser visibles desde aproximadamente 2 a 7 días después de una lesión muscular y de forma variable en ratones con distrofia muscular. El colágeno VI está presente en la matriz extracelular que rodea las fibras del músculo, vasos sanguíneos y los nervios y en los haces de tejido conectivo más grandes de peri y epimisio. DAPI mancha nuclear es útil para identificar las fibras musculares con núcleos centrales frente a núcleos periféricos que indican regeneración de la fibra, y la presencia de infiltrating células. fibras necróticas o heridos pueden manchar débilmente con el anticuerpo secundario IgG de ratón debido a la detección de IgG endógena que penetra en las fibras a través de las membranas musculares dañadas. - Para cuantificar la regeneración, tomar la superposición de imágenes de microscopio con cada filtro fluorescente en toda la imagen. Fusionar las imágenes EMHC, ColVI y DAPI para cada lugar y luego alinear las imágenes para reconstruir un mapa de toda la sección 1,5.
- El uso de software de análisis, contar el número de fibras EMHC positivos y el número de fibras totales para calcular reciente regeneración (fibras totales 100 * (# EMHC + fibras / #)). Además, contar el número de fibras nucleadas central de las fibras totales para medir la regeneración durante un período más largo (fibras 100 * (# NC fibras + / # total)) 1,5.
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Representative Results
RNA cryosection muscular es de alta calidad y proporciona un rendimiento suficiente para la mayoría de aplicaciones
Los análisis de dieciséis preparaciones de ARN de músculo esquelético se muestran en la Tabla 1 usando 19,4 a 41 mg de músculo agrupada tibial anterior (TA) a partir de 8 ratones de control. Tanto la izquierda (L) y derecho músculos (R) TA se prepararon en los experimentos de regeneración con los músculos recogidos 3 días después de la inyección intramuscular longitudinal de 25 l de solución salina o cardiotoxina 10 M a causar lesión muscular utilizando métodos informó anteriormente 1. Como se muestra en la Tabla 1, las / 280 ratios de A260 para el músculo RNA cryosection son típicamente cerca de 2 o mayor en estas muestras representativas. Como RNA "puro" se considera que tiene A260 / 280 de 2,0 y A260 / 280 de 1.8 a 2.2, la pureza de las muestras de ARN sección criogénica es excelente 9. La recuperación total de ARN fue típicamente over 10 g por muestra con rendimientos de 0,18 a más de 1 g de ARN total por mg de tejido de partida, proporcionando el material suficiente para la mayoría de las aplicaciones posteriores. En particular, la concentración de ARN, el ARN total extraído, y el rendimiento de ARN por mg de tejido a partir de los músculos TA de 3 días después de la lesión-toxina fue significativamente mayor que desde TAS inyectados con solución salina. Esto sugiere que hay homogeneización se mejora cuando la estructura muscular es interrumpido por lesión extensa y / o que hay un aumento en la transcripción de genes y / o la estabilidad del ARN en el músculo de regeneración 3 días. La persistencia de la calidad del ARN se evaluó por simple 1x TAE / electroforesis en gel de agarosa al 1,5% de 1 l de músculo RNA cryosection después de las muestras se almacenaron a -20 ° C durante 18 meses. Prominentes 18S y 28S rRNA bandas son todavía evidente en las muestras que demuestran la alta calidad de ARN, incluso bajo condiciones de almacenamiento no óptimas (Figura 1A).
Muscular ARN cryosectionsoporta aplicaciones posteriores
Un microgramo de RNA por muestra cryosection agrupada se trató con ADNasa y se transcribió inversamente a partir de oligo dT. Después del tratamiento de RNasa, el volumen total de la transcripción inversa de ADNc fue de 30 l. PCR no cuantitativa simple con exceso de amplificación se llevó a cabo para confirmar la viabilidad del cDNA. Factor de miogénica regulador 4 (MRF4), un factor de transcripción upregulated con la diferenciación muscular, se amplificó usando cebadores de ratón se informó anteriormente, el sentido 5'-CTACATTGAGCGTCTACAGGACC y antisentido 5'-CTGAAGACTGCTGGAGGCTG 10, a partir de 2 l de plantilla utilizando PCR estándar. No era robusto, amplificación específica del fragmento pb MRF4 234 de ambas muestras de ADNc TA izquierdo y derecho, pero no RT- (RNA incluido, pero no la transcriptasa inversa), RT ddH 2 O (transcripción sin molde de ARN inverso), o ddH 2 O controles de PCR (Figura 1B).Las mismas muestras se realizaron por triplicado para control de referencia MRF4 y mOaz1 4 cuantificación utilizando amplificación relativa y referencia de fluorescencia pasiva en un sistema de PCR en tiempo real. MRF4 se expresó en 0.097 veces en el TA derecho toxina inyectada en comparación con el TA izquierdo inyectó solución salina, calculado por el método ΔΔCt 4. Esto es similar a los informes anteriores de baja expresión MRF4 3 días después de la lesión toxina debido a una pérdida de fibras musculares maduras 11. Para comparar la consistencia de los ARN cryosection para la PCR cuantitativa, los valores de Ct se compararon para el gen de referencia mOaz1. De seis muestras, mOaz1 transcripción se detectó con un Ct promedio de 17.242 ± 1.483 sd, mientras que la media Ct era 36.332 ± 3.61 SD en las muestras de control RT- (n = 4). La agrupación apretada de señales mOaz1 Ct a través de muestras sugiere que el ARN aislado de cryosections músculo TA realiza como se esperaba en los análisis de la expresión del ARN de aguas abajo.
Ejemplos de tinción de inmunofluorescencia indirecta de 7 micras tibialis secciones de músculo anterior de ratones de control littermate 3 días después de la inyección de la toxina se muestran para detectar fibras en regeneración (Figura 2). Ambas secciones se recogieron a partir de músculo de menos de 150 micras de la región a ser utilizado para el análisis de RNA a una profundidad de 4.5 a 4.6 mm de la superficie del músculo proximal. miosina de cadena pesada embrionaria (EMHC, rojo) detecta fibras regeneradoras de colágeno VI (ColVI, verde) esboza las fibras musculares, y las manchas DAPI núcleos de helio azul, según el protocolo 4. Las regiones con infiltrado nuclear concentrado (señal azul) indican los sitios de lesión de la toxina , como es evidente por la activación de las células musculares de nueva regeneración positivos EMHC. mapas sección integrales como este ejemplo se utilizan para la cuantificación de la regeneración mediante el cálculo de la proporción de embryonic fibras de miosina de cadena pesada que expresan (rojo, recién regenerado) o fibras nucleadas centralmente como se informó anteriormente 1. En particular, no es sorprendente que poco daño en el músculo TA en la figura 2A. Si bien existe una variación entre las inyecciones, las inyecciones de toxina típicas afectan a una proporción mucho más grande del compartimento muscular 1, como se muestra en la Figura 2B. Por lo tanto, este análisis histológico sugiere que la lesión de la toxina en la figura 2A fue mínima y proporciona una herramienta importante para interpretar los datos de expresión génica de la muestra de ARN cryosection músculo contigua. Si todo el músculo se había utilizado para la preparación de ARN por métodos de molienda estándar, la inesperada lesión pequeña zona de esta muestra lo haría un valor atípico que sesgar los análisis posteriores. En su lugar, el emparejamiento de cuantificación histológica del mismo músculo permite la medición directa de la extensión de la lesión de las secciones adyacentes. Esto permite el uso de incluLos criterios de / exclusión para garantizar que todas las muestras incluidas en el ARN aguas abajo análisis de satisfacer un umbral mínimo de lesión o la normalización de los análisis de ARN de acuerdo con el tamaño de la lesión.
Figura 1: Evaluación de la Calidad de ARN a partir de criosecciones musculares agrupadas. A) 18S y 28S del RNA ribosomal bandas son prominentes en ARN a partir de criosecciones musculares agrupados 18 meses después de la preparación de ARN. B) No-PCR cuantitativa para MRF4 después de la transcripción inversa. 200 y 300 pb bandas de una escalera de ADN se indican. RT-, inversa de la reacción de transcripción con la plantilla de ARN, pero no la transcriptasa inversa. RT-H2O, la transcripción inversa con ddH2O, sin molde de ARN. H 2 O, no plantilla de control PCR con ddH 2 O. En estos experimentos, la toxina se inyecta en el tibial anterior derecho (RTA) y wa salinoss inyecta en la izquierda (LTA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: muestra histológica Maps para estudios de regeneración del músculo. A, B) mapas Compiladas de solo tibialis secciones de músculo anterior 3 días después de la inyección de la toxina que muestra ejemplos de pobre (A) y normal (B lesión inducida por toxina). regiones en caja blancos de cada mapa de secciones se muestran como imágenes en los recuadros para una mayor visualización de ampliación, rojo, la miosina de cadena pesada embrionaria; verde, colágeno VI proteínas de la matriz extracelular; azul, la tinción DAPI nuclear. Barra de escala, 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Representante ARN rendimiento y pureza Las mediciones de criosecciones musculares agrupadas. Dieciséis tibial anterior (TA) se seccionaron los músculos y las muestras se procesaron cryosection agrupados para el ARN. ARN purificado (1 l) se analizó con un nanospectrophotometer. estadísticas de la columna se realizaron en una hoja de cálculo, comparaciones de grupos se realizaron utilizando el software estadístico.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cork | VWR Scientific | 23420-708 | Cut into small squares with a sharp blade. |
| Plastic coverslip | Fisher Scientific | 12-547 | Used to orient the muscle during freezing. |
| Low temperature thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631-4L | Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet. |
| Embedding resin: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Other embedding resins can be substituted for cryomatrix. |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 with disposable blade carrier | Any working cryostat should be sufficient for the protocol. |
| Disposable cryostat blade | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used. |
| RNAse decontamination solution: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS64 | |
| Paint brush | Daler Rowney | 214900920 | Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies. |
| Razor blade | VWR Scientific | 55411-050 | |
| Microscope slide | VWR Scientific | 48311600 | |
| RNA organic extraction reagent: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle. |
| 18 gauge needle | VWR Scientific | BD305185 | |
| 22 gauge needle | VWR Scientific | BD305155 | |
| 26 gauge needle | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol. |
| 1 ml syringe | VWR Scientific | BD309659 | For very high value samples, a Luer-Lok syringe is recommended (e.g., VWR BD309628). |
| 1-bromo-3-chloropentane (BCP) | Sigma | B9673 | |
| For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water. |
| For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water. |
| RNA purification kit: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Final steps of RNA preparation. |
| DNase/Rnase-free water | Gibco | 10977 | DEPC-treated water can also be used. |
| Spectrophotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications. |
| Hydrophobic pen | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS for immunofluorescence protocol. |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence. Normal goat serum can also be used. |
| eMHC antibody | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| Collagen VI antibody | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Aqueous mounting media: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties. |
| Glass coverslip | VWR Scientific | 16004-314 | Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl |
| Image analysis software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, or more advanced products | Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process; e.g., ImageProPremier. |
| Merge and map section images: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated. |
| reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used. |
| Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system | Promega | M8298 | Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead. |
| SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments |
| Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |
References
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