Summary
我们提出了一个协议官能玻璃与由流体脂质双层包围的纳米蛋白贴剂。这些基材与先进的光学显微镜兼容，并有望作为细胞黏附和迁移的研究平台。
Abstract
目前，处于钝化表面的细胞生物学研究的海洋产生黏附蛋白岛的有序阵列相当大的兴趣。在过去几年里，它已成为越来越清楚地看到活细胞反应，不仅能呈现给他们的分子的生化性质，而且这些分子的显示方式。创建蛋白微图案因此现在在许多生物学实验室的标准;纳米图案也更方便。然而，在细胞间相互作用的背景下，有必要图案不仅蛋白质，而且脂质双层。这种双PROTEO脂质的图案至今没有得到方便。我们提供了一个浅显的技术来创建支持玻璃蛋白质纳米点，提出了一种方法，用支撑脂双层（SLB）回填点间的空间。从示踪剂的光漂白包括在SLB荧光脂质，我们证明了双层的-PL表现出相当大的ANE流动性。用荧光基团功能化的蛋白点，使我们能够像他们，并表明他们在规则六边形网格排列。典型的点尺寸是大约800nm和这里展示的间距为2微米。这些基板有望成为用于细胞粘附，迁移和机械 - 感测研究，作为有用的平台。
Introduction
细胞粘附通过专门的细胞粘附分子（凸轮），蛋白质存在于细胞膜，其能够在细胞外基质或在另一细胞结合到其对应的发生。上粘附的细胞，最粘附分子包括整联无处不和钙粘蛋白，在簇1中的形式存在。 T淋巴细胞（T细胞）与抗原呈递细胞（的APCs）的相互作用提供的在两个小区之间的界面形成受体簇的重要性特别引人注目插图 - 通常被称为免疫突触。在形成与充当信令的平台2，3，4，并最终集中的T细胞形式微米尺度簇的表面上的APC，T细胞受体（TCR）的第一接触，以形成一个较大的中心超分子簇（CSMAC ）小姑娘= “外部参照”> 5，6，7。最近，已表明在APC上侧，所述TCR的配体也聚集8。
在T细胞的APC相互作用，混合动力系统的部署，其中APC通过与相关蛋白官能化的人造表面模仿的上下文中，已大大提高了我们突触接口2，3，4，5，6，7的理解。在这种情况下，它是设计APC模拟表面可捕捉到目标小区的一个或多个方面密切相关。例如，如果配体是在支持的脂质双层接枝，它们可以以双层的平面扩散，模仿APC表面上的情况，并在同一时间允许的形成CSMAC 6,7。类似地，APC上的簇已经通过在聚合物9，10，11，12，13，14的海创建配体的岛屿模仿。然而，这两个功能迄今尚未合并。
在这里，我们描述了一种新技术，以创建由脂质双层与扩散脂质包围抗CD3（靶向TCR复合物的抗体）的纳米点。双层使用朗缪尔-布罗杰特/朗缪尔-谢弗技术7，15，16沉积并如果需要的话，可以用一个特定的蛋白质被官能化-例如，T细胞整联配体（称为ICAM1）。此外，抗CD3蛋白点腠LD与另一种抗体或CAM来代替。虽然我们选择的蛋白质如T细胞黏附的研究平台将来使用，这里详细的策略可以适用于任何的蛋白质和DNA，甚至。
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Protocol
1.清洗玻璃盖，幻灯片和观察室
- 安排在诸如聚四氟乙烯（PTFE）由惰性材料制成的多滑动托盘玻璃盖滑动。
- 浸入表面活性剂溶液与滑动托盘和观察室（推荐用于清洁石英比色杯中是合适的任何产物）。
- 使用在室温下30分钟的表面活性剂溶液的超声波浴，超声处理（20和30℃之间）。
- 漂洗用超纯水5倍（18.2MΩ.cm，0.059μS/ cm）的。
- 超声处理中，在室温下30分钟表面活性剂溶液（20和30℃之间）。
- 冲洗用超纯水10倍。
- 重复步骤1.5和1.6的两倍。
- 储存在室温下（20和30℃之间）的水长达一周。
2.蛋白质纳米点的制备
- 珠沉积
- Deposi吨悬浮液的以15度的倾斜保持二氧化硅珠（2％V / V，70μL）通过在盖滑动滴（24×24毫米，厚170微米）。
- 让该悬浮液散布约1分钟，同时以90°每隔15秒翻转玻璃。
- 允许液体在环境条件下蒸发。
- 储存在清洁的玻璃或PTFE室中为2天环境条件。
- 的铝沉积
- 放置一个射频内的载玻片（2.1节中制备）（RF）磁控溅射设备8，在旋转台在约105 mm处的铝（99％）的距离：硅（1％）的目标。
- 使用涡轮分子泵将淀积室抽空到2.6×10 -4 Pa以下。这一步对于去除可能的气体杂质重要。
- 与0.8帕（6.6毫托）的压力下的10sccm的助熔剂引入纯氩气气氛（5N，99.999％）。
- 交换机上的RF功率发生器。
注意：在此，使用400-600W¯¯射频功率的在13.56MHz频率的典型范围。 RF发生器一起使用以电容耦合等离子体模式中的匹配网络。反射功率被监控，并且使用网络适配最小化。 - 等离子体稳定后，溅射2分钟保持关闭，以从靶的表面除去可能的杂质快门。
- 打开快门并允许溅射继续60分钟，在玻璃上沉积滑动铝至厚度为200纳米。
- 切断氩气的流动，关闭闸阀来隔离从沉积腔室中的涡轮分子泵和排气用干净n中的腔室itrogen获得了房间的压力。回收的铝 - 包被的载玻片。存储长达一个月的环境条件下，清洁和密封的玻璃或PTFE框。
- 有机硅烷的气相沉积
- 沉浸在步骤2.2.6在超纯水中，在室温下和超声处理在超声浴中制备的30秒铝包覆滑动件（50 W，50/60赫兹，20和30℃之间）。
- 存款0.5 mL，在干燥器的底部（3-氨基丙基） - 三乙氧基硅烷（APTES）的。
注意：APTES为有机硅烷，其蒸发容易且是有毒的。 APTES只应在流罩和手套进行处理。 - 把玻璃载片（在2.3.1的方法制备）在干燥器内的陶瓷网格和地点。
- 干燥器连接到隔膜泵和在最大功率下运行30分钟，以产生低真空。
- 合上干燥器的阀并关闭泵。
- 加热干燥器至约50℃，持续1个小时。
- 打开干燥器和收集的幻灯片。
- 转移到另一个清洁干燥器中储存在室温下（20至30℃）达48小时。
- 蛋白的第一层的沉积 - 用生物素标记的牛血清白蛋白（BSA - 生物素）
- 放置在PTFE支撑在第2.3节中制备的载玻片中的一个。
- 存款1毫升溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS）25微克/毫升BSA - 生物素的。留在室温下（20至30℃）30分钟。
- 用PBS冲洗10次。在4℃下存储最多24个小时将样品从光源远。
- 铝掩模的去除
- 孵育载玻片在NaOH在PBS过夜，在室温（20至30℃）溶液（通过滴加1M NaOH中的制备约100毫升PBS中，以得到pH≈12）。
警告。氢氧化钠具有腐蚀性，应使用手套来处理。 - 冲洗在超纯水中的10倍。
- 孵育载玻片在NaOH在PBS过夜，在室温（20至30℃）溶液（通过滴加1M NaOH中的制备约100毫升PBS中，以得到pH≈12）。
3.支持的脂质双层的沉积（SLB）
- 清洁朗缪尔槽
- 在使用泵的朗缪尔槽的PTFE外壳除去水。
- 清洁用氯仿中浸过的无绒无纺一次性毛巾。
警告。氯仿是有毒的，并应在通风良好的区域进行操作，用掩模（或下一个流罩）中，用合适的手套。 - 清洁4次用微温的超纯水（40〜50℃）。
- 清洁至少6次用冷超纯水。
- 第一脂质层的沉积
- 放置PTFE托盘在朗缪尔槽的PTFE外壳，然后用超纯水填充它。
- 使用朗缪尔装置的控制软件来设置所测量的压力为0 mN / m的。
- 使用气密的玻璃/金属注射器以沉积1mg / mL的脂质溶液的30微升（1，2- dioleoyl- SN中的水的表面上-glycero -3-磷酸胆碱（DOPC）的氯仿溶液）。将氯仿蒸发和脂质分子自发形成一个单层。
- 使用控制软件通过关闭PTFE屏障直到所希望的压力（DOPC 27 mN / m的）达到以压缩脂质单层。
- 使用控制软件浸在节2.5.2制备成使用机动夹具的PTFE外壳中的载玻片上。
- 保持滑动，在夹具，垂直于空气 - 水界面。使用控制软件通过接口，以提高它慢慢（15毫米/分钟），同时保持恒定的压力在27 mN / m的。
- 在干燥的环境的地方或者立即使用或储存于室温下（20和30℃之间）至24个小时。
- 第二脂质层的沉积
- 维持朗缪尔槽的表面压力在27 mN / m的所需的值。压缩使用朗缪尔设备和/或控制软件添加脂质少量以实现期望的压力。
- 放置携带脂质单层，在节3.2.6制备的，水平的水的表面上的玻璃玻片。确保每个滑动是浮动的PTFE托盘的上方。
- 推玻璃向下滑动，一次一个滑动，到使用PTFE或金属镊子，使得它们被浸没在水中其相应的PTFE托盘。避免倾斜的幻灯片，同时推动。
- 使用PTFE或金属镊子包含幻灯片的PTFE托盘转移到填充有超纯水确保幻灯片不暴露于空气中的结晶器中。
- 使用PTFE或金属镊子来传输，而工作水下，双层涂覆的玻璃载片进观察室中。
注：观察腔室放置在水中结晶内部。观察室被定制，并且由PTFE环的用橡胶垫圈的ð钢外壳，该可组装的水下，使水密室，其底部表面从预先涂覆有脂质双层载玻片制成。 - 合室中，同时继续在水下工作，并确保约1mL的水被截留在室的内部。
- 就拿组装室出来的水。请确保它是防水的和无泄漏。
- 通过添加和删除的PBS中的10倍500μL取代1mL的存在于与PBS的观察室的超纯水。确保该室是从未缺乏液体。
- SLB封闭步骤
- 在包含在3.3.6节中制备的载玻片上的观察室引入100微克/毫升的牛血清白蛋白（BSA）和孵育在室温下（20和30℃之间）30分钟。
- 通过删除和添加的PBS中的10倍500μL冲洗双层。该双层可在4℃下保持24个小时。
4.功能化与配体
- 在2μg/ mL的添加荧光或非荧光中性（NAV，抗生物素蛋白的去糖基化版本不在pH 7充电）到含有在室温下在部分3.4.2制备30分钟的滑动件（20和30°之间的腔室C）。
- 通过添加和删除的PBS中的10倍500μL冲洗。
- 在2μg/ mL的生物素化的添加抗CD3到含有在3.4.2节中制备的载玻片室中。对于SLB所述点的双官能化，以5μg/ mL的（这里，双层由DOPC的次氮基三乙酸（NTA）的脂质的+ 1％）添加的Fc-ICAM1 His标签。留在室温下（20和30℃之间）30分钟。
- 通过添加和删除的PBS500μL的10倍冲洗
- 通过添加和移除细胞培养基的500微升10倍替换细胞培养基的PBS（PBS + 0.1％BSA）。
- 离开细胞培养基的200微升的chambeR 2与滑动。
- 添加细胞前，放置室，用于在37℃下10分钟。
5.细胞沉积（详见参考文献7）
- 仔细沉积400μL细胞悬浮液的腔室中。温育30分钟将细胞在37℃。
- 固定用多聚甲醛的2％（PFA）的细胞在37℃下15分钟。通过反复删除和添加的PBS的500微升替换用PBS PFA。
6.观察
- PROTEO脂质的纳米图案和SLB流动性
- 使用适当的照明波长（639纳米）和滤波器立方体使用荧光显微镜图像在落射荧光模式的蛋白质图案（ 例如这里，EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688）。
注：该信号的强度可以被量化以估计内部和外部点的蛋白质的量。使用适当的照明波长（330纳米）和fILTER立方体图像双层（BP12分之365，FT 395，LP 397），这似乎与亮暗孔。 - 使用连续光漂白（CPB）技术13,15以测量示踪剂的脂质双层中的扩散常数。这一观察刚沉积SLB后优选由。
注意：为了量化扩散常数，两个参数在CPB方法测定：将染料（拉紧）和周围的漂白区（TAUD）形成晕圈的荧光分布的衰减长度的特定漂白时间。首先是通过在照明场的期间CPB过程中心绘制的荧光强度随时间的变化而获得。第二个是通过在照射区（在达到稳态后平均超过12行和第5个图像）的边缘绘制的强度分布而获得。曲线被装配以获得绷紧和TAUD。扩散常数由TA给出UD 2 /拉紧（D =
）。
- 使用适当的照明波长（639纳米）和滤波器立方体使用荧光显微镜图像在落射荧光模式的蛋白质图案（ 例如这里，EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688）。
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Representative Results
的荧光图像进行分析，以测量点的间距和尺寸。典型间隔被发现是1900±80 nm和典型点大小为600±100纳米（ 图1G）。的间距用的用于掩模珠的大小设置。的点尺寸是由珠尺寸以及沉积条件设定。 SLB被唯一地围绕蛋白质点和不淀积在它们（ 图2），在SLB成像通道看到的孔，并在NAV成像通道看到的点之间的完美的互补性。连续光漂白数据的分析表明，在该图案化双层中的脂质保持流体和具有5平方微米/秒（ 图3）的典型扩散常数。
图1：的制造步骤的示意图。 （ 一 -7乇，氩气流为10sccm，处理压力6.2毫乇，在5kV的加速电压成像的初始压力被废除。图像确认与珠粒排列在玻璃载片上的单层中心六边形格子铝沉积之前光学显微镜（不包括图像）制成观察。 （b）中的切除原发珠掩模之后通过溅射沉积铝创建二次掩模。 （c）中的有机硅烷和BSA-生物素虽然二次掩模的沉积。 （d）中的铝除去露出BSA-生物素的纳米点。 SLB的（e）中沉积。 （F）结合NaV的到BSA-生物素。 （G）的结合抗CD3对资产净值。插图示出了纳米点阵列的落射荧光图像。在这里，资产净值荧光标记。典型点大小为600±100nm并且典型间距是1900±80纳米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：纳米点和SLB图案的互补性。 （A，B）的荧光的NaV纳米点和SLB与荧光示踪剂脂质的落射荧光图像。 （ 三 ）SLB（绿色）的海NaV的点（红色）的合成图片显示的NaV和SLB的完美互补。在插图中的快速傅立叶变换（FFT）图像指示长程有序。比例尺：4微米。rge.jpg”目标=‘_空白’>点击此处查看该图的放大版本。
图3：在SLB脂质扩散的定量。漂白前一个SLB（a）的落射荧光图像。蛋白质点出现在脂质的海亮暗洞。场光阑限制了照明区域。 （b）用于50秒连续漂白后的SLB落射荧光。由场膜片限定的区域内部的卤素可见指示脂质是移动的。比例尺：10μm左右。 （c）中沿场光阑（顶部）和强度随时间期间搁浅处理（底部）的衰减的边缘的平均强度分布。该数据被分析以提取扩散常数，其通常为5平方微米/秒。
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Discussion
上述方案中的关键步骤是通过一个支撑脂双层相关的蛋白质纳米点或这些点周围的空间的回填的形成。相对于蛋白质纳米点的第一个关键步骤是胎圈掩模的制备方法。盖滑动的清洁是至关重要的。将载玻片需要与被推荐用于清洗石英比色杯中，或用氧等离子体的洗涤剂溶液中或者清洗。其它清洁技术，如浸渍在乙醇或异丙醇处理不会使玻璃充分亲水，并因此不支持大覆盖珠单层的形成。与此同时，滑动表面需要与由朗缪尔-布洛杰特法7，15，16形成的SLB的后续步骤兼容。下一关键步骤是a的沉积和去除luminum。如果沉积是通过溅射技术，如在这里完成，目标应用硅酮进行掺杂（在1％）。否则，如果目标是由纯铝制成，沉积层是硬与碱金属氢氧化物溶液，以除去如上述那样，可能是由于氧化铝和沉积的铝层和载玻片基板之间相互渗透的形成。沉积的持续时间决定了蛋白质点9，不过，在这里我们有一个单一的沉积时间，因此单点的大小工作的大小。所述样品可以为铝沉积之后数月环境条件下和BSA-生物素的沉积之后被存储一个星期左右。
第二个关键步骤涉及SLB的沉积。玻璃盖滑的清洁又是一个极其重要的一点。如为任何朗缪尔 - 布洛杰特沉积工作的情况下，所用的所有材料应当由玻璃或宝lytetrafluoroethylene（PTFE），应该是一尘不染。第一脂质单层的沉积之后，盖幻灯片可存放一两天，但第二单层的沉积后，他们需要立即使用。
虽然我们已经证明用于在T淋巴细胞粘附研究使用创建抗CD3纳米点的协议9， 图13，该过程是高度灵活的，并且可以适用于任何生物素化的蛋白。脂双层的组成可以容易地改变，它如果需要，可以进一步官能化。要考虑的一个很重要的一点是蛋白质的可能非特异性吸收，特别是对周边的点脂质双层。
该技术的主要限制来自使用胶体珠自组装的用于主掩模。作为一个自下而上的技术，全体的所有这些方法的问题例如，缺乏灵活性和完全控制的图案形状。图案晶格必然反映了珠掩模的对称性，因此总是六边形。图案基序的形状是圆形，并通过胎圈大小的组合，并且铝沉积9，13的持续时间来确定。控制点大小的替代技术也被建议14，17，18。
基板纳米图案与蛋白质，蛋白片段或肽已经在过去被广泛地用于探测细胞表面的相互作用，特别是粘合性19和迁移20。开创性的工作表明，形成组织细胞不能上的图案流传着一个间距大于给定的阈值21以上，进一步调查抄结婚即这种现象的长度尺度是由talins，这是在整联蛋白受体链接到肌动蛋白骨架22器乐的大小设置。然而，在所有这些研究中，蛋白质挂钩黄金纳米粒子，是自己固定在玻璃，。
在T细胞中，PROTEO脂质的膜，典型地模仿抗原呈递细胞的上下文中，已被广泛用于了解T细胞功能6的基本方面。巧妙的纳米图案化技术已被用于产生具有金属阻挡层分离的蛋白质官能SLB贴剂，已经提供了深入了解T细胞/ APC接口23的结构和连接畜栏。这种纳米图案化不过是从这里提出的蛋白质纳米点完全不同。近日，采用蛋白质功能脂质的化学键创建纳米团簇SS =“外部参照”> 3，其阐明了受体聚集的结果的光。其优点是，不同于目前的情况下，集群可以原则是自己移动。然而，这种自发形成的簇一定低很好地控制在尺寸和密度方面比这里描述的预形成的蛋白质纳米点。
我们设想，纳米点装饰的SLB这里介绍的蛋白可用于研究细胞 - 细胞粘附的不同方面。出现的一个明显的问题是，是否如以上对于组织形成细胞19所描述，淋巴细胞也具有固有的长度尺度与粘附相关联。初步结果似乎表明，至少当粘合通过TCR复合物介导，配体而非间距的密度是用于扩展和活化10，11，12的定义参数
这些PROTEO脂质的图案的两个主要优点是具有先进的光学显微镜和易于制备的，这使得它们在使用和掷应用程序兼容的基材的相容性。随后于铝沉积，所有的准备步骤可以在标准湿实验室工作台上进行。在将来，可以设想的是，镀铝和在一个专门的工厂生产玻璃支持的珠掩模被转移和存储在生物实验室用作在需要时。鉴于此，我们认为，这些基板有可能成为首选的平台，研究与控制的纳米图形化PROTEO脂质的膜细胞的相互作用的潜力。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢洛朗Limozin，皮尔·迪拉德和阿斯特丽德·瓦赫勒继续有关手机应用富有成效的讨论。我们也从PLANETE洁净室设备感谢弗雷德里克·贝杜他与SEM观察的帮助。这项工作是部分由欧洲研究委员会通过批准号307104 FP / 2007-2013 / ERC资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | ||
| Observation chamber | Home made | ||
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 | |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | ||
| Desiccator | Labbox | ||
| Crystallizer | Shott | ||
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 | |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 | |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | ||
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 | |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 | |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C | |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 | |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 | |
| Film balance | NIMA | Medium | |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system | |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | ||
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
References
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