Summary
Wij presenteren een protocol glas functionaliseren met nanometrische eiwit pleisters omgeven door een vloeibare lipide dubbellaag. Deze substraten zijn compatibel met geavanceerde optische microscopie en zullen naar verwachting om te dienen als platform voor celadhesie en migratie studies.
Abstract
Momenteel is er veel belangstelling voor het creëren van geordende reeksen van kleefeiwit eilanden in een zee van gepassiveerde oppervlak voor celbiologische studies. In de afgelopen jaren is het steeds duidelijker dat de levende cellen te reageren, niet alleen om de biochemische aard van de aan hen moleculen, maar ook om de manier waarop deze moleculen worden gepresenteerd te worden. Creëren eiwit micro-patronen is derhalve nu standaard in veel biologische laboratoria; nano-patronen zijn ook toegankelijk. In de context van cel-cel interacties, er behoefte symbolen niet alleen eiwitten maar ook lipide bilagen. Dergelijke dubbele proteo-lipide patroonvorming tot nu toe niet gemakkelijk toegankelijk zijn. Wij kunnen een gemakkelijke techniek om nano-eiwit stippen aangebracht op glas te maken en stelt een werkwijze voor de inter-puntruimte opvulling met een ondersteunde lipide dubbellaag (SLB). Van foto-bleken van fluorescerende tracer lipiden in de SLB, tonen we aan dat de bilaag vertoont aanzienlijke in-plane vloeibaarheid. Functionaliseren van het eiwit stippen met fluorescerende groepen stelt ons in staat om de afbeelding hen en om te laten zien dat ze zijn gerangschikt in een regelmatig zeshoekig rooster. De typische dot is ongeveer 800 nm en de afstand gedemonstreerd is 2 micron. Deze substraten worden verwacht dat zij als nuttig platforms voor celadhesie, migratie en mechanisch-sensing studies dienen.
Introduction
Celadhesie vindt plaats via gespecialiseerde celadhesiemoleculen (CAM's), eiwitten aanwezig op het celmembraan dat kan binden aan het contradeel van de extracellulaire matrix of op een andere cel. Aan gehechte cellen, meeste adhesiemoleculen zoals de alomtegenwoordige integrine en cadherine worden in de vorm van clusters 1. De interactie van T-lymfocyten (T-cellen) met antigeen presenterende cellen (APCs) een bijzonder opvallende afbeelding van de betekenis van receptor clusters gevormd bij het grensvlak tussen de twee cellen - vaak een immunologische synaps. Bij het vormen van het eerste contact met de APC, T-celreceptoren (TCR's) op het oppervlak van de T-cel vorm micronschaal clusters die als signalering platform 2, 3, 4, en uiteindelijk gecentraliseerd op grotere centrale supramoleculaire cluster (cSMAC )lass = "xref"> 5, 6, 7. Onlangs werd aangetoond dat de APC kant, worden de liganden van de TCR ook geclusterde 8.
In de context van T-cel-APC interactie de inzet van hybride systemen, waarbij de APC wordt nagebootst door een kunstmatig oppervlak gefunctionaliseerd met relevante eiwitten sterk geavanceerde ons begrip van de synaptische grensvlak 2, 3, 4, 5, 6, 7 . In dit verband is zeer relevant voor APC mimetische oppervlakken die een of meer aspecten van de doelcel te vangen ontwerpen. Bijvoorbeeld als liganden worden geënt op ondersteunde lipide bilagen, kunnen ze diffunderen in het vlak van de bilaag, bootsen de situatie op de APC oppervlak en tegelijkertijd de vorming mogelijk maken van decSMAC 6, 7. Zo hebben de clusters op de APC werd nagebootst door het creëren van liganden eilanden in een zee van polymeren 9, 10, 11, 12, 13, 14. Echter, deze twee functies zijn tot nu toe niet gecombineerd.
Hier beschrijven we een nieuwe techniek om nano-dots anti-CD3 (een antilichaam dat het TCR complex richt) omgeven door een lipide dubbellaag met diffunderende lipiden maken. De dubbellaag wordt afgezet met behulp Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaefer techniek 7, 15, 16 en indien gewenst kunnen worden gefunctionaliseerd met een specifiek eiwit - bijvoorbeeld de ligand van de T-cel integrine (ICAM1 genoemd). Daarnaast is de anti-CD3 eiwit stippen could worden vervangen door een ander antilichaam of CAM. Terwijl we de eiwitten hebben gekozen voor toekomstig gebruik als platform voor T-cel adhesie studies, kan de strategie hier gedetailleerd worden aangepast voor elk eiwit en zelfs DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cleaning Glass Cover-dia's en Observation Chambers
- Plaats de glazen afdekking-glijdt op een multi-slide tray vervaardigd uit een inert materiaal zoals polytetrafluorethyleen (PTFE).
- Dompel de lade met glijbanen en de waarnemingskamer in een oplossing van oppervlakteactieve stof (een product aanbevolen voor het reinigen kwarts cuvetten geschikt).
- Onder toepassing van een ultrasoon bad, ultra-ultrasone trillingen in de surfactant gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C).
- Spoel 5 keer met ultrazuiver water (18,2 MΩ.cm, 0,059 mS / cm).
- Ultra-ultrasone trillingen in surfactansoplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C).
- Spoel 10 keer met ultrapuur water.
- Herhaal stap 1.5 en 1.6 twee keer.
- Opslag in water bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C) gedurende één week.
2. Fabricage van Eiwit Nano-dots
- Afzetting van kralen
- Deposit de suspensie van silicapareltjes (2% v / v, 70 pl) druppelsgewijs op een cover-schuif (24 x 24 mm, dikte 170 pm) vastgehouden onder een helling van 15 graden.
- Laat de suspensie verdeeld gedurende ongeveer 1 minuut terwijl flipping het glas 90 ° om de 15 s.
- Laat de vloeistof verdampt onder omgevingsomstandigheden.
- Bewaren in een schone glazen of PTFE ruimte bij omgevingsomstandigheden gedurende tot 2 dagen.
- Afzetting van aluminium
- Plaats de objectglaasjes (bereid in paragraaf 2.1) in een radiofrequentie (RF) magnetron sputteren materiaal 8 op een draaitafel op een afstand van ongeveer 105 mm van een aluminium (99%): silicium (1%) doel.
- Afpompen van de depositiekamer tot 2,6 x 10 -4 Pa behulp van een turbo-moleculaire pomp. Deze stap is belangrijk voor het verwijderen van eventuele gasvormige verontreinigingen.
- Introduceren zuivere argonatmosfeer (5N, 99,999%) met een stroom van 10 sccm onder een druk van 0,8 Pa (6,6 mTorr).
- Schakel de HF-stroomgenerator.
OPMERKING: Hier wordt een typisch bereik van 400-600 W radiofrequente vermogen bij 13,56 MHz werd gebruikt. De RF-generator wordt gebruikt met een bijpassende netwerk in een capacitieve plasma koppelingswijze. De gereflecteerde energie wordt gecontroleerd en geminimaliseerd via het netwerk aangepast. - Nadat het plasma wordt gestabiliseerd, sputteren gedurende 2 minuten behandeld, waarbij het licht uit eventuele onzuiverheden van het oppervlak van het doel te verwijderen.
- Opent de sluiter en laat het sputteren voortgaan gedurende 60 min aluminium op het glaasje afzetten tot een dikte van 200 nm.
- Snijd de argonstroom, sluit de afsluiter de turbomoleculaire pomp van de afzettingskamer isoleren en ventileren van de kamer met schone nitrogen de kamerdruk te verkrijgen. Herstellen van de met aluminium beklede objectglaasjes. Bewaren gedurende een maand in een schone en hermetisch afgesloten glazen of PTFE box onder omgevingsomstandigheden.
- Opgedampt Organosilan
- Dompel het met aluminium beklede slide bereid in stap 2.2.6 in ultrazuiver water bij kamertemperatuur en ultra-ultrasone trillingen gedurende 30 seconden in een ultrasoon bad (50W, 50/60 Hz, tussen 20 en 30 ° C).
- Borg 0,5 ml (3-aminopropyl) -triethoxysilaan (APTES) onder in een exsiccator.
WAARSCHUWING: APTES een organosilaan, dat gemakkelijk verdampt en is giftig. APTES mag alleen onder een stroom-kap en gehanteerd worden. - Plaats de glaasjes (bereid in 2.3.1) op een keramische rooster en plaats binnen de exsiccator.
- Sluit de exsiccator een membraanpomp en op het maximale vermogen gedurende 30 min een laag vacuüm te genereren.
- Sluit het ventiel van de exsiccator en schakel de pomp.
- Verhit de exsiccatortot ongeveer 50 ° C gedurende 1 uur.
- Open de exsiccator en het verzamelen van de dia's.
- Naar een andere schone exsiccator opslag tot 48 uur bij kamertemperatuur (20-30 ° C).
- Afzetten van de eerste laag van eiwit - runderserumalbumine gemerkt met biotine (BSA-biotine)
- Plaats een van de dia's, bereid in paragraaf 2.3 op een PTFE-ondersteuning.
- Borg 1 mL 25 ug / mL BSA-biotine opgelost in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (20-30 ° C).
- Spoel 10 keer met PBS. Bewaar het monster tot 24 uur bij 4 ° C verwijderd van de lichtbron.
- Verwijdering van aluminium masker
- Incubeer de glaasjes in een oplossing van NaOH in PBS (bereid door druppelsgewijze toevoeging van 1 M NaOH tot ongeveer 100 ml PBS om pH≈12 verkrijgen) over-nacht bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C).
VOORZICHTIGHEID. NaOH is corrosief en moeten worden behandeld met handschoenen. - Spoelen10 keer in ultrapuur water.
- Incubeer de glaasjes in een oplossing van NaOH in PBS (bereid door druppelsgewijze toevoeging van 1 M NaOH tot ongeveer 100 ml PBS om pH≈12 verkrijgen) over-nacht bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C).
3. Afzetting van ondersteunde lipide dubbellaag (SLB)
- Reinigen van de Langmuir trog
- Verwijder het water in de PTFE-omhulling van de Langmuir trog met een pomp.
- Reinig met een pluisvrije non-woven disposable handdoek gedrenkt in chloroform.
VOORZICHTIGHEID. Chloroform is giftig en worden gemanipuleerd in een goed geventileerde ruimte, met een masker (of onder een stroom-kap) en met geschikte handschoenen. - Clean 4 maal met lauwwarm ultrazuiver water (40-50 ° C).
- Clean minstens 6 keer met koud ultrapuur water.
- Afzetten van de eerste lipidelaag
- Plaats PTFE PTFE schotels in de behuizing van de Langmuir trog en vul het met ultrazuiver water.
- Met de besturingssoftware van de Langmuir inrichting om de gemeten druk 0 mN / m ingesteld.
- Gebruik een gasdichte glas / metaal spuit aan 30 ul van een 1 mg / ml lipideoplossing deponeren (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) in chloroform) op het oppervlak van het water. Het chloroform verdampt en het lipide moleculen spontaan een monolaag.
- Met de besturingssoftware de lipide monolaag te comprimeren door het sluiten van de PTFE slagboom totdat de gewenste druk (27 mN / m bij DOPC) is bereikt.
- Met de besturingssoftware op de glasplaatje bereid in paragraaf 2.5.2 in de PTFE omhulling met behulp van een gemotoriseerde klem dip.
- Houden het preparaat in de klem, loodrecht op het lucht-watergrensvlak. Met de besturingssoftware te langzaam (15 mm / min) te verhogen via de interface, terwijl een constante druk bij 27 mN / m.
- Breng in een droge omgeving voor zowel onmiddellijk gebruik of voor opslag tot 24 uur bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C).
- Afzetten van de tweede lipidelaag
- Handhaven van de oppervlaktedruk van de Langmuir trog op de gewenste waarde van 27 mN / m. Comprimeren met behulp van debesturingssoftware van de Langmuir apparaten en / of voeg een kleine hoeveelheid lipide tot de gewenste druk te bereiken.
- Plaats de glazen objectglaasjes die de lipide monolaag, bereid in paragraaf 3.2.6, horizontaal op het wateroppervlak. Waarborgen dat elke slede zweeft boven een PTFE lade.
- Duw het glas glijdt, één dia tegelijk in de bijbehorende PTFE openen via PTFE of metalen pincet zodat ze ondergedompeld in het water. Vermijd kantelen van de dia's terwijl het duwen.
- Met PTFE of metaal pincet om de PTFE laden met schuift over in een kristallisatievat gevuld met ultrazuiver water zorg ervoor dat de objectglaasjes niet worden blootgesteld aan lucht.
- Met PTFE of metalen pincet te dragen, terwijl het werken onder water, een dubbellaag beklede glasplaat in een waarnemingskamer.
OPMERKING: De observatiekamer onder water geplaatst in de kristallisator. De waarnemingskamer is op maat gemaakt en bestaat uit een PTFE ring met een rubberpakkingd stalen omhulsels die onder water kan worden samengesteld tot een waterdichte kamer waarvan het bodemoppervlak wordt gemaakt van het glaasje vooraf bekleed met de lipide bilaag maken. - Sluit de tank terwijl ze blijven werken onder water en waarborgen dat ongeveer 1 ml water wordt opgesloten binnen de kamer.
- Neem de samengestelde kamer uit het water. Zorg ervoor dat het is waterdicht en lekvrije.
- Vervang 1 ml ultrazuiver water in de waarnemingskamer met PBS door het toevoegen en verwijderen van 500 pi PBS 10 keer. Zorgen dat de kamer nooit waaruit de vloeistof.
- SLB blokkeren stap
- Invoeren 100 ug / ml runderserumalbumine (BSA) in de waarnemingskamer met de slede bereid in paragraaf 3.3.6 en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C).
- Spoel de bilaag door verwijdering en toevoeging van 500 pi PBS 10 keer. De bilaag kan worden gehouden 24 uur bij 4 ° C.
4. functionalisering met Liganden
- fluorescerende of niet-fluorescerende neutravidine (NAV, een gedeglycosyleerd avidine versie niet geladen bij pH 7) toe aan 2 ug / ml in de kamer die de slede bereid in paragraaf 3.4.2 gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C).
- Spoelen door het toevoegen en verwijderen van 500 pi PBS 10 keer.
- Add gebiotinyleerd anti-CD3 bij 2 ug / ml aan de kamer die de slede bereid in paragraaf 3.4.2. Bij dubbele functionalisering van de SLB en stippen, voeg Fc-ICAM1 His-label 5 ug / ml (hier, wordt de dubbellaag van DOPC + 1% nitrilotriazijnzuur (NTA) lipiden). Laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (tussen 20 en 30 ° C).
- Spoelen door het toevoegen en verwijderen van 500 pi PBS 10 keer
- Vervang PBS met celmedium (PBS + 0,1% BSA) door het toevoegen en verwijderen van 500 pi van het celmedium 10 keer.
- Laat 200 pi van de cel medium in de chamber met de slede.
- Plaats de kamer gedurende 10 minuten bij 37 ° C voordat cellen.
5. celafzetting (zie referentie 7 voor details)
- Zorgvuldig deponeren 400 pi van de celsuspensie in de kamer. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Bevestig de cel met 2% paraformaldehyde (PFA) gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Vervang het PFA met PBS door herhaalde verwijdering en toevoeging van 500 pi PBS.
6. Observation
- Proteo-lipide Nano-patroon en SLB vloeibaarheid
- Gebruik een fluorescentiemicroscoop om het eiwit patroon epifluorescentie wijze met behulp van geschikte golflengte belichting (639 nm) en filter blokjes (bijvoorbeeld hier EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688).
OPMERKING: De intensiteit van het signaal kan worden gekwantificeerd om de hoeveelheid eiwit te schatten binnen en buiten de stip. Gebruik een geschikte golflengte belichting (330 nm) en filter kubus beeld de bilaag (BP 365/12, FT 395, LP 397), die licht met donkere gaten weergegeven. - Met continue bleken door (CPB) techniek 13, 15 naar de diffusieconstante tracer lipiden in de bilaag te meten. Deze waarneming wordt bij voorkeur net na de SLB afzetting.
Opmerking: Om de diffusieconstante kwantificeren, worden twee parameters gemeten tijdens CPB proces: de specifieke bleektijd van de kleurstof (gespannen) en de vervallengte van de fluorescerende profiel van de halo gevormd rond het gebleekte gebied (tauD). De eerste wordt verkregen door de tijdsevolutie van de fluorescentie-intensiteit bij het midden van het verlichte veld tijdens het proces CPB. De tweede wordt verkregen door het intensiteitsprofiel aan de rand van het verlichte zone (gemiddeld over 12 lijnen en 5 beelden na stationaire toestand is bereikt). De krommen zijn gemonteerd op strak en tauD verkrijgen. De diffusieconstante wordt gegeven door tauD 2 / strak (D =
).
- Gebruik een fluorescentiemicroscoop om het eiwit patroon epifluorescentie wijze met behulp van geschikte golflengte belichting (639 nm) en filter blokjes (bijvoorbeeld hier EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688).
). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fluorescentiebeelden werden geanalyseerd om de afstand en de grootte van de stippen meten. Typische afstand werd gevonden 1900 ± 80 nm en typische dot-grootte was 600 ± 100 nm (Figuur 1g). De afstand wordt door de grootte van de korrels voor het masker ingesteld. De puntafmeting wordt door de hiel-omvang en neerslagomstandigheden ingesteld. SLB is uniek rond het eiwit stippen en niet afgezet daarop (figuur 2), met perfecte complementariteit tussen de gezien in SLB imaging channel gaten en de stippen waargenomen bij het NAV imaging channel. Analyse van continue bleken door gegevens blijkt dat de lipiden in het patroon bilaag blijft vloeibaar en hebben een typische diffusieconstante van 5 μm² / s (figuur 3).
Figuur 1: Schematische weergave van fabricagestappen. (a -7 Torr, argon flux 10 sccm, procesdruk 6,2 mTorr, afgebeeld op versnellingsspanning van 5 kV. De beelden bevestigen waarneming met een optische microscoop (beeld niet inbegrepen) voordat aluminiumopdamplaag dat de korrels worden aangebracht in een monolaag gecentreerd hexagonaal rooster op het glazen plaatje. (B) Secundair masker aluminium door het sputteren na verwijdering van de primaire korrel-masker. (C) Depositie van organosilaan en BSA-biotine hoewel de secundaire masker. (D) verwijderen van aluminium openbaren nano-dots BSA-biotine. (E) Afzetting van SLB. (F) Binding NaV met BSA-biotine. (G) Binding anti-CD3 tot NIW. epi-fluorescentie afbeelding van de nano-dots arrays inzet toont. Hier De NIW wordt fluorescent gelabeld. Typische puntafmeting is 600 ± 100 nm en typische afstand is 1900 ± 80 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Complementariteit van de nano-punt en SLB patroon. (A, b) Epi-fluorescentie afbeeldingen fluorescentie NaV nano-dots en SLB fluorescerende tracer lipiden. (C) Samengesteld beeld van de NaV punten (rood) in de zee van SLB (groen) geeft een perfecte complementariteit van de NAV en SLB. image Fast Fourier Transform (FFT) in de inzet geeft lange-afstands orde. Schaalbalk: 4 um.rge.jpg" target = '_ blank'> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van lipide diffusie in de SLB. (A) Epi-fluorescentie afbeelding van een SLB vóór bleken. Het eiwit stippen te zien zijn als donkere gaten in een heldere zee van lipiden. Het veld-diafragma beperkt het verlichte gebied. (B) Epi-fluorescentie van SLB na het bleken continu gedurende 50 s. De halo zichtbaar in het gebied begrensd door de veld-membraan aangeeft dat de lipiden mobiel. Schaal bar: 10 micrometer. (C) Gemiddelde intensiteitprofiel langs de rand van het diafragma (boven) en het verval van de sterkte tijdens de opgegeven stranding werkwijze (onder). Deze gegevens worden geanalyseerd om de diffusieconstante, die typisch 5 μm² / s halen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritische stappen in het hierboven beschreven protocol hebben betrekking op de vorming van het eiwit nano-stippen of back-vullen van de ruimte rond de puntjes met een ondersteunde lipide dubbellaag. De eerste kritische stap met betrekking tot eiwit nano-punten is de bereiding van de hiel-masker. Het reinigen van het deksel dia kritisch. De glaasjes moeten ofwel worden gereinigd met een reinigingsmiddel dat wordt aanbevolen voor het reinigen kwarts cuvetten of met zuurstofplasma. Andere reinigingstechnieken zoals onderdompeling in ethanol of isopropanol behandeling niet maken het glas voldoende hydrofiel en dus geen ondersteuning voor de vorming van een grote dekkende kraal monolaag. Tegelijkertijd het oppervlak van de slede moet verenigbaar zijn met de daaropvolgende stap van het vormen van de SLB volgens Langmuir-Blodgett-techniek 7, 15, 16 te zijn. De volgende belangrijke stap is het aanbrengen en verwijderen van eenluminum. Als de depositie via sputtertechniek, zoals hier uitgevoerd, het doel moet worden gedoteerd met silicium (1%). Anders, als het doel uit zuiver aluminium, de afgezette laag is moeilijk te verwijderen met de alkali-oplossing zoals boven beschreven, waarschijnlijk door de vorming van aluminiumoxide en interpenetratie tussen afgezette aluminiumlaag en glasplaatje substraat. De duur van afzetting bepaalt de grootte van het eiwit punten 9, maar hier hebben gewerkt met een depositietijd en daardoor één puntgrootte. Het monster kan onder omgevingsomstandigheden gedurende enkele maanden na aluminiumafzetting en worden opgeslagen ongeveer een week na de afzetting van BSA-biotine.
De tweede cruciale stap betreft de afzetting van de SLB. Het schoonmaken van het glazen deksel-slide is weer een cruciaal belangrijk punt. Zoals het geval is voor alle Langmuir-Blodgett depositie werkzaamheden dient alle gebruikte materialen van glas of Polytetrafluoroethylene (PTFE) en moeten schoongehouden worden. Na het afzetten van de eerste lipidemonolaag, kan de cover-dia's worden opgeslagen voor een paar dagen, maar na de afzetting van de tweede monolaag, moeten ze onmiddellijk worden gebruikt.
Terwijl wij het protocol voor het maken van anti-CD3 nano-dots voor gebruik in T-lymfocyt adhesie studies hebben aangetoond 9, 13, de procedure is zeer flexibel en kan worden aangepast voor elke gebiotinyleerd proteïne. De samenstelling van de lipide bilaag kan gemakkelijk worden veranderd en kan verder worden gefunctionaliseerd indien gewenst. Een belangrijk punt van overweging is de mogelijke aspecifieke absorptie van eiwitten, vooral op de lipide dubbellaag rond de puntjes.
De grootste beperking van deze techniek ontstaat door gebruikmaking van colloïdale kraal zelfassemblage voor het primaire masker. Omdat het een bottom-up techniek, deelt een aantal van de problemen van allerlei dergelijke benaderingenbijvoorbeeld gebrek aan flexibiliteit en volledige controle over de patroonvorm. Het patroon rooster noodzakelijk overeenkomt met de symmetrie van de hiel masker en is dus altijd zeshoekig. De vorm van het motief van een cirkel en wordt bepaald door een combinatie van de kraal grootte en de duur van aluminiumafzetting 9, 13. Andere technieken voor het regelen van de puntgrootte zijn ook voorgesteld 14, 17, 18.
Substraten nano-patronen met eiwitten, fragmenten of peptiden zijn uitgebreid gebruikt in het verleden celoppervlak interacties bijzonder 19 hechting en migratie 20 sonde. Baanbrekend werk heeft aangetoond dat weefsel vormende cellen niet verspreid over patronen met een spoed groter dan een bepaalde drempelwaarde 21 en verder onderzoek sho wed dat de lengte-omvang van dit fenomeen door de grootte van Talins, die instrumenteel bij het koppelen integrinereceptoren op het actine cytoskelet 22 zijn ingesteld. Echter, in al deze studies werden de eiwitten gekoppeld aan goud nano-deeltjes, die zelf werden geïmmobiliseerd op glas.
In het kader van T-cellen, proteo-lipide membranen, typisch het nabootsen van antigeen presenterende cellen, zijn uitgebreid gebruikt om fundamentele aspecten van T-celfunctie 6 begrijpen. Ingenieuze nano-patroonvormingstechnieken gebruikt om kralen met metalen barrières tussen eiwit gefunctionaliseerd SLB pleisters, die inzicht hebben ontvangen in de structuur en verbindingen van de T-cel / APC-grensvlak 23 te creëren. Dit soort nano-patroon is echter zeer verschillend van het eiwit hier voorgestelde nano-dots. Recent werden nano- clusters gemaakt met behulp van chemische binding van het eiwit gefunctionaliseerde lipidenss = "xref"> 3, die licht werpen op de gevolgen van receptorclustering. Het voordeel was dat, in tegenstelling tot het onderhavige geval, zou de clusters in principe zelf mobiel. Echter worden dergelijke spontaan gevormd clusters definitie minder goed gecontroleerd in termen van grootte en dichtheid dan voorgevormde eiwit nano-dots beschreven.
We denken dat het eiwit nano-dot ingericht SLBs hier gepresenteerde kan worden gebruikt om verschillende aspecten van cel-cel adhesie te onderzoeken. Een voor de hand liggende vraag is of, zoals hierboven beschreven voor weefsel vormende cellen 19, lymfocyten ook een intrinsieke lengteschaal verband met hechting. Voorlopige resultaten lijken aan te geven dat althans wanneer de hechting wordt gemedieerd door de TCR complex, de dichtheid van liganden plaats afstand is de bepalende parameter voor het verspreiden en activering 10, 11, 12
De twee belangrijkste voordelen van deze proteo-lipide patronen zijn de verenigbaarheid van de substraten met geavanceerde optische microscopie en het gemak van bereiding die hen geschikt gebruikswaarde en worp toepassingen. Na aluminiumopdamplaag alle bereidingsstappen het kan worden uitgevoerd op een standaard nat laboratorium werkbank. In de toekomst kan worden overwogen dat de met aluminium beklede en glas gedragen bead masker geproduceerd in een speciale inrichting worden verzonden en opgeslagen in biologische laboratoria om als dat nodig is. Met het oog hierop zijn wij van mening dat deze substraten hebben het potentieel om het platform bij uitstek geworden voor het bestuderen van de interactie van cellen met gecontroleerde nano patroon proteo-lipide membranen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Laurent Limozin, Pierre Dillard en Astrid Wahl voor een verdere vruchtbare discussies over mobiele toepassingen. We danken ook Frederic Bedu van PLANETE cleanroom faciliteit voor zijn hulp met SEM observaties. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de European Research Council via subsidie No. 307.104 FP / 2007-2013 / ERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | ||
| Observation chamber | Home made | ||
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 | |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | ||
| Desiccator | Labbox | ||
| Crystallizer | Shott | ||
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 | |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 | |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | ||
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 | |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 | |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C | |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 | |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 | |
| Film balance | NIMA | Medium | |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system | |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | ||
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
References
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
- Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
- Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
- Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
- Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
- Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
- Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
- Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
- Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
- Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
- Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
- Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
- Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
- Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
- Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
- Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
- Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
- Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398 (2012).
- Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).
