Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Ligand Nano-gruppe Arrays i et støttet lipidbilag

Published: April 23, 2017 doi: 10.3791/55060

Summary

Vi presenterer en protokoll for å funksjonalisere glass med nanometerprotein lapper som er omgitt av et fluid lipid bilaget. Disse substrater er kompatible med avansert optisk mikroskopi og er forventet å tjene som plattform for celle adhesjon og migrasjon.

Abstract

For tiden er det en betydelig interesse i å lage stripestrukturer av klebeprotein øyer i et hav av passivert overflate for cellebiologiske undersøkelser. I de siste årene har det blitt stadig klarere at levende celler reagerer, ikke bare til den biokjemiske natur molekylene presentert for dem, men også måten disse molekylene blir presentert. Opprette protein mikromønster er derfor nå standard i mange biologi laboratorier; nano-mønstre er også mer tilgjengelig. Imidlertid, i sammenheng med celle-celleinteraksjoner, er det et behov for å mønster ikke bare proteiner, men også lipidbilag. Slik dual Proteo-lipidic mønster har så langt ikke vært lett tilgjengelig. Vi tilbyr en lettvint metode for å skape proteinnano punkter understøttet på glass og foreslå en fremgangsmåte for å etterfylle den inter-dot plass med en understøttet lipid bilag (SLB). Fra foto-bleking av tracer fluorescerende lipider inkludert i SLB, viser vi at bilaget viser betydelig i-plane flyt. Funksjonaliseprotein prikkene med fluorescerende grupper tillater oss å avbilde dem og for å vise at de er organisert i en vanlig sekskantet gitter. Den typiske dot størrelse er omtrent 800 nm og avstanden demonstrert her er 2 mikron. Disse substrater er forventet å tjene som brukbare plattformer for celle-adhesjon, migrasjon og mekanisk-føler studier.

Introduction

Celleadhesjon skjer gjennom spesialiserte celleadhesjonsmolekyler (CAM), proteiner som er tilstede på cellemembran som er i stand til å binde seg til sitt motstykke på den ekstracellulære matriks eller på en annen celle. På adhererte celler, de fleste adhesjonsmolekyler, inkludert den allestedsnærværende grin og cadherin, finnes i form av klynger 1. Interaksjonen av T-lymfocytter (T-celler) med antigenpresenterende celler (APC-er) tilveiebringer en spesielt slående illustrasjon på viktigheten av reseptor grupper som er dannet ved grenseflaten mellom de to cellene - ofte kalt en immunologisk synapse. Ved å danne den første kontakt med APC, T-cellereseptorer (TCR) på overflaten av T-celle-skjema mikrometerskala klynger som tjener som signaliserte plattformer 2, 3, 4, og blir til slutt sentraliserte å danne en større sentral supra klynge (cSMAC )lass = "ekstern referanse"> 5, 6, 7. Nylig ble det vist at det på APC side, er ligandene av TCR også gruppert 8.

I forbindelse med T-celle-APC interaksjon, utplassering av hybridsystemer, hvor APC er lignes ved hjelp av en kunstig overflate funksjonalisert med relevante proteiner, har i stor grad utvidet vår forståelse av den synaptiske grensesnitt 2, 3, 4, 5, 6, 7 . I denne sammenheng er det svært aktuelt å utforme APC etterlignende flater som fanger ett eller flere aspekter av målcellen. For eksempel, hvis ligander er podet på støttede lipid bilag, kan de diffundere i planet av bilaget, etterligne situasjonen på APC overflate og samtidig tillate dannelsen avcSMAC 6, 7. Tilsvarende har de klynger på APC er etterlignet ved å lage øyer av ligander i et hav av polymerer 9, 10, 11, 12, 13, 14. Men disse to funksjonene har så langt ikke blitt kombinert.

Her beskriver vi en ny teknikk for å lage nano prikker av anti-CD3 (et antistoff som er rettet mot TCR-komplekset) omgitt av et lipidbilag med diffuserende lipider. Dobbeltlaget er avsatt ved hjelp av Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaefer teknikk 7, 15, 16 og hvis ønskelig, kan bli funksjonalisert med et spesifikt protein - for eksempel liganden av T-celle integrin (kalt ICAM1). I tillegg er anti-CD3-protein prikker couLD bli erstattet med et annet antistoff eller CAM. Mens vi har valgt proteiner for fremtidig bruk som plattform for T Celleadhesjonsstudier, kan strategien beskrevet her være tilpasset for noen protein og selv DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rens glassdeksel-sklier og observasjon Chambers

  1. Anordne glassdekk glir på en flerglidebrett med laget av et inert materiale som polytetrafluoretylen (PTFE).
  2. Dyppe brettet med lysbilder og observasjonscellen i en overflateaktiv løsning (et hvilket som helst produkt som anbefales for rensing av kvartskuvetter er egnet).
  3. Ved hjelp av et ultrasonisk bad, ultra-sonikatet i den overflateaktive oppløsningen i 30 minutter ved romtemperatur (mellom 20 og 30 ° C).
  4. Skyll 5 ganger med ultrarent vann (18,2 Mfi.cm,, 0,059 uS / cm).
  5. Ultra-sonikat i overflateaktiv oppløsning i 30 minutter ved romtemperatur (mellom 20 og 30 ° C).
  6. Skyll 10 ganger med ultrarent vann.
  7. Gjenta trinn 1,5 og 1,6 ganger.
  8. Lagres i vann ved romtemperatur (mellom 20 og 30 ° C) i opp til en uke.

2. Fabrikasjon av Protein Nano-prikker

  1. Nedfall av perler
    1. Deposit suspensjonen av silika-kuler (2% v / v, 70 mL) dråpevis på et dekkglide (24 x 24 mm, tykkelse 170 um) holdes i en skråstilling på 15 grader.
    2. La suspensjonen spredt i ca. 1 minutt mens den spreller glasset ved 90 ° hver 15 sek.
    3. Tillate væsken å fordampe ved omgivelsesbetingelser.
    4. Lagres på et rent glass eller PTFE kammer ved omgivelsesbetingelser i opptil 2 dager.
  2. Avsetning av aluminium
    1. Plassere objektglassene (fremstilt i avsnitt 2.1) inne i en radiofrekvens (RF) sputtering utstyr 8, på et roterende bord i en avstand på ca. 105 mm fra en aluminium- (99%): silisium (1%) mål.
    2. Pump ned fra utfellingskammeret til 2,6 x 10 -4 Pa ved hjelp av en turbo-molekylær pumpe. Dette trinn er viktig for å fjerne eventuelle forurensninger i gassform.
    3. Innføre ren argonatmosfære (5N, 99,999%) med en fluks på 10 sccm ved et trykk på 0,8 Pa (6,6 mTorr).
    4. Slå på RF-strømgenerator.
      MERK: Her ble et typisk område fra 400 til 600 W radiofrekvenseffekt ved 13,56 MHz frekvensen som brukes. RF-generatoren blir brukt sammen med et samsvarende nettverk i en kapasitiv plasma koblingsmåte. Reflektert effekt blir overvåket og minimalisert ved hjelp av nettverks tilpasning.
    5. Etter at plasmaet er stabilisert, frese i 2 min holde lukkeren for å fjerne eventuelle urenheter fra overflaten av målet.
    6. Åpne lukkeren og tillate sprutingen til å fortsette i 60 minutter for å avsette aluminium på glassplate til en tykkelse på 200 nm.
    7. Skjær strømmen av argon, lukker sluseventilen for å isolere den turbomolecular pumpen fra utfellingskammeret, og ventilere kammeret med ren nitrogen for å oppnå den atmosfæretrykk. Gjenvinne aluminium-belagte objektglass. Lagre i opptil en måned i en ren og hermetisk forseglet glass eller PTFE boksen under omgivelsesbetingelser.
  3. Pådampning av organosilan
    1. Dypp aluminiumbelagt lysbilde fremstilt i trinn 2.2.6 i ultrarent vann ved romtemperatur, og ultra-ultralydbehandlet i 30 sekunder i et ultralydbad (50 W, 50/60 Hz, mellom 20 og 30 ° C).
    2. Innskudd 0,5 ml (3-aminopropyl) -triethoxysilane (APTES) i bunnen av en eksikator.
      ADVARSEL: APTES er et organosilan, som fordamper lett og er giftig. APTES skal håndteres bare under en strøm-hette og med hansker.
    3. Sett objektglass (fremstilt i 2.3.1) på et keramisk gitter og plass inne i eksikator.
    4. Koble eksikator til en membranpumpe og kjøres ved maksimal kraft i 30 minutter for å frembringe et lavt vakuum.
    5. Steng ventilen i desikatoren og slå av pumpen.
    6. Varm eksikkatortil omtrent 50 ° C i 1 time.
    7. Åpne tørkeskapet og samle lysbilder.
    8. Overfør til en annen ren eksikator for lagring i opp til 48 timer ved romtemperatur (20 til 30 ° C).
  4. Avsetning av første lag av protein - bovinserumalbumin merket med biotin (BSA-biotin)
    1. Plasser en av objektglass preparert i seksjon 2.3 på en PTFE bærer.
    2. Innskudd 1 ml 25 ug / ml BSA-biotin oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS). La stå i 30 minutter ved romtemperatur (20 til 30 ° C).
    3. Skyll 10 ganger med PBS. Lagre prøven i opp til 24 timer ved 4 ° C borte fra lyskilden.
  5. Fjerning av aluminium maske
    1. Inkuber objektglassene i en løsning av NaOH i PBS (fremstilt ved dråpevis tilsetning av 1 M NaOH til ca. 100 ml PBS for å oppnå pH≈12) over natten ved romtemperatur (mellom 20 og 30 ° C).
      FORSIKTIGHET. NaOH er etsende og må håndteres ved hjelp av hansker.
    2. Skylle10 ganger i ultrarent vann.

3. Avsetning av støttede lipid bilaget (SLB)

  1. Rengjøring av trauet Langmuir
    1. Fjern vannet i PTFE hylsteret til Langmuir trau ved hjelp av en pumpe.
    2. Rengjør med en lofri ikke-vevd disponibel håndkle dynket i kloroform.
      FORSIKTIGHET. Kloroform er toksisk og bør bli manipulert på en godt ventilert område, med en maske (eller under en strøm-hette) og med passende hansker.
    3. Ren 4 ganger med lunkent ultrarent vann (40 til 50 ° C).
    4. Rengjør minst 6 ganger med kaldt ultrarent vann.
  2. Avsetning av det første lipidlaget
    1. Plasser PTFE skuffer i PTFE-kapsling av Langmuir-trau og så fylle den med ultrarent vann.
    2. Bruk kontrollprogram i Langmuir apparat for å sette den målte trykket til 0 mN / m.
    3. Bruke et gasstett glass / metall-sprøyte for å avsette 30 pl av en 1 mg / ml lipid-løsning (1, 2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfocholin (DOPC) i kloroform) på overflaten av vannet. Kloroformen fordamper og lipidmolekyler spontant danner et monolag.
    4. Bruk kontrollprogramvaren for å komprimere lipid monolaget ved å lukke PTFE barrieren inntil det ønskede trykk (27 mN / m for DOPC) er nådd.
    5. Bruk kontrollprogramvaren for å dyppe objektglasset fremstilt i avsnitt 2.5.2 i PTFE avlukket ved hjelp av en motorisert klemme.
    6. Holder glasset, i klemmen, vinkelrett på grensesnittet luft-vann. Bruk kontrollprogramvaren for å heve det langsomt (15 mm / min) gjennom grensesnittet, og samtidig opprettholde et konstant trykk på 27 mN / m.
    7. Sted i et tørt miljø for enten umiddelbar bruk eller for lagring inntil 24 timer ved romtemperatur (mellom 20 og 30 ° C).
  3. Avsetning av det andre lipidlag
    1. Holde overflatetrykket i Langmuir trauet ved den ønskede verdi på 27 mN / m. Komprimer brukerkontrollprogram i Langmuir apparat og / eller legge til en liten mengde av lipid for å oppnå det ønskede trykk.
    2. Plasser objektglass som bærer lipid monolaget, fremstilt i avsnitt 3.2.6, horisontalt på overflaten av vannet. Sørge for at hvert bilde svever over en PTFE-brett.
    3. Presse glassplater ned, ett lysbilde om gangen, inn i den tilsvarende PTFE magasin med PTFE eller metall pinsett slik at de blir nedsenket i vann. Unngå å vippe lysbildene mens du presser.
    4. Bruk PTFE eller metall pinsett for å overføre PTFE magasiner som inneholder de glir inn i en krystallisator fylt med ultrarent vann slik at lysbildene ikke blir utsatt for luft.
    5. Bruk PTFE eller metall pinsett for å overføre, under arbeidet under vann, et tolags belagt glassplate inn i et observasjonskammer.
      MERK: observasjonskammer er plassert under vann inne i krystallisatoren. Observasjonscellen er spesiallaget og består av et PTFE-ring med en gummipakning end stålforingsrør, som kan settes sammen under vann for å lage en vanntette kammer i hvis bunnflate er laget av objektglasset på forhånd er belagt med lipid-dobbeltlaget.
    6. Lukk kammeret samtidig som de fortsetter å arbeide under vann og å sikre at omtrent 1 ml vann blir fanget inne i kammeret.
    7. Ta den sammenstilte kammer ut av vannet. Pass på at det er vanntette og lekkasje gratis.
    8. Bytt ut 1 ml ultrarent vann til stede i observasjonscellen med PBS ved å legge til og fjerne 500 pl av PBS 10 ganger. Sikre at kammeret er aldri fri for væske.
  4. SLB blokkeringstrinn
    1. Introduser 100 ug / ml bovint serumalbumin (BSA) i observasjonscellen som inneholder sleiden fremstilt i avsnitt 3.3.6 og inkuber i 30 min ved romtemperatur (mellom 20 og 30 ° C).
    2. Skyll dobbeltlaget ved å fjerne og å tilsette 500 ul av PBS 10 ganger. Dobbeltlaget kan holdes 24 timer ved 4 ° C.

4. Funksjon med ligander

  1. Legg til en fluorescerende eller ikke-fluorescerende Neutravidin (NAV, en deglykosylerte versjon av avidin ikke ladet ved pH 7) med 2 ug / ml inn i kammeret som inneholder glide fremstilt i avsnitt 3.4.2 i 30 minutter ved romtemperatur (mellom 20 og 30 ° C).
  2. Skyll ved å legge til og fjerne 500 pl av PBS 10 ganger.
  3. Legg biotinylert anti-CD3 i 2 ug / ml til kammeret som inneholder glide fremstilt i avsnitt 3.4.2. For dobbelt funksjonalisering av de SLB og prikker, legge til Fc-ICAM1 His-tag ved 5 ug / ml (her, er det to-lags laget av DOPC + 1% av nitriltrieddiksyre (NTA) lipider). La stå i 30 minutter ved romtemperatur (mellom 20 og 30 ° C).
  4. Skyll ved å legge til og fjerne 500 pl av PBS 10 ganger
  5. Erstatte PBS med cellemedium (PBS + 0,1% BSA) ved å legge til og fjerne 500 pl av cellemediet 10 ganger.
  6. La 200 ul av cellemediet i chamber med sleiden.
  7. Plasser kammeret i 10 minutter ved 37 ° C før tilsetning av cellene.

5. Cell Nedfall (se referanse 7 for detaljer)

  1. Nøye sette 400 ul av cellesuspensjonen inn i kammeret. Cellene inkuberes i 30 min ved 37 ° C.
  2. Feste celle med 2% paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter ved 37 ° C. Sett på PFA med PBS ved gjentatt fjerning og tilsetning av 500 pl PBS.

6. Observasjon

  1. Proteo-lipidic Nano-mønster og SLB flyt
    1. Bruke et fluorescensmikroskop for å avbilde proteinmønsteret i epi-fluorescens modus ved hjelp av hensiktsmessige belysning bølgelengde (639 nm) og filter kuber (f.eks her, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688).
      MERK: Intensiteten av signalet kan kvantifiseres å anslå mengden protein i og utenfor prikk. Bruke en passende belysning bølgelengde (330 nm) og fIlter kube for å avbilde to-lags (BP 365/12, FT 395, LP 397), som ser lyse med mørke hull.
    2. Bruk kontinuerlig fotobleking (CPB) teknikk 13, 15 for å måle diffusjonskonstanten av tracer lipider i bilaget. Denne observasjonen er fortrinnsvis utført like etter SLB deponering.
      NB: For å kvantifisere diffusjonskonstanten er to parametere som måles i løpet av CPB prosess: Det spesifikke bleketid av fargestoffet (stram) og svinnet lengden til den fluorescerende profilen av halogen dannet rundt det blekede område (tauD). Den første oppnås ved å plotte den tid utviklingen av fluorescensintensiteten ved midten av det belyste felt under CPB prosessen. Den andre blir oppnådd ved å plotte intensitetsprofilen ved kanten av den belyste sone (i gjennomsnitt over 12 linjer og 5 bilder etter at steady-state nås). Kurvene er montert for å oppnå stram og tauD. Diffusjonskonstanten er gitt ved TAUD 2 / stram (D = ligningen ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fluorescens ble analysert for å måle avstanden og størrelsen av prikkene. Typisk avstand ble funnet å være 1900 ± 80 nm, og typiske dot-størrelsen var 600 ± 100 nm (figur 1 g). Avstanden er bestemt av størrelsen av kulene som anvendes for masken. Dot-størrelse er bestemt av kule størrelse samt avsetningsforhold. Den SLB avsettes entydig rundt protein prikker og ikke på dem (figur 2), med perfekt komplementaritet mellom hullene sett i SLB avbildning kanal og prikkene sett i NAV avbildning kanal. Analyse av kontinuerlig fotobleking data viser at lipider i det mønstrede dobbeltlaget forbli flytende og ha en typisk diffusjonskonstant av 5 μm² / s (figur 3).

Figur 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av fremstillingstrinn. (en -7 Torr, Argon flux 10 sccm, prosesstrykk 6,2 mTorr, avbildes ved akselerasjonsspenning på 5 kV. Bildene bekrefter observasjoner er gjort med optisk mikroskopi (image ikke inkludert) før avsetning av aluminium i at kulene er anordnet i et monolag sentrert heksagonalt gitter på glass-slide. (B) Sekundær maske av aluminium laget av frese avsetning etter fjerning av den primære kule-maske. (C) Påføring av organosilan og BSA-biotin skjønt den sekundære masken. (D) Fjerning av aluminium avslørende nano prikker av BSA-biotin. (E) Avsetning av SLB. (F) Binding Nav til BSA-biotin. (G) Binding anti-CD3 for å NAV. Inset viser epi-fluorescens bilde av nano-prikker arrays. Her NAV er fluorescerende merket. Typisk dot-størrelse er 600 ± 100 nm, og typisk avstand er 1900 ± 80 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Complementarity av nano-dot og SLB mønster. (A, b) Epi-fluorescens bilder av fluorescerende Nav nano prikker og av SLB med fluoriserende spor lipider. (C) Composite bilde av NAV prikker (røde) i havet av SLB (grønn) viser perfekt komplementaritet mellom NAV og SLB. Fast Fourier Transform (FFT) bilde i den innfelte indikerer langtrekkende orden. Skalastolpe: 4 um.rge.jpg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Kvantifisering av lipid diffusjon i SLB. (A) Epi-fluorescens bilde av en SLB før bleking. Protein punkter vise seg som mørke hull i en lys hav av lipider. Den felt-diafragma begrenser det belyste området. (B) Epi-fluorescens av SLB etter bleking kontinuerlig i 50 sek. Halo synlig inne i regionen som er avgrenset av den feltblender indikerer at lipidene er mobile. Skalastolpe: 10 um. (C) Gjennomsnittlig intensitetsprofil langs kanten av feltet membranen (øverst) og nedbrytning av intensitet over tid i løpet av prosessen settes på land (nederst). Disse dataene analyseres for å ekstrahere diffusjonskonstant, som er typisk 5 μm² / s.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De kritiske trinnene i protokollen som er beskrevet ovenfor er relatert til dannelsen av proteinnano prikker eller bak-fylling av rommet rundt prikkene ved en understøttet lipidbilag. Den første kritiske trinnet med hensyn til proteinnano punkter er fremstillingen av kule-masken. Rengjøringen av dekk-slide er kritisk. Skinnene må være enten rengjøres med en vaskemiddeloppløsning som er anbefalt for rengjøring kvartskuvetter, eller med oksygenplasma. Andre renseteknikker som neddykking i etanol eller iso-propanol behandling ikke gjengi glasset tilstrekkelig hydrofile og derfor ikke understøtte dannelsen av en stor-dekning perle monolag. På samme tid, på overflaten av objektglasset må være kompatibelt med den etterfølgende trinn med dannelse av SLB ved Langmuir-Blodgett teknikk 7, 15, 16. Det neste trinnet er kritisk avsetning og fjernelse av enLuminum. Hvis avsetningen er via sputtering teknikk, som utført her, bør målet være dopet med silisium (ved 1%). Ellers, hvis målet er laget av ren aluminium, er det avsatte sjikt er vanskelig å fjerne med alkali-løsning som beskrevet ovenfor, sannsynligvis på grunn av dannelsen av aluminiumoksid og gjennomtrenging avsatt aluminiumslaget og preparatglass-substrat. Varigheten av deponering bestemmer størrelsen på protein prikkene 9, men her har vi jobbet med et enkelt deponering tid og derfor enkelt punkt størrelse. Prøven kan oppbevares under omgivelsesbetingelser i flere måneder etter avsetning av aluminium og for omtrent en uke etter avsetningen av BSA-biotin.

Det andre avgjørende skritt gjelder avsetningen av SLB. Rengjøring av glassdekselet-slide er igjen en avgjørende viktig punkt. Som tilfellet er for hvilken som helst Langmuir-Blodgett avsetning arbeid, bør alt materialet som brukes være laget av glass eller Polytetrafluoroethylene (PTFE), og bør være fullstendig rent. Etter avsetning av den første lipid monolaget, kan dekk-slides lagres i et par dager, men etter avsetningen av den andre monolaget, de må brukes umiddelbart.

Selv om vi har vist protokollen for å skape anti-CD3-nano punkter for bruk i T-lymfocytt heft studier 9, 13, er fremgangsmåten meget fleksibel og kan tilpasses for en hvilken som helst biotinylert protein. Sammensetningen av det ytre lipid bilaget lett kan endres, og det kan ytterligere funksjonaliseres hvis ønskelig. Et viktig punkt å vurdere er det mulig uspesifikk absorpsjon av proteiner, spesielt på de ytterste lipid bilaget som omgir prikker.

Den viktigste begrensning av teknikken oppstår ved bruk av kolloidal-bead selvbygging for den primære maske. Å være en bottom-up teknikk, deler noen av problemene med alle slike tilnærmingerfor eksempel, manglende fleksibilitet og full kontroll over mønsteret form. Mønsteret gitter nødvendigvis reflekterer symmetrien av vulsten masken, og er derfor alltid sekskantet. Formen av mønsteret motivet er en sirkel, og er bestemt ved en kombinasjon av vulst-størrelse og varighet av avsetning av aluminium i 9, 13. Alternative metoder for å kontrollere punktstørrelse har også blitt foreslått 14, 17, 18.

Substrater nano-mønstre med proteiner, protein-fragmenter eller peptider er blitt brukt i stor utstrekning i det siste for å undersøke celleoverflate interaksjoner, spesielt adhesjon og migrering 19 20. Banebrytende arbeid har vist at vev-dannende celler mislykkes i å spre seg på mønster med en stigning som er større enn en gitt terskel 21, og videre undersøkelser sho wed at lengden stilt av dette fenomenet er angitt ved størrelsen av talins, som er medvirkende til å knytte grinreseptorer til aktin cytoskjelettet 22. Men i alle disse studiene, ble proteinene bundet til gull nanopartikler, som selv ble immobilisert på glass.

I forbindelse med T-celler, Proteo-lipid-membraner, vanligvis etterligner antigen-presenterende celler, har vært mye brukt for å forstå de grunnleggende aspekter av T-cellefunksjonen 6. Smarte nano-mønstringsteknikker er blitt brukt til å lage innhegninger med metallbarrierer som skiller protein funksjon SLB plaster, som har gitt innsikt i strukturen og tilkobling av T-celle / APC-grensesnittet 23. Denne typen nano-mønster er imidlertid svært forskjellig fra protein nano-punkter foreslått her. Nylig ble nano klynger opprettet ved hjelp av kjemisk binding av protein funksjonalisert lipideness = "ekstern referanse"> 3, som kaster lys over konsekvens av reseptor-gruppering. Fordelen er at, i motsetning til den foreliggende tilfelle, kan gruppene i prinsippet være seg mobil. Men slike spontant dannede klaser nødvendigvis er mindre godt kontrollert med hensyn til størrelse og tetthet enn forhåndsformede proteinnano punkter som er beskrevet her.

Vi ser for oss at proteinet nano-dot dekorert SLBs presenteres her kan brukes til å undersøke ulike aspekter ved celle-celle adhesjon. En åpenbar spørsmål som oppstår er enten, som beskrevet ovenfor for vev som danner cellene 19 har lymfocytter også ha en iboende lengde-skala i forbindelse med adhesjon. Foreløpige resultater tyder på at i det minste når adhesjonen er mediert av TCR-komplekset, tettheten av ligander i stedet for avstanden er den definerende parameter for å spre og aktivering 10, 11, 12 13. Uansett om inkludering av mobile ligander i de omkringliggende SLB påvirker denne observasjon og hvordan de mobile og immobile fraksjoner arbeide sammen er en mulig spørsmål, som delvis håndteres ved hjelp av selv-sammensatte SLB bundet klynger 24. En annen interessant anvendelse vil være i forbindelse med mekanisk-sensing hvor celleadhesjon / aktivering på mobile enheter og immobiliserte ligander ble vist å være forskjellig, ikke bare for T-celler 7, 25 men også for celler som vanligvis holder seg til den ekstracellulære matriks 26.

De to viktigste fordelene ved disse Proteo-lipide mønstre er kompatibiliteten av substratene med avansert optisk mikroskopi og den enkle fremstilling som gjør dem kompatible med bruk-og-kast-applikasjoner. Etter avsetning av aluminium, kan alle fremstillingstrinnene utføres på en standard våt-laboratoriebenken. I fremtiden kan det tenkes at den aluminium-belagt og glass-støttet kule-masker fremstilt på en spesialanlegg blir overført og lagret i biologiske laboratorier for bruk ved behov. Med dette i betraktning, mener vi at disse underlag har potensial til å bli den foretrukne plattformen for å studere samspillet av celler med kontrollerte nano-mønstrede Proteo-lipid membraner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Laurent Limozin, Pierre Dillard og Astrid Wahl for fortsatt fruktbare diskusjoner om mobilapplikasjoner. Vi takker også Frederic Bedu fra PLANETE renrom anlegg for hans hjelp med SEM observasjoner. Dette arbeidet ble delvis finansiert av European Research Council via tilskudd No. 307104 FP / 2007-2013 / ERC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslips Assistent, Karl Hecht KG 
Observation chamber Home made
Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) Hella Analytics 9-307-011-4-507
Ultra-sonicator ThermoFisher
Desiccator Labbox
Crystallizer  Shott
Neutravidine Thermo Fischer Scientifique 84607
PBS  Sigma-aldrich P3813
Water MQ  ELGA, Veolia France
Silica beads Corpuscular Inc 147114-10
APTES Sigma-aldrich A3648
BSA-Biotin Sigma-aldrich A8549
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C
Dansyl-PE Avanti Polar Lipids 810330C
Chloroform Sigma-aldrich 650471
Gastight syringe  Dominique Dustcher , France 74453
Film balance NIMA Medium
Microscope Zeiss, Germany TIRF-III system
Aluminium Target  Kurt J. Lesker Compagny, USA
Radio Frequency Magnetron sputtering Système  modified SMC 600 tool by ALCATEL , France

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).
  2. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
  3. Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
  4. Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
  6. Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
  7. Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
  8. Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
  9. Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
  10. Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
  11. Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
  12. Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
  13. Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
  14. Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
  15. Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
  16. Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
  17. Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
  18. Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
  19. Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
  20. Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
  21. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  22. Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
  23. Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
  24. Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
  25. Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398 (2012).
  26. Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).

Tags

Bioengineering protein nano-prikker nanobiopatterning nano-klynger understøttet lipider bilaget nanobiofunctionalization celleadhesjon
Ligand Nano-gruppe Arrays i et støttet lipidbilag
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benard, E., Pi, F., Ozerov, I.,More

Benard, E., Pi, F., Ozerov, I., Charrier, A., Sengupta, K. Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer. J. Vis. Exp. (122), e55060, doi:10.3791/55060 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter