Summary
Vi presenterar ett protokoll för att funktionalisera glas med nanometriska protein patchar omgivna av en fluid lipiddubbelskikt. Dessa substrat är kompatibla med avancerad optisk mikroskopi och förväntas tjäna som plattform för celladhesion och migration studier.
Abstract
För närvarande finns ett stort intresse för att skapa ordnade arrangemang av adhesiva protein öar i ett hav av passiverad yta för cellbiologiska studier. Under de senaste åren har det blivit allt tydligare att levande celler reagerar, inte bara för den biokemiska naturen hos molekylerna presenteras för dem, men också till hur dessa molekyler presenteras. Skapa proteinmikromönster är därför nu standard i många biologiska laboratorier; nano mönster är också mer tillgänglig. Men i samband med cell-cell interaktioner, finns det ett behov av att mönstret inte bara proteiner utan också lipidbiskikt. En sådan dubbel Proteo-lipidiska mönstring har hittills inte varit lättillgänglig. Vi erbjuder en enkel teknik för att skapa proteinnano punkter stöds på glas och föreslå en metod för att återfyllning inter-dot utrymme med en stöds lipidbiskikt (SLB). Från fotoblekning av spårämne fluorescerande lipider som ingår i SLB, visar vi att biskiktet uppvisar betydande in-plane fluiditet. Funktionalisering av protein prickar med fluorescerande grupper tillåter oss att bilden dem och visa att de är ordnade i en regelbunden hexagonal gitter. Den typiska punktstorlek är ungefär 800 nm och avståndet visat här är 2 mikron. Dessa substrat förväntas fungera som användbara plattformar för celladhesion, migrering och mekaniskt-avkännande studier.
Introduction
Celladhesion sker genom specialiserade celladhesionsmolekyler (CAMs), proteiner som är närvarande på cellmembranet som är kapabla att binda till sin motsvarighet på extracellulär matrix eller på en annan cell. På vidhäftade celler, de flesta adhesionsmolekyler inklusive den allestädes närvarande grin och kadherin, återfinns i form av kluster 1. Interaktionen av T-lymfocyter (T-celler) med antigenpresenterande celler (APC: er) ger en särskilt slående illustration av betydelsen av receptor kluster som bildas vid gränsytan mellan de två cellerna - ofta kallas en immunologisk synaps. Vid bildande den första kontakten med de cellreceptorer (TCR) på ytan av de cellformen mikronskala kluster T som fungerar som signaleringsplattformar 2, 3, 4, och slutligen centraliserad APC, T för att bilda en större central supramolekylär kluster (cSMAC )lass = "xref"> 5, 6, 7. Nyligen visades det att på APC sidan, är liganderna enligt TCR också klustrade 8.
I samband med T-cell-APC-interaktion, utplaceringen av hybridsystem, där APC imiteras av en artificiell yta funktionaliserad med relevanta proteiner, har i hög grad avancerat vår förståelse av den synaptiska gränssnittet 2, 3, 4, 5, 6, 7 . I detta sammanhang är det i högsta grad relevant att utforma APC mimetiska ytor som fångar en eller flera aspekter av målcellen. Till exempel om ligander är ympade på stödda lipidbiskikt, kan de diffundera i planet av dubbelskiktet, efterlikna situationen på APC-ytan och på samma gång tillåta bildandet av dencSMAC 6, 7. På liknande sätt har de kluster på APC varit efterliknas genom att skapa öar av ligander i ett hav av polymerer 9, 10, 11, 12, 13, 14. Men dessa två funktioner har hittills inte kombineras.
Här beskriver vi en ny teknik för att skapa nano prickar av anti-CD3 (en antikropp som riktar sig mot TCR-komplexet) omgiven av ett lipidbiskikt med diffuserande lipider. Dubbelskiktet är avsatt med användning av Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaefer teknik 7, 15, 16 och om så önskas, skulle kunna funktionaliseras med ett specifikt protein - till exempel liganden av cellen grin T (som kallas ICAM-1). Dessutom, de anti-CD3-protein prickar could ersättas med en annan antikropp eller CAM. Medan vi har valt proteiner för framtida användning som plattform för T-cellvidhäftningsstudier, kan den strategi som beskrivs här anpassas för något protein och även DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rengöring glaskupa-diabilder och Observation Chambers
- Ordna glastäck glider på en flerbildsbricka tillverkad av ett inert material som polytetrafluoreten (PTFE).
- Doppa facket med diabilder och observationskammaren i en lösning av ytaktivt medel (alla produkter som rekommenderas för rengöring kvartskyvetter är lämpliga).
- Med användning av ett ultraljudsbad, ultra-sonikat i den ytaktiva lösningen för 30 min vid rumstemperatur (mellan 20 och 30 ° C).
- Skölj 5 gånger med ultrarent vatten (18,2 MΩ.cm, 0,059 | j, S / cm).
- Ultra-sonikat i lösning av ytaktivt medel under 30 min vid rumstemperatur (mellan 20 och 30 ° C).
- Skölj 10 gånger med ultrarent vatten.
- Upprepa steg 1,5 och 1,6 gånger.
- Butik i vatten vid rumstemperatur (mellan 20 och 30 ° C) i upp till en vecka.
2. Tillverkning av Protein Nano-dots
- Avsättning av pärlor
- a insättningt suspensionen av kiseldioxid-pärlor (2% volym / volym, 70 ul) droppe för droppe på en täck-slid (24 x 24 mm, tjocklek 170 um) som hölls vid en lutning av 15 grader.
- Låt suspensionen spreds under ca 1 min medan vända glaset genom 90 ° var 15 s.
- Låt vätskan avdunsta under omgivningsbetingelser.
- Förvara i ett rent glas eller PTFE kammare vid omgivningsförhållanden i upp till två dagar.
- Avsättning av aluminium
- Placera objektglasen (framställda i avsnitt 2,1) inuti en radiofrekvent (RF) magnetronsputtring utrustning 8, på ett roterande bord på ett avstånd av ca 105 mm från en aluminium (99%): kisel (1%) målet.
- Pumpa ner i avsättningskammaren till 2,6 x 10 -4 Pa med användning av en turbomolekylpump. Detta steg är viktigt för att avlägsna eventuella gasformiga föroreningar.
- Införa ren argonatmosfär (5N, 99,999%) med ett flöde av 10 sccm vid ett tryck av 0,8 Pa (6,6 mTorr).
- Slå på RF-generator.
OBS: Här, var ett typiskt område av 400-600 W radiofrekvenseffekt vid 13,56 MHz frekvens som används. RF-generatorn används med ett matchande nät i en kapacitiv plasmakopplingsläge. Den reflekterade effekten övervakas och minimeras med hjälp av nätverksanpassning. - Efter det att plasman har stabiliserats, förstoftning för 2 min att hålla slutaren stängd för att avlägsna eventuella föroreningar från ytan av målet.
- Öppna slutaren och låta förstoftning pågå i 60 min för att avsätta aluminium på glasskivan till en tjocklek av 200 nm.
- Skära av flödet av argon, stänga grinden ventilen för att isolera den turbomolekylära pumpen från avsättningskammaren och ventilera kammaren med ren nitrogen att erhålla den rumstryck. Återvinna de aluminiumbelagda objektglas. Lagra upp till en månad i en ren och hermetiskt tillsluten glas eller PTFE rutan under omgivningsförhållanden.
- Ångavsättning av Organosilanmodifierade
- Doppa den aluminiumbelagda objektglas som framställts i steg 2.2.6 i ultrarent vatten vid rumstemperatur och ultra-sonikat under 30 s i ett ultraljudsbad (50 W, 50/60 Hz, mellan 20 och 30 ° C).
- Insättning 0,5 ml (3-aminopropyl) -triethoxysilane (APTES) vid botten av en torkapparat.
VARNING: APTES är en organosilan, som avdunstar snabbt och är giftigt. APTES ska hanteras endast under en flödes huva och med handskar. - Sätta glasskivor (framställda i 2.3.1) på en keramisk galler och plats inne i exsickator.
- Ansluta exsickatorn till en membranpump och kördes vid maximal effekt i 30 min för att alstra ett lågt vakuum.
- Stäng ventilen i exsickator och stänga av pumpen.
- Värm exsickatorntill ca 50 ° C under 1 h.
- Öppna exsickatorn och samla bilderna.
- Överföra till en annan ren exsickator för lagring i upp till 48 timmar vid rumstemperatur (20 till 30 ° C).
- Avsättning av det första skiktet av protein - bovinserumalbumin märkt med biotin (BSA-biotin)
- Placera en av bilderna som framställts i avsnitt 2.3 på en PTFE stöd.
- Deposition 1 ml 25 | ig / ml BSA-biotin löst i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Låt stå 30 minuter vid rumstemperatur (20 till 30 ° C).
- Skölj 10 gånger med PBS. Lagra provet i upp till 24 h vid 4 ° C i skydd mot ljuskällan.
- Avlägsnande av aluminiummask
- Inkubera objektglasen i en lösning av NaOH i PBS (framställd genom droppvis tillsats av 1 M NaOH till ca 100 ml PBS för att erhålla pH≈12) över natten vid rumstemperatur (mellan 20 och 30 ° C).
VARNING. NaOH är frätande och bör hanteras med handskar. - Skölj10 gånger i ultrarent vatten.
- Inkubera objektglasen i en lösning av NaOH i PBS (framställd genom droppvis tillsats av 1 M NaOH till ca 100 ml PBS för att erhålla pH≈12) över natten vid rumstemperatur (mellan 20 och 30 ° C).
3. Avsättning av stöds lipiddubbelskikt (SLB)
- Rengöring av Langmuir tråg
- Avlägsna vattnet i PTFE inneslutning av Langmuir tråg med hjälp av en pump.
- Rengör med en luddfri non-woven engångshandduk indränkt i kloroform.
VARNING. Kloroform är toxiska och bör manipuleras på ett väl ventilerat utrymme, med en mask (eller under ett flöde-huva) och med lämpliga handskar. - Ren 4 gånger med ljummet ultrarent vatten (40 till 50 ° C).
- Rengör minst 6 gånger med kallt ultrarent vatten.
- Avsättning av det första lipidskiktet
- Placera PTFE brickor i PTFE inneslutning av Langmuir tråg och sedan fylla den med ultrarent vatten.
- Använda kontrollmjukvaran hos Langmuir anordningen för att ställa det uppmätta trycket till 0 mN / m.
- Använda en spruta gastät glas / metall för avsättning 30 | il av en 1 mg / ml lipidlösning (1, 2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) i kloroform) på ytan av vattnet. Kloroformen förångas och de lipidmolekyler bildar spontant ett monoskikt.
- Använda kontrollmjukvaran för att komprimera lipidmonolager genom stängning av PTFE-barriären tills det önskade trycket (27 mN / m för DOPC) uppnås.
- Använda kontrollmjukvaran för att doppa glasskivan framställd i avsnitt 2.5.2 i PTFE-höljet med hjälp av en motordriven klämma.
- Hålla sliden, i klämman, vinkelrätt mot luft-vattengränsytan. Använda kontrollmjukvaran för att höja det långsamt (15 mm / min) genom gränssnittet, medan ett konstant tryck upprätthölls vid 27 mN / m.
- Rum i en torr miljö för antingen omedelbar användning eller för lagring upp till 24 h vid rumstemperatur (mellan 20 och 30 ° C).
- Avsättning av det andra lipidskiktet
- Bibehålla ytans trycket i Langmuir tråget vid det önskade värdet av 27 mN / m. Komprimera med användning avstyrprogram av Langmuir apparat och / eller lägga till en liten mängd av lipid för att uppnå det önskade trycket.
- Placera glasskivor som bär lipidmonolager, framställd i avsnitt 3.2.6, horisontellt på ytan av vattnet. Säkerställa att varje objektglas flyter ovanför en PTFE-bricka.
- Skjuta glasskivor ner, en bild i taget, till dess motsvarande PTFE-bricka med hjälp av PTFE eller metall pincett så att de är nedsänkta i vattnet. Undvik att luta bilderna samtidigt som du trycker.
- Använda PTFE eller metall pincett för att överföra PTFE brickor innehållande objektglasen i en kristallisator fylld med ultrarent vatten och se till att sliderna inte utsätts för luft.
- Använda PTFE eller metall pincett för att överföra, under arbetet under vattnet, en dubbelskiktsbelagd glasskiva i en observationskammare.
OBS: Den observationskammaren placeras under vatten inne i kristallisatorn. Observationskammaren är skräddarsydd och består av en PTFE-ring med en gummitätning end höljen stål, som kan monteras under vattnet för att göra en vattentät kammare, vars bottenyta är gjord av glasskivan som tidigare belagts med lipidbiskiktet. - Stänga kammaren samtidigt som man fortsätter att arbeta under vatten och se till att ca 1 ml av vatten är fångad inuti kammaren.
- Ta den sammansatta kammaren ur vattnet. Se till att det är vattentätt och läckage fri.
- Ersätta 1 ml av ultrarent vatten närvarande i observationskammaren med PBS genom att lägga till och ta bort 500 mikroliter av PBS 10 gånger. Säkerställa att kammaren är aldrig fria från vätska.
- SLB blockeringssteg
- Införa 100 ^ g / ml bovint serumalbumin (BSA) i observationskammare innehållande sliden framställd i avsnitt 3.3.6 och inkubera under 30 min vid rumstemperatur (mellan 20 och 30 ° C).
- Skölj dubbelskiktet genom att ta bort och lägga till 500 mikroliter av PBS 10 gånger. Dubbelskiktet kan hållas 24 h vid 4 ° C.
4. Funktionalise med Ligander
- Lägga fluorescerande eller icke-fluorescerande neutravidin (NAV, en deglykosylerat version av avidin inte laddat vid pH 7) vid 2 ug / ml in i kammaren innehållande sliden framställd i avsnitt 3.4.2 för 30 min vid rumstemperatur (mellan 20 och 30 ° C).
- Skölj genom att lägga till och ta bort 500 mikroliter PBS 10 gånger.
- Lägga biotinylerad anti-CD3 vid 2 | ig / ml till den kammare som innehåller sliden framställd i avsnitt 3.4.2. För dubbelfunktionalisering av SLB och prickar, lägga Fc-ICAM-1 His-tag vid 5 | ig / ml (här är dubbelskiktet gjort av DOPC + 1% av nitrilotriättiksyra (NTA) lipider). Låt stå i 30 min vid rumstemperatur (mellan 20 och 30 ° C).
- Skölj genom att lägga till och ta bort 500 mikroliter av PBS 10 gånger
- Ersätta PBS med cellmedium (PBS + 0,1% BSA) genom att lägga till och ta bort 500 mikroliter av cellmediet 10 gånger.
- Lämna 200 mikroliter av cellmedium i chamber med sliden.
- Placera kammaren för 10 min vid 37 ° C före tillsats av celler.
5. Cell Deposition (se för mer referens 7)
- Noggrant deponera 400 mikroliter av cellsuspensionen in i kammaren. Inkubera cellerna under 30 min vid 37 ° C.
- Fixera cellen med 2% paraformaldehyd (PFA) under 15 min vid 37 ° C. Ersätta PFA med PBS genom upprepad avlägsnande och tillsats av 500 mikroliter PBS.
6. Observation
- Proteo-lipidiska Nano-mönster och SLB flytbarhet
- Använda ett fluorescensmikroskop för att avbilda proteinmönstret i epi-fluorescens-läge med lämplig belysningsvåglängd (639 nm) och filter kuber (t ex här, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688).
OBS: Intensiteten av signalen kan kvantifieras för att uppskatta mängden av protein i och utanför prick. Använda en lämplig belysningsvåglängd (330 nm) och filter kub att avbilda dubbelskiktet (BP 365/12, FT 395, LP 397), som framträder klart med mörka hål. - Använda kontinuerlig fotoblekning (CPB) teknik 13, 15 för att mäta diffusionskonstanten för spårämnes lipider i dubbelskiktet. Denna iakttagelse görs företrädesvis strax efter SLB nedfall.
NOTERA: För att kvantifiera diffusionskonstanten, är två parametrar som mäts under CPB processen: den specifika blekningstiden av färgämnet (spänd) och sönderfallslängden av det fluorescerande profilen av halo bildas runt blekt område (tauD). Det första erhålls genom att plotta tidsutvecklingen av fluorescensintensiteten i centrum av den belysta fältet under CPB processen. Den andra erhålls genom plottning av intensitetsprofilen vid kanten av den belysta zonen (medelvärde över 12 linjer och 5 bilder efter steady-state har uppnåtts). Kurvorna är utrustade för att erhålla spänt och tauD. Diffusionskonstanten ges av TAuD 2 / spänd (D =
).
- Använda ett fluorescensmikroskop för att avbilda proteinmönstret i epi-fluorescens-läge med lämplig belysningsvåglängd (639 nm) och filter kuber (t ex här, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688).
). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fluorescensbilder analyserades för att mäta avståndet och storleken på prickarna. Typiskt avstånd befanns vara 1900 ± 80 nm och typiska dot-storlek var 600 ± 100 nm (Figur 1 g). Avståndet bestäms av storleken på kulorna som används för masken. Dot-storlek sätts av pärl-storlek såväl som deponeringsbetingelser. SLB avsätts unikt runt protein prickar och inte på dem (figur 2), med perfekt komplementaritet mellan hålen som ses i SLB avbildningskanalen och prickarna som ses i NAV avbildningskanalen. Analys av kontinuerlig fotoblekning data visar att lipiderna i det mönstrade dubbelskiktet förbli flytande och ha en typisk diffusionskonstanten av 5 xm ^ / s (Figur 3).
Figur 1: Schematisk representation av tillverkningssteg. (a -7 Torr, Argon flux 10 sccm, processtryck 6,2 mTorr, avbildad vid accelerationsspänning på 5 kV. Bilderna bekräftar observationen gjord med optisk mikroskopi (bild ingår ej) innan aluminiumavsättning att pärlorna är anordnade i ett monoskikt centrerad hexagonalt gitter på glaset-slide. (B) Sekundär mask av aluminium skapas av sputteringbeläggning efter avlägsnande av den primära strängen-mask. (C) Avsättning av organosilan och BSA-biotin fastän den sekundära masken. (D) Avlägsnande av aluminium avslöjar nano prickar av BSA-biotin. (E) Avsättning av SLB. (F) Bindning NAV till BSA-biotin. (G) Bindning anti-CD3 till NAV. Infällda bilden visar epi-fluorescensbild av de nano dots arrayer. Här NAV är fluorescensmärkt. Typiska dot-storleken är 600 ± 100 nm och typiskt avstånd är 1900 ± 80 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Komplementaritet av nano-prick och SLB mönster. (A, b) Epi-fluorescensbilder av fluorescerande NAV nano prickar och av SLB med fluorescerande spårämnes lipider. (C) Sammansatt bild av de nav prickar (röda) i havet av SLB (grön) visar perfekt komplementaritet av NAV och SLB. Fast Fourier Transform (FFT) bild i infällningen indikerar långdistansordning. Scale bar: 4 | im.rge.jpg" target = '_ blank'> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kvantifiering av lipid diffusion i SLB. (A) Epi-fluorescensbild av en SLB före blekning. Protein prickar dyker upp som mörka hål i en ljus hav av lipider. Fält membran begränsar det belysta området. (B) Epi-fluorescens av SLB efter kontinuerligt blekning under 50 s. Halo syns inuti regionen som avgränsas av fältet-membranet indikerar att lipiderna är mobila. Scale bar: 10 | j, m. (C) Genomsnittlig intensitetsprofil längs kanten av fältet-membranet (överst) och sönderfallet av intensiteten över tiden under strandning processen (botten). Dessa data analyseras för att extrahera diffusionskonstanten, som typiskt är 5 xm ^ / s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiska stegen inom det protokoll som beskrivs ovan är relaterade till bildningen av proteinnano punkter eller back-fyllning av utrymmet runt prickarna med en uppburen lipiddubbelskikt. Det första kritiska steget med avseende på proteinnano prickar är framställningen av vulsten-masken. Rengöringen av cover-slide är kritisk. Objektglasen måste antingen rengöras med en rengöringslösning som rekommenderas för rengöring kvartskyvetter, eller med syrgasplasma. Andra rengöringstekniker såsom nedsänkning i etanol eller iso-propanol behandling inte gör glaset tillräckligt hydrofil och därför inte stödja bildandet av en stor-täckning vulst monoskikt. På samma gång, ytan av objektglaset måste vara kompatibel med det efterföljande steget för bildning av den SLB av Langmuir-Blodgett-tekniken 7, 15, 16. Nästa kritiska steget är avsättning och avlägsnande av enLuminum. Om avsättningen sker via sputtringsteknik, som gjort här, målet bör vara dopat med kisel (vid 1%). Annars, om målet är tillverkad av rent aluminium, är det avsatta skiktet är svårt att avlägsna med alkalihydroxidlösning såsom beskrivits ovan, förmodligen på grund av bildandet av aluminiumoxid och interpenetration mellan avsatt aluminiumskikt och glasskiva substrat. Varaktigheten av nedfall bestämmer storleken på protein punkterna 9, men här har vi arbetat med ett enda nedfall tid och därför enda punktstorlek. Provet kan lagras under omgivningsbetingelser för flera månader efter aluminiumdeponering och i ungefär en vecka efter avsättningen av BSA-biotin.
Den andra avgörande steg berör avsättningen av SLB. Rengöring av glaslocket-slide är återigen en avgörande viktig punkt. Vilket är fallet för alla Langmuir-Blodgett nedfall arbete bör allt material som används vara gjorda av glas eller Polytetrafluoroethylene (PTFE) och bör vara väl rengjord. Efter avsättning av det första lipidmonolager kan täck-bilderna lagras i ett par dagar, men efter avsättningen av det andra monolager, måste de användas omedelbart.
Medan vi har visat protokollet för att skapa anti-CD3-nano prickar för användning i T-lymfocyt vidhäftningsstudier 9, 13, är förfarandet mycket flexibel och kan anpassas för någon biotinylerat protein. Sammansättningen av lipiddubbelskiktet kan lätt ändras och det kan vidare funktionaliseras om så önskas. En viktig punkt att tänka på är möjlig ospecifik absorption av proteiner, särskilt på lipidbiskiktet omger prickar.
Den största begränsningen av tekniken uppkommer från användningen av kolloidal-bead självsammansättning för den primära masken. Att vara en bottom-up-teknik, delar det några av problemen med alla sådana metoderexempelvis brist på flexibilitet och full kontroll över mönsterform. Mönstret gitter nödvändigtvis speglar symmetri pärla mask och är därför alltid sexkantiga. Formen på mönstret motiv är en cirkel och bestäms av en kombination av vulst-storlek och varaktigheten av aluminiumavsättning 9, 13. Alternativa tekniker för styrning av punktstorleken har också föreslagits 14, 17, 18.
Substrat nano mönster med proteiner, proteinfragment eller peptider har i stor utsträckning använts i det förflutna för att sondera cellytan interaktioner, speciellt vidhäftning 19 och migration 20. Banbrytande arbete har visat att vävnadsbildande celler misslyckas att sprida på mönster med en stigning som är större än ett givet tröskelvärde 21, och ytterligare undersökning sho wed att längden skala av detta fenomen bestäms av storleken på talins, som är avgörande för att länka grinreceptorer till aktincytoskelettet 22. Men i alla dessa studier var proteinerna kopplade till guldnanopartiklar, som själva immobiliserade på glas.
I samband med T-celler, Proteo-lipidiska membran, typiskt härma antigenpresenterande celler, har i stor utsträckning använts för att förstå grundläggande aspekter av T-cellsfunktion 6. Geniala nanomönstringstekniker har använts för att skapa inhägnader med metallbarriärer separera proteinfunktion SLB plåster, som har gett insikt i strukturen och anslutning av T-cellen / APC-gränssnittet 23. Denna typ av nano mönstring är dock mycket annorlunda än proteinnano punkter som föreslås här. Nyligen har nanokluster skapas med hjälp av kemisk bindning av proteinfunktion lipiderss = "xref"> 3, som belyser en följd av receptorklusterbildning. Fördelen var att, till skillnad från förevarande fall kunde kluster i princip vara sig själva mobilen. Emellertid är sådana spontant bildade kluster nödvändigtvis mindre väl kontrollerad i termer av storlek och densitet än förformade proteinnano prickar som beskrivs här.
Vi ser att proteinet nano dot dekorerade SLBs presenteras här kan användas för att undersöka olika aspekter av cell-celladhesion. En uppenbar fråga som uppstår är om, såsom beskrivits ovan för vävnadsbildande celler 19, alltför lymfocyter ha en gränslängd-skala associerad med vidhäftning. Preliminära resultat tyder på att åtminstone när vidhäftningen förmedlas av TCR-komplexet, är densiteten av ligander snarare än avståndet den definierande parameter för spridning och aktivering 10, 11, 12
De två viktigaste fördelarna med dessa Proteo-lipidisk mönster är kompatibiliteten av substraten med avancerad optisk mikroskopi och lättheten att framställa, vilket gör dem kompatibla med användning-och-kasta tillämpningar. Efter aluminium nedfall, kan alla förberedelser steg utföras på en vanlig våt-lab bänk. I framtiden kan man tänka sig att den aluminiumbelagda och glasstödda pärla-masker som produceras i en specialiserad anläggning överförs och lagras i biologiska laboratorier för användning och när den behövs. Med tanke på detta tror vi att dessa substrat har potential att bli den plattform som väljs för att studera interaktionen mellan celler med kontrollerad nano mönstrade Proteo-lipidisk membran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Laurent Limozin, Pierre Dillard och Astrid Wahl för fortsatt givande diskussioner om cellulära applikationer. Vi vill också tacka Frederic Bedu från PLANETE renrum anläggning för hans hjälp med SEM observationer. Detta arbete har delvis finansierats av Europeiska forskningsrådet via bidrag nr 307.104 FP / 2007-2013 / ERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | ||
| Observation chamber | Home made | ||
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 | |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | ||
| Desiccator | Labbox | ||
| Crystallizer | Shott | ||
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 | |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 | |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | ||
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 | |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 | |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C | |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 | |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 | |
| Film balance | NIMA | Medium | |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system | |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | ||
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
References
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
- Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
- Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
- Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
- Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
- Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
- Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
- Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
- Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
- Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
- Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
- Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
- Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
- Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
- Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
- Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
- Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
- Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398 (2012).
- Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).
