Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Published: April 23, 2017 doi: 10.3791/55060

Summary

Biz bir sıvı lipid iki katmanının çevrili nanometrik protein yamaları ile cam fonksiyonel hale getirilmesi için bir protokol mevcut. Bu alt tabakalar gelişmiş optik mikroskop ile uyumludur ve hücre yapışması ve göç çalışmaları için platform olarak hizmet etmesi beklenmektedir.

Abstract

Şu anda hücre biyolojik çalışmalar için pasifize yüzeyinin denizinde yapışkan proteini adaların sıralı dizi oluşturulurken önemli bir ilgi vardır. Geçmiş yıllarda, bu canlı hücreler kendilerine sunulan moleküllerin biyokimyasal doğaya hem de bu moleküller sunulmaktadır yolu değil, tepki giderek daha açık hale gelmiştir. Birçok biyoloji laboratuvarlarında artık standart nedenle protein mikro desenleri olan oluşturma; Nano-desenler de daha erişilebilir. Bununla birlikte, hücre-hücre etkileşimleri bağlamında, desene bir ihtiyaç sadece proteinleri değil, aynı zamanda, lipid ikili tabakaları vardır. Böyle ikili proteo-lipit desenleme şimdiye kadar kolayca erişilebilir olmamıştır. Biz cam üzerinde desteklenen bir protein nano nokta oluşturmak ve desteklenen bir lipit çift katman (SLB) ile arası nokta alanı doldurmak için genellikle bir yöntem önermektir, basit bir teknik sunar. izleyici foto-ağartma itibaren floresan lipidleri SLB dahil, biz iki tabakalı in-pl hatırı sayılır gösterdiğini kanıtlarane akışkanlığı. floresan gruplarla protein noktalar fonksiyonlandırmak görüntünün onları ve düzenli bir altıgen kafes içinde sıralanır olduğunu göstermek için bize izin verir. Tipik nokta boyutu yaklaşık 800 nm'dir ve burada gösterilen aralık 2 mikrondur. Bu alt-tabakalar, hücre yapışması, göç ve mekano-algılama çalışmaları için yararlı platformlar hizmet etmesi beklenmektedir.

Introduction

Hücre yapışması, hücre dışı matris üzerinde veya başka bir hücre üzerinde kendi meslektaşı bağlanabilen olan hücre zarı üzerinde mevcut olan özel hücre yapışma molekülleri (CAMlar) proteinleri aracılığıyla gerçekleşir. Yapışan hücreler üzerinde, her yerde integrin ve cadherin dahil olmak üzere en yapışma molekülleri, kümelerin 1 şeklinde bulunurlar. Antijen sunan hücreler ile T lenfositler (T hücreleri) etkileşmesi (APC) iki hücre arasındaki ara yüzeyde oluşan reseptör kümelerinin önemi özellikle çarpıcı bir örnek teşkil etmektedir - genellikle bir immünolojik sinaps adı. CSMAC (daha büyük bir orta moleküllü bir küme oluşturmak için platformlar 2, 3, 4 sinyal olarak görev yapar ve en sonunda merkezi T hücresi formu mikron çaplı kümelerinin yüzeye APC T hücre reseptörleri (TCR'ler) ile ilk temas oluşturan üzerine )lass = "xref"> 5, 6, 7. Son zamanlarda, bu APC tarafında gösterilmiştir, TCR'nin ligandların da 8 kümelenir.

APC ilgili protein ile fonksiyonel bir yapay yüzeyi tarafından taklit edilir T hücre-APC etkileşiminin, hibrid sistem dağıtım, bağlamında, sinaptik arayüzü 2, 3, 4, 5, 6, 7 anlaşılmasını büyük olan . Bu bağlamda, hedef hücrenin bir veya daha fazla yönlerini yakalamak APC mimetik yüzeyleri tasarlamak için son derece önemlidir. ligandlar desteklenen lipid çift tabakaları aşılanmış Örneğin, bunlar, çift-katlı düzleminde difüze APC yüzeyi üzerinde durumu taklit ve aynı zamanda oluşmasına izin verebilircSMAC 6, 7. Benzer bir şekilde, APC üzerinde kümeleri polimerler 9, 10, 11, 12, 13, 14 bir denizde ligandların yaratırlar tarafından taklit edilmiştir. Ancak, bu iki özellik şu ana kadar kombine edilmemiştir.

Burada difüzyon lipidler ile bir lipit çift katmanı ile çevrelenir, anti-CD3 (TCR kompleksinin hedefleyen bir antikor) nano-noktaları oluşturmak için yeni bir teknik açıklanmaktadır. Iki tabakalı Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaefer tekniği 7, 15, 16 kullanılarak yatırılır ve eğer arzu edilirse, belirli bir protein ile işlevselleştirilebilir - örneğin, T hücresi integrin ligandı (ICAM1 olarak adlandırılır). Buna ek olarak, anti-CD3 protein noktalar could başka bir antikor ya da CAM ile değiştirilebilir. T hücre yapışma çalışmaları için platform olarak ileride kullanılmak üzere proteinler seçilmiş olmakla birlikte, burada açıklanan bir strateji herhangi bir protein ve hatta DNA için uyarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Temizleme Kapaklı-slaytlar ve Gözlem Odaları

  1. Politetrafloroetilen (PTFE) gibi bir inert malzemeden yapılmış bir çok slaytlı tepsi üzerinde cam kapak-slaytlar düzenlemek.
  2. bir yüzey aktif madde çözeltisi içinde slaytlar ile tepsi ve gözlem odasına (uygun olan kuartz küvetler temizlenmesi için önerilen herhangi bir ürünü) daldırın.
  3. (20 ve 30 ° C arasında), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yüzey aktif madde çözeltisi içinde bir ultrasonik banyo, ultra ses dalgalarına maruz bırakın kullanılması.
  4. ultra-saf su ile 5 kez (18.2 MΩ.cm, 0.059 uS / cm) ile durulayın.
  5. (20 ve 30 ° C arasında), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yüzey aktif madde çözeltisi içinde ultra ses dalgalarına maruz.
  6. ultra saf su ile 10 kez durulayın.
  7. Tekrarlayın iki kez 1.5 ve 1.6 adımları tekrarlayın.
  8. en fazla bir hafta süresince oda sıcaklığında (20 ° ila 30 ° C) su içinde depolanmalıdır.

Protein Nano nokta 2. Fabrikasyon

  1. boncuk birikmesi
    1. deposit 15 derecelik bir eğim ile tutulan (170 um kalınlığı 24 x 24 mm), silis boncuklar (% 2 v / v, 70 uL), bir kapak sürgü üzerinde damla damla süspansiyon.
    2. 90 °, her 15 saniye ile cam saygısız Süspansiyon yaklaşık 1 dakika boyunca yayılmıştır olsun.
    3. Sıvı ortam koşulları altında buharlaşmasına izin verin.
    4. 2 güne kadar çevre koşullarında temiz bir cam ya da PTFE bölmesi içinde depolayın.
  2. Alüminyum birikmesi
    1. Bir alüminyum (% 99) ila yaklaşık 105 mm arasında bir mesafede döner bir masaya (RF) magnetron püskürtme ekipmanı 8, bir radyo frekansı içindeki slaytları (bölüm 2.1'de elde edilmiş) yerleştirin: silikon (% 1) hedefi.
    2. Bir turbo moleküler pompası kullanılarak 2.6 x 10 -4 Pa birikim bölmesinin aşağı pompa. Bu adım, olası gaz kirliliklerin uzaklaştırılması için önemlidir.
    3. 0.8 Pa (6.6 mTorr) bir basınçta, 10 sccm'lik bir akı ile saf argon atmosferi (5 N,% 99.999) tanıtılması.
    4. RF güç jeneratörü açın.
      Not: Burada, 13.56 MHz frekansında 400-600 W radyofrekans gücü tipik bir aralık kullanılmıştır. RF jeneratörü kapasitif plazma birleştirme modunda bir denkleştirme ağı ile birlikte kullanılır. Yansıyan güç izlenir ve ağ adaptasyonu kullanılarak en aza indirilmiştir.
    5. Plazma stabilize edildikten sonra, 2 dakika hedefinin yüzeyi olası yabancı maddelerin ayrılması için kapalı bir kapak tutmak için püskürtmeyle çökeltilmesi.
    6. deklanşör açın ve 60 dakika 200 nm kalınlığında bir cam slayt alüminyum yatırmak için püskürtme devam etmesini sağlar.
    7. Argon akışını kesme biriktirme odasından turbomolekuler pompa izole etmek için vanayı kapatın ve temiz n bölmesinin havalandırılmasıitrogen oda basıncı elde edildi. alüminyum kaplı slaytlar kurtarma. bir aya kadar çevre şartları altında temiz ve hava geçirmez bir şekilde sızdırmaz kılınmış bir cam ya da PTFE kutusuna, saklayın.
  3. Organosilan buhar biriktirme
    1. (20 ve 30 ° C arasında 50 W, 50/60 Hz), bir ultrasonik banyo içinde 30 s n için oda sıcaklığında ve ultra sonikasyon ultra saf su içinde aşama 2.2.6 hazırlanan alüminyum kaplı slayt bırakın.
    2. bir desikatör altındaki (3-aminopropil) -triethoxysilane (APTES'le) mevduat 0.5 mL.
      DİKKAT: APTES'le kolayca buharlaşır ve toksik olan bir organosilan, bir. APTES sadece akış başlığı altında ve eldiven ile ele alınmalıdır.
    3. kurutucunun içindeki bir seramik ızgara ve yerde (2.3.1 hazırlandı), cam slaytlar koyun.
    4. bir zar pompası Kurutucuyu bağlayın ve 30 dakika düşük bir vakum oluşturmak için en yüksek güçte çalıştırın.
    5. Kurutucunun vanayı kapatın ve pompayı kapatın.
    6. desiccator ısıtın1 saat boyunca yaklaşık 50 ° C arasındadır.
    7. desiccator açın ve slaytlar toplamak.
    8. Oda sıcaklığında 48 saate kadar (20 ila 30 ° C) depolama için başka bir temiz desikatöre aktarın.
  4. proteinin, birinci tabakanın birikmesi - biyotinle etiketlenmiş sığır serum albümini (BSA-biyotin)
    1. PTFE destek üzerinde bölüm 2.3'de hazırlanan slaytlar bir şekilde yerleştirin.
    2. Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içinde çözülmüş 25 mg / ml BSA-biyotin Deposit 1 ml. Oda sıcaklığında (20 ila 30 ° C) 30 dakika boyunca bırakın.
    3. PBS ile 10 kez yıkayın. Işık kaynağından uzakta 4 ° C'de 24 saate kadar boyunca örnek saklayın.
  5. alüminyum maske çıkarılması
    1. Oda sıcaklığında (20 ° ila 30 ° C) aşırı gece (pH≈12 elde etmek için yaklaşık 100 ml PBS, 1 M NaOH damla damla ilave etmek suretiyle hazırlandı) PBS içinde bir NaOH çözeltisi içinde slaytlar inkübe edin.
      DİKKAT. NaOH korozif ve eldiven kullanarak ele alınmalıdır.
    2. DurulamaUltra saf su içinde 10 kat.

Desteklenen lipid iki katmanlı 3. Çökelme (SLB)

  1. Langmuir yalak Temizleme
    1. bir pompa kullanılarak Langmuir oluğun PTFE muhafaza içinde su çıkarın.
    2. kloroform içinde ıslatılmış, havsız dokunmamış tek havlu ile temizleyin.
      DİKKAT. Kloroform zehirlidir ve (ya da bir akış başlığı altında) bir maske ile ve uygun eldiven, iyi havalandırılan bir manipüle edilebilir olmalıdır.
    3. ılık ultra-saf su (40 ila 50 ° C) ile temiz 4 kez.
    4. Soğuk ultra saf su ile temizleyin en az 6 kere.
  2. birinci lipid tabakasının birikmesi
    1. Langmuir oluğun PTFE muhafaza PTFE tepsiler yerleştirin ve daha sonra, aşırı saf su ile doldurun.
    2. 0 mN / m olarak ölçülmüştür basıncını ayarlamak için Langmuir aygıtın kontrol yazılımı.
    3. (1 mg / ml lipid çözeltisi 30 uL yatırmak 1 gaz geçirmez bir cam / metal şırınga kullanınSu yüzeyinde 2-dioleoil-sn glisero-3-fosfokolin, kloroform (DOPC)). kloroform buharlaşır ve lipit molekülleri kendiliğinden bir tek tabaka oluşturur.
    4. ulaşıldığında (DOPC 27 mN / m) istenen basınca kadar PTFE bir bariyer kapatarak lipit tek tabaka sıkıştırmak için kontrol yazılımı.
    5. Motorlu bir kelepçe kullanılarak PTFE mahfaza içine bölüm 2.5.2'de hazırlanan cam slayt daldırma için kontrol yazılımı.
    6. dikey hava-su ara yüzüne, kelepçe, slayt tutun. / M 27 mN sabit bir basınç muhafaza edilirken, arayüz aracılığıyla yavaş yavaş (15 mm / dak) yükseltmek için kontrol yazılımı.
    7. Oda sıcaklığında 24 saate kadar (20 ° ila 30 ° C) ya da derhal kullanmak için ya da depolama için, kuru bir ortamda bir yer.
  3. Geriye, ikinci lipit tabakanın birikmesi
    1. / M 27 mN istenen değerde Langmuir teknedeki yüzey basıncını muhafaza edin. kullanarak sıkıştırınLangmuir aparat ve / veya kontrol yazılımı arzu edilen basınç elde etmek için bir lipid az miktarda ekleyin.
    2. yatay olarak su yüzeyinde, bölüm 3.2.6 hazırlanan lipit tek tabaka, taşıyıcı cam slaytlar yerleştirin. Her slayt PTFE tepsinin üstünde yüzen emin olun.
    3. Aşağı cam slaytlar itin suda batırılır şekilde PTFE ya da metal cımbız kullanarak karşılık gelen PTFE tepsisine bir seferde bir kayar. iterken slaytlar devirme kaçının.
    4. Ultra saf su slaytlar havaya maruz değildir emin ile dolu bir kristalizöre slaytlar içeren PTFE tepsileri aktarmak için PTFE ya da metal cımbız kullanarak.
    5. bir gözlem haznesine, bir iki tabakalı kaplama cam slayt sualtı çalışma sırasında, transfer PTFE ya da metal cımbız kullanarak.
      NOT: gözlem odası kristalleştirici içindeki suyun altına yerleştirilir. gözlem odası özel yapılmış ve bir lastik contası, bir PTFE halka oluşurAlt yüzeyi daha önce lipit çift katman ile kaplanmış bir cam slayt yapılmış olan bir su sızdırmaz bir oda için sualtı monte edilebilir d çelik kılıfı.
    6. Su altında çalışmaya devam ve suyun yaklaşık 1 ml bölmesi içinde tutulur sağlarken bölmeyi kapatın.
    7. Su dışında monte odası al. su geçirmez ve kaçak serbest olduğundan emin olun.
    8. ekleme ve PBS 10 kez 500 uL kaldırarak PBS ile bir gözlem odasına ultra saf suyun bir 1 mL değiştirin. kamara sıvısının asla yoksun olduğundan emin olun.
  4. SLB engelleme adımı
    1. Bölüm 3.3.6 hazırlanan slayt içeren bir gözlem odasına sığır serum albümini, 100 ug / mL (BSA) tanıtılması ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (20 ° ila 30 ° C) inkübe edilir.
    2. çıkarılması ve PBS 10 kez 500 uL eklenmesiyle çift katman durulayın. iki tabakalı 4 ° C 'de 24 saat muhafaza edilebilir.

Ligantlar içeren 4. işlevselleştirilmesi

  1. 20 ve 30 ° arasında oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bölüm 3.4.2'de hazırlanan slayt (ihtiva haznesine 2 ug / mL'de floresan veya floresan olmayan nötravidin (NAV, avidinin Deglikosile versiyonu pH 7 dolu değildir) ekleyin C).
  2. ekleme ve PBS 10 kez 500 uL kaldırarak durulayın.
  3. Bölüm 3.4.2'de hazırlanan slayt içeren hazneye 2 ug / mL biyotinlenmiş anti-CD3 ekleyin. SLB ve noktaların çift işlevselleştirilmesi için (burada, iki tabakalı nitrilotriasetik asit (NTA), lipidlerin +% 1 DOPC yapılmıştır) 5 ug / mL, Fc-ICAM-1, His-etiketi ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (20 ° ila 30 ° C) bekletin.
  4. 10 kez ilave edilmesi ve 500 ul PBS kaldırarak durulayın
  5. 10 kez ilave edilmesi ve hücre ortamının 500 uL kaldırarak hücre ortamıyla PBS (PBS +% 0.1 BSA) değiştirin.
  6. CHAMBE hücre ortamının 200 mcL bırakınslayt r.
  7. hücreler ilave edilmeden önce 37 ° C 'de 10 dakika süre ile odasına yerleştirin.

5. Hücre Birikimi (ayrıntılar için referans 7)

  1. Dikkatlice hazneye hücre süspansiyonunun 400 uL yatırmak. 37 ° C'de 30 dakika boyunca kuluçkaya bırakılır.
  2. 37 ° C'de 15 dakika boyunca paraformaldehit% 2 (PFA) ile hücreyi saptamak. sürekli çıkarma ve PBS 500 uL PBS ile PFA değiştirin.

6. Gözlem

  1. Proteo-lipit Nano desen ve SLB akışkanlığı
    1. BS TFT 506 + 582 + 659;, EM TBP 526 + 601, örneğin, burada EX TBP 483 + 564 + 642 (uygun aydınlatma dalga boyu (639 nm) ve filtre küpleri kullanarak görüntü epi-floresan modunda protein deseni, bir floresans mikroskobu kullanarak 688).
      Not: sinyalin yoğunluğu içinde ve nokta dışında protein miktarını tahmin etmek için ölçülebilir. uygun bir aydınlatma dalga boyu (330 nm) ve f kullanınResme ilter küp karanlık deliklere sahip aydınlık görünen iki tabakalı (BP 365/12, FT 395, LP 397).
    2. Çift-katlı izleyici lipidlerin difüzyon katsayısına ölçmek için sürekli verilmedi ağartma (CPB) tekniği 13, 15 kullanın. Bu gözlem, tercihen sadece SLB birikimi sonra yapılır.
      Not: Difüzyon sabit ölçmek için, iki parametre KPB işlemi sırasında ölçülür: boya (gergin) ve ağartılmış alanı (tauD) etrafında oluşan halo floresan profilinin bozunma uzunluğunun belirli bir ağartma süresi. İlk KPB işlemi sırasında yanar alanın merkezinde floresan yoğunluğunun zaman evrim çizilmesi ile elde edilir. İkinci (kararlı durum ulaşıldıktan sonra 12 satır ve 5. görüntülerin ortalaması) aydınlatılan bölgenin kenarında yoğunluk profili çizilmesi ile elde edilir. eğriler, sarsıntısız ve tauD elde etmek üzere monte edilmiştir. difüzyon sabiti ta verilirUd 2 / gergin (D = Denklem ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fluoresans görüntüleri noktaların aralık ve boyutunu ölçmek için analiz edilmiştir. Tipik aralık olduğu bulunmuştur 1,900 ± 80 nm ve tipik nokta boyutu 600 ± 100 nm (Şekil 1 g) idi. aralık maskesi için kullanılan boncuk boyutuna göre ayarlanır. nokta boyutlu boncuk büyüklüğü gibi kaplama koşulları tarafından belirlenir. SLB SLB görüntüleme kanalı görülen delikler ve NAV görüntüleme kanal görülen noktalar arasındaki tam tamamlayıcılık ile onlara benzersiz protein noktalar çevresinde olup (Şekil 2) tatbik edilir. Sürekli verilmedi ağartma verilerinin analizi, desenli çift tabakası içinde lipidler akışkan olarak kalır ve 5 μm² / s (Şekil 3) tipik bir difüzyon katsayısına sahip olduğunu göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1: üretim aşamalarının şematik temsili. (a -7 Torr'dan Argon, 5 kV hızlandırma voltajı görüntülü 10 SCCM, işlem basıncı 6.2 mTorr, akı 9 başlangıç basıncında devrik mil nominal bir alüminyum kalınlığı 200. görüntü boncuklar, cam slayt üzerinde bir tek tabaka merkezli altıgen kafes içinde düzenlenmiş alüminyum birikimi önce optik mikroskopi (dahil değildir görüntüsü) ile yapılan gözlem teyit. (B) İlk değişim boncuk maskenin kaldırılmasından sonra püskürtülerek bırakılması tarafından oluşturulan alüminyum ikincil maskesi. İkinci maske olsa organosilan ve BSA-biyotin (c) Biriktirme. Alüminyum (d) çıkarılması BSA-biyotin nano noktalar ortaya çıkarılmıştır. SLB (e) Biriktirme. BSA-biyotin NAV bağlanması (f). (G) Bağlama NAV anti-CD3. Ankastre nano noktalar dizilerin epi-floresan görüntü gösterir. İşte nav floresan etiketli edilir. Tipik nokta boyutu 600 ± 100 nm ve tipik aralık 1.900 ± 80 nm'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

şekil 2
Şekil 2: Nano-nokta ve SLB desenin Tamamlayıcılık. (A, b) floresan NAV nano nokta ve floresan izleyici lipidleri ile SLB Epi-floresan ve görüntüler. (C) SLB (yeşil) denizde NAV noktalar (kırmızı) Kompozit görüntü NAV ve SLB mükemmel tamamlayıcılık göstermektedir. iç kümede Hızlı Fourier Dönüşümü (FFT) görüntü uzun menzilli sırasını gösterir. Ölçek çizgisi: 4 um.rge.jpg" target = '_ blank'> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3,
Şekil 3: SLB lipid difüzyon miktarının belirlenmesi. Ağartma önce SLB (a) Epi-floresan görüntü. Protein noktalar lipidlerin parlak denizde koyu delikleri gösteriyor. alan diyafram aydınlatılmış alanı sınırlar. 50 s boyunca sürekli olarak ağartılması sonra SLB (b) Epi-floresan. alan diyaframla ayrılmış bölge içinde, halo görebilir lipidler mobil olduğuna işaret etmektedir. Ölçek çizgisi: 10 um. (C) alan diyafram (üst) ve beaching işlemi (alt) sırasında zaman içinde yoğunluğu çürüme kenarı boyunca ortalama yoğunluk profili. Bu veriler, tipik olarak 5 μm² / s yayılma sabit, elde etmek için analiz edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yukarıda tarif edilen protokol içindeki kritik adım desteklenen bir lipit çift katman protein nano nokta veya noktalar çevresindeki alan arka-dolgu oluşumu ile ilişkilidir. Protein nano nokta ile ilgili olarak, ilk kritik bir adım boncuk maske hazırlanmasıdır. kapak slayt temizleme kritiktir. Slaytlar, ya da oksijen plazma ile kuartz küvetler temizlenmesi için önerilen bir deterjan çözeltisi ile temizlenmesi gerekir. etanol ya da izo-propanol tedavisinde daldırma gibi diğer temizleme teknikleri yeterince hidrofilik cam render yoktur ve bu nedenle, büyük bir kapsama boncuk tek tabaka oluşumunu desteklemez. Aynı zamanda, sürgü yüzeyi Langmuir-Blodgett tekniği 7, 15, 16 ile SLB oluşumu sonraki aşamada ile uyumlu olması gerekmektedir. sonraki kritik adım, birikme ve çıkarılmasıdırlaminum. çökeltme püskürtme tekniği vasıtasıyla ise burada yapıldığı gibi, hedef (% 1), silisyum katkılı olması gerekir. Hedef saf alüminyumdan yapılmış ise muhtemelen alüminyum oksit ve biriken alüminyum tabakası ve cam slayt alt-tabaka arasındaki iç içe oluşumuna, yukarıda tarif edildiği gibi, aksi halde, biriken tabaka, alkali hidroksit çözeltisi ile kaldırmak zordur. Biriktirme süresi 9 Ancak burada tek biriktirme zamanı ve bu nedenle tek nokta boyutu ile çalıştım protein noktaların boyutunu belirler. örnek BSA-biyotin çökeltilmesinden sonra bir hafta alüminyum birikimi aylarca sonra da çevre koşulları altında ve saklanabilir.

İkinci önemli adım SLB birikimi ile ilgilidir. cam kapak slayt temizlenmesi yine bir derece önemlidir noktasıdır. Herhangi bir Langmuir-Blodgett çökeltme iş için olduğu gibi, kullanılan tüm malzeme cam veya Po yapılmalıdırlytetrafluoroethylene (PTFE) ve titizlikle temiz olmalıdır. İlk lipid tek tabaka birikimi sonra, kapak slaytlar birkaç gün boyunca saklanabilir ama ikinci tek tabakalı birikimi sonra, hemen kullanılması gereken.

Biz T lenfosit yapışma çalışmalarda kullanım için anti-CD3 nano nokta oluşturmak için protokol göstermiştir iken 9, 13, prosedür son derece esnektir ve herhangi bir biyotinile protein için uyarlanabilir. çift ​​katlı lipid bileşimi kolayca değiştirilebilir ve istenirse ayrıca fonksiyonel hale getirilebilir. Dikkate alınması gereken bir önemli nokta özellikle noktalar çevreleyen lipit çift katman üzerinde, proteinlerin muhtemel spesifik olmayan emme olduğunu.

tekniğin başlıca sınırlaması birinci maske koloidal-boncuk kendini montaj kullanımı ortaya çıkar. tabandan tavana tekniği olmak, tüm bu yaklaşımların sorunların bazılarını paylaşanörneğin, model şekli üzerinde esneklik ve tam kontrol eksikliği. model kafes zorunlu boncuk maske simetrisini gösterir ve bu nedenle de her zaman altıgen şeklindedir. Model motifinin şekil bir dairedir ve boncuk büyüklüğü bir kombinasyonu ve alüminyum birikimi 9, 13 süresi ile tespit edilir. Nokta boyutu kontrol etmek için alternatif teknikler de, 18, 14 17 ileri sürülmüştür.

Proteinler, protein fragmanları ya da peptidleri ile Yüzeyleri nano desenler kapsamlı hücre-yüzey etkileşimlerini, özellikle yapışma 19 ve taşıma 20 araştırmak için geçmişte kullanılmıştır. Öncü çalışma doku-oluşturucu hücreler, belirli bir eşik 21 daha büyük saha ve daha fazla araştırma SHO desen yaymak için başarısız olduğunu göstermiştir Bu olgunun uzunluğu ölçekli 22 hücre iskeleti aktine integrin reseptörleri bağlayan aracı bulunmaktadır Talins, büyüklüğü ile ayarlandığını evli. Ancak, tüm bu çalışmalarda, proteinlerinin kendisinin cam üzerinde immobilize edildi altın nano parçacıklar için bağlanmıştır.

Tipik olarak, antijen-sunan hücreler taklit T hücreleri, proteo-lipit membranlar bağlamında, yoğun, T hücre fonksiyonunun 6 temel özelliklerini anlamak için kullanılmıştır. Hünerli nano desenleme teknikleri T hücresi / APC arabirimi 23 yapısı ve bağlantı fikir sağladı metal bariyerler ayırma proteinin fonksiyonel SLB lekelere sahip corrals oluşturmak için kullanılmıştır. Nano-desen Bu tür Bununla Burada önerilen protein nano noktalar çok farklıdır. Son zamanlarda, nano-kümeleri proteinin fonksiyonel lipitlerin kimyasal bağlantı kullanılarak oluşturulanreseptör kümelenme sonucu ışık tutacak p = "xref"> 3. avantajı mevcut durumda farklı olarak, kümeler prensipte kendileri mobil olabilir olmasıydı. Bununla birlikte, bu, kendiliğinden oluşan kümeler mutlaka daha az burada tarif edilen önceden oluşturulmuş bir protein nano noktalar daha boyutu ve yoğunluğu açısından kontrol edilir.

Biz nano nokta dekore SLBS Burada sunulan protein hücre-hücre yapışması farklı yönlerini araştırmak için kullanılabileceğini öngörmektedir. Ortaya çıkan bir belirgin soru doku oluşturucu hücreler 19 için yukarıda tarif edildiği gibi, çok yapışması ile ortaya çıkan bir iç uzunluk ölçeğini lenfositleri olup olmadığıdır. Ön sonuçlar, yapışma TCR kompleks ile en azından zaman olduğunu gösterir gibi görünmektedir, yerine mesafeden daha ligandların yoğunluğu, 12 yayma ve aktivasyon 10, 11 için tanımlama parametresidir 13. Çevre SLB etkileri bu gözlem ve ne kadar, mobil ve sabit parçalar birlikte çalışan mobil ligantın dahil edilmesi, kısmen kendi kendini monte SLB bağlanmış kümeler 24 kullanılarak ele bir olası soru olup olmadığı. Mobil ve immobilize ligandlara hücre yapışma / aktivasyon T hücreleri 7, 25 değil, aynı zamanda alışıldığı hücre dışı matris 26 bağlı hücreler için, sadece farklı olduğu gösterilmiştir burada başka bir ilgi çekici uygulama mekano-algılama kapsamında olacaktır.

Bu proteo-lipit desen iki temel avantaj gelişmiş optik mikroskopi ve kullanım ve-mesafe uygulamalar ile uyumlu hale getirir preparasyon kolaylığı ile substratların uyumluluğu bulunmaktadır. alüminyum birikimi ardından, tüm hazırlama adımları, standart ıslak laboratuar tezgahı üzerinde gerçekleştirilebilir. Gelecekte, bu öngörülen edilebilir alüminyum kaplamalı ve özel bir tesiste üretilen cam destekli boncuk maskeler aktarılır olarak kullanım için biyoloji laboratuvarlarında depolanır ve gerektiğinde. Bu bakış açısıyla, bu yüzeyler kontrollü nano desenli proteo-lipit membranlar ile hücrelerin etkileşimini incelemek için tercih ettiği bir platforma olma potansiyeline sahip olduğuna inanıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz hücresel uygulamalar hakkında verimli tartışmalar devam için Laurent Limozin Pierre Dillard ve Astrid Wahl teşekkür ederim. Ayrıca SEM gözlemleri ile yaptığı yardım için PLANETE temiz oda tesisinden Frederic Bedu teşekkür ederim. Bu çalışma kısmen hibe sayılı 307.104 FP / 2007-2013 / ERC yoluyla Avrupa Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslips Assistent, Karl Hecht KG 
Observation chamber Home made
Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) Hella Analytics 9-307-011-4-507
Ultra-sonicator ThermoFisher
Desiccator Labbox
Crystallizer  Shott
Neutravidine Thermo Fischer Scientifique 84607
PBS  Sigma-aldrich P3813
Water MQ  ELGA, Veolia France
Silica beads Corpuscular Inc 147114-10
APTES Sigma-aldrich A3648
BSA-Biotin Sigma-aldrich A8549
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C
Dansyl-PE Avanti Polar Lipids 810330C
Chloroform Sigma-aldrich 650471
Gastight syringe  Dominique Dustcher , France 74453
Film balance NIMA Medium
Microscope Zeiss, Germany TIRF-III system
Aluminium Target  Kurt J. Lesker Compagny, USA
Radio Frequency Magnetron sputtering Système  modified SMC 600 tool by ALCATEL , France

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).
  2. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
  3. Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
  4. Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
  6. Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
  7. Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
  8. Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
  9. Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
  10. Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
  11. Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
  12. Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
  13. Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
  14. Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
  15. Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
  16. Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
  17. Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
  18. Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
  19. Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
  20. Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
  21. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  22. Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
  23. Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
  24. Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
  25. Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398 (2012).
  26. Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).

Tags

Bioengineering Sayı 122 Protein nano noktalar nanobiopatterning nano kümeleri lipidler desteklenen iki tabakalı nanobiofunctionalization hücre yapışması
Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benard, E., Pi, F., Ozerov, I.,More

Benard, E., Pi, F., Ozerov, I., Charrier, A., Sengupta, K. Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer. J. Vis. Exp. (122), e55060, doi:10.3791/55060 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter