Summary
Målet med denne undersøgelse var at formulere teknologier, der muliggør vellykket gen transduktion i primære natural killer (NK) celler. Dextran-medieret lentiviral transduktion af menneskelige eller musen primære NK celler resultater i højere gen expression effektivitet. Denne metode af genet transduktion vil langt forbedre NK celler genetisk manipulation.
Abstract
Den effektive transduktion af specifikke gener i natural killer (NK) celler har været en stor udfordring. Vellykket transductions er afgørende for definitionen af gen interesse for udvikling, differentiering og funktion af NK celler. De seneste fremskridt i forbindelse med kimære antigen receptorer (biler) i cancer immunterapi fremhæve behovet for en effektiv metode til at levere udefrakommende gener til effektor lymfocytter. Effektiviteten af lentiviral-medieret gen transductions til primære menneskelige eller mus NK celler forbliver betydeligt lav, hvilket er en stor begrænsende faktor. De seneste fremskridt ved hjælp af kationiske polymerer, såsom polybrene, vise en forbedret gen transduktion effektivitet i T-celler. Disse produkter blev dog ikke bedre transduktion effektivitetsgevinster af NK celler. Dette arbejde viser, at dextran, en forgrenet glucan polysaccharid, væsentligt forbedrer transduktion effektivitet af menneskelige og musen primære NK celler. Denne meget reproducerbare transduktion metode giver en kompetente værktøj for transducing menneskelige primære NK celler, som kan langt bedre klinisk gen sikkerhedsudvidede programmer og dermed NK cellebaserede cancer immunterapi.
Introduction
Natural killer (NK) celler er den største lymfatisk befolkning af medfødte immunsystem1. NK-celler fungerer som first-line forsvarere af vært immunrespons mod tumorer og infektioner2,3,4. NK-celler også spille en central rolle i udviklingen af tolerance gennem udskillelsen af potente cytokiner og kemokiner5. På grund af deres potent evne til at målrette og fjerne tumorceller, er flere kliniske forsøg gennemføres for at vurdere donor-stammer menneskelige NK celler som en adoptive immunterapi for kræft6,7. I modsætning til T-celler endnu NK-celler udviklingsmæssige biologi ikke være godt karakteriseret8. Dette manglende kendskab er delvist på grund af manglende effektive teknikker, der levere gener af interesse til musen eller menneskelige primære NK celler. Af disse grunde, er de fleste NK-celle undersøgelser blevet gennemført i cellelinjer og ikke i primærelementer. Behovet for en pålidelig og effektiv protokol til transduce primære NK celler med gener af interesse er derfor afgørende.
Det overordnede mål med denne undersøgelse var at formulere en konsekvent og pålidelig metode som primære menneskelige eller murine NK celler kunne være transduced med lenti- eller retrovira.
Tidligere undersøgelser, som har forsøgt at løse dette problem er blevet udført, i vid udstrækning benytter den forbigående omdannelse af primære NK celler. Dette omfatter plasmid Transfektion9,10, Epstein - Barr Virus (EBV) / retroviral hybrid vektor11, vaccinia vektorer12,13, og Ad5/F35 kimære adenoviral vektorer14. Trods den beskedne effektivitet af disse teknikker gør transduktion forbigående karakter dem uegnet til den langsigtede udnyttelse af genetisk modificeret NK celler. Nogle nylige undersøgelser har brugt retroviral vektorer til transduce NK celler, der kræver flere cyklusser af infektion at opnå et acceptabelt niveau af gen expression11,15. I modsætning til retroviral vektorer, kan lentiviral vektorer bruge vært-celle nukleare import maskiner til translocate viral pre integration komplekset ind i kernen. Dette er en stor begrænsende faktor i replikering af virus i ikke-dividere celler, som omfatter primær NK celler.
Interaktioner mellem forskellige celle-overflade receptorer og viruspartikler tillade viral udbredelse ind i cellen. De første sammenstød mellem de virale kuvert proteiner og deres beslægtet vært receptorer kunne være begrænset på grund af de potentielle negative afgifter mellem disse to. Rationalet bag mange transduktion teknikker er, at tilsætning af kationiske polymerer, såsom polybrene (Pb), protamine-sulfat (PS) eller dextran, kan give en positiv ladning på celle-overflade receptorer og dermed øge bindingen af virale kuvert proteiner. Dette vil øge fusion effektivitet og udbredelsen af de virale partikler af celler16. Selv om det er blevet rapporteret, at Pb eller PS kan forbedre genoverførsel i T celler17, har deres program ikke nogen effekt i transduktion effektiviteten af primære NK celler. Desuden en komparativ analyse mellem disse reagenser ved hjælp af primære NK celler ikke er blevet udført. I denne undersøgelse, blev transduktion effektiviteten af de tre kationiske polymerer sammenlignet. Resultaterne viser, at blandt disse tre kationiske polymerer, kun dextran betydeligt forbedrer effektiv viral signaltransduktion i både mus og menneskelige primære NK celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr protokoller fulgte den humane og etiske behandling af dyr og blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) inden for biomedicinsk forskning Center (BRC) af den Medical College of Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI. Brug af humant perifert blod mononukleære celler (PBMC) blev godkendt af institutionelle Review Board (IRB) af blod Research Institute of Wisconsin blod-Center, Milwaukee, WI.
1. mus, cellelinjer og vektorer
- Hente C57BL/6 mus fra kommercielle leverandører. Opretholde mus kolonier i patogenfrie betingelser og bruge kvindelige og mandlige mus i alderen mellem 6 og 12 uger. Opnå de identificerede menneskelige PBMC fra IRB-godkendte kilder.
- Bedøver dyr med en blanding af 20-30% v/v isofluran i propylenglycol (1, 2-propandiol, USP klasse) til bedøver musene. Anvende vet salve på øjnene at forhindre tørhed, mens mus er under anæstesi.
- For at aflive dyrene, udføre cervikal dislokation efter induktion af anæstesi.
- Begrænse mus af fast greb i bunden af hale med den ene hånd. Placer en robust stick-type pen eller tommel og første finger på anden side mod bagsiden af halsen, i bunden af kraniet.
- For at producere dislokation, skubbe den hånd fastholdende hovedet af dyret frem og skubbe mens du trækker bagud med den hånd, der holder halen base. Verificere effektiviteten af dislokation af fornemmelse for en adskillelse af cervikal væv.
- Holde dyrene i kammeret/bur i mindst 5 min. og fjerne dem kun, når luftvejene aktivitet er fraværende, eller når der er mangel på en påviselig puls.
- Opnå K562 og YAC-1 celler fra kommercielle leverandører og vedligeholde dem i RPMI1640 medium som indeholder 10% varme-inaktiverede FBS. Teste disse cellelinjer jævnligt for at udelukke muligheden for mycoplasma kontaminering.
2. forberedelse og titrering af lentiviral vektorer
- Kultur 5 × 106 293T celler natten over i en T75 cm2 kolbe indeholdende en løsning af 20 mL af RPMI1640 medium med 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 1 mM natrium pyruvat, 5% af 7,5% natriumbikarbonat løsning og 0,001% Β-mercaptoethanol. Kolben anbringes i et 37 ° C inkubator infunderes med 5,2% CO2.
- Høste de 293T celler ved hjælp af trypsin (0.025%)/EDTA (1 mM) i fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Der tilsættes 5 mL Trypsin/EDTA i PBS og inkuberes kolberne i 10 min i et 37 ° C en inkubator til at tillade detachement af 293T celler fra T75 cm2 kolber.
- Indsamle de fritliggende celler og vaske dem to gange i PBS til at fjerne ethvert spor af trypsin og EDTA. Tælle celler med en hemocytometer og justere celle nummer til en million celler pr. mL.
- Transfect 293T celler18 med 3,95 µg for psPAX2, 1.32 µg for pMD2G og 5.26 µg for pLEP-normal god landbrugspraksis-Puro (genereres internt på BRI ved kloning EF1alpha promoter fra pWPI i stedet for en CMV promotor i pLenti CMV-normal god landbrugspraksis-Puro)19.
- Forberede 1 mL af 150 mM NaCl plus 63 µL af 0,6 mg/mL polyethylenimine (PEI; 25.000 kD, lineære). Bland godt og derefter tilføje plasmider og bland. Inkuber i 20 min. ved stuetemperatur og derefter føje den til cellerne.
- 16 h efter Transfektion, Erstat Transfektion medium med friske medium plus 4,5 mM natrium butyrat. Høste supernatanten indeholdende virus 48 h efter Transfektion og koncentrat af overnight centrifugering ved 5.000 × g. Se tabellen materialer.
- Bestemme de virale titers ved hjælp af 293T celler ved at udføre serielle fortyndinger og analysen af flow flowcytometri 72 h efter transduktion20. Bruge udtryk for grøn fluorescerende proteiner (NGL) som en foranstaltning til at kvantificere de virale titers.
3. oprensning og udvidelse af murine primære NK celler
- Rense murine primære NK celler21. Kort pass encellede milt suspensioner gennem nylon uld kolonner til nedbryder de vedhængende populationer bestående af B-celler og makrofager.
- Kultur ikke-tilhænger populationer elueres fra kolonnen nylon uld, der indeholder murine NK celler med 1.000 U/mL interleukin (IL) -2 i RPMI1640 medium med 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 1 mM natrium pyruvat, 5% af 7,5% natriumbikarbonat løsning, og 0,001% β-mercaptoethanol (RPMI1640 komplet medium).
- Ændre medium fra kolberne på dag 4 af denne kultur at fjerne ikke-tilhænger T og NKT celler; celler, der fortsat er overholdt til kolberne er i vid udstrækning NK celler. Der tilsættes 20 mL frisk RPMI1640 komplet medium og 1.000 U/mL IL-2 at genopbygge kolberne.
- Tjekke renheden af murine NK cellekulturer på dag 7 ved flowcytometri med NK celle-specifikke markører20 ved hjælp af præparater med mere end 95% af CD3-NK1.1+ befolkning.
4. oprensning og udvidelse af menneskelige primære NK celler
- Isolere PBMC ved tæthed farveforløb fra raske menneskers frivillige buffy frakker. Kort, omhyggeligt lag 35 mL af halv-fortyndet (med HBSS) celler over 15 mL i tæthed farveforløb i en 50 mL kanoniske tube. Der centrifugeres ved 400 × g i 30 min. ved 20 ° C i en swingende spand rotor uden bremse.
- Bruge den kommercielle antistof-baserede negative valg kits til at rense menneskers primære NK celler efter producentens protokol.
- Efter isolering, bestemme renheden af NK celler præparater ved immunfluorescens analyser. Pletten NK celle præparater med 2 µg/mL anti-CD3 og 2 µg/mL anti-CD56 antistoffer ved 4 ° C i 20 min. Skyl cellerne to gange med PBS NK cellepopulationer bestemmes af fraværet af CD3 og tilstedeværelsen af CD56 på cellens overflade.
- Inkuber celle præparater med antistoffer i 20 min. ved 4 ° C, vask med PBS og analysere i et flow Flowcytometret. Bruge NK celle præparater med mere end 85% renhed for gen transduktion undersøgelser,20.
5. transduktion af murine og menneskelige primære NK celler med lentivirus
- Suspendere mus eller menneskelige primære NK celler i en 24-godt plade på 0,5 × 105/mL medium i overværelse af normal god landbrugspraksis lentivirus supernatanten på 5, 10 og 20 mangfoldighed af infektion (MOI) og Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL) eller dextran (8 µg/mL).
- Der centrifugeres plader på 1.000 × g i 60 min.
- Uden dekantering supernatanten, kultur celler natten (16-18 h) i et 37 ° C inkubator infunderes med 5,2% CO2.
- Skylles med 10 mL PBS og resuspend i 2 mL af komplet RPMI1640 næringssubstratet i overværelse af IL-2 (300 U/mL).
- Test menneskelige og musen primære NK celle-medieret cytotoksicitet mod K562 og YAC-1, henholdsvis ved at udføre 51chrom (Cr)-release assays på varieret effektor-til-målet-celle nøgletal22.
- Kort, give en million target celler 50 µCi radiolabeled natrium chromat 51Cr. I løbet af 4-h inkubation tid, de optagelse 51Cr i cellulære proteiner. For enden af inkubation vaske cellerne for at fjerne alle personlige etiket.
- Beregne specifikke tumor celle lysering af mængden af absolutte, spontane og eksperimenterende frigivelse af 51Cr fra target-cellerne.
Bemærk: Beregning af procentdelen af specifikke lysis fra pentaplicate eksperimenter blev udført ved hjælp af følgende ligning: % specifikke lysis = ((51Cr: forsøgsudsætningen - 51Cr gennemsnitlige spontan udledning) / (51Cr mener, maksimal release - 51Cr: spontan udledning)) х 100, hvor "51Cr gennemsnitlige spontan release" 51Cr frigivet fra target-cellerne i mangel af NK celler og "51Cr betyder maksimal release" er 51Cr udgivet fra target-cellerne ved lysering af 2 N saltsyre (HCl).
- Høste de transduced NK celler på dag 7 ved forsigtigt at trykke kolberne.
- Aktivere de høstede celler med titreret koncentrationer af plade-bundet anti-NKG2D (A10) mAb ved belægning 96-brønd, højt protein-absorberende polystyren plader med 2,5 µg/mL koncentrationer af anti-NKG2D mAb natten over.
- Vask hver godt med 100 µL af PBS tre gange før tilsætning af primære NK celler.
- Indsamle kultur analysere ved hjælp af en multi-kanal pipette mellem 16 og 18 h efter aktivisering hen til kvantificere cytokiner såsom IFN-γ. Generere standard kurver ved hjælp af af rekombinante cytokiner forsynet med enzymmaerket assay (ELISA) kits.
- Teste NK cellernes levedygtighed ved hjælp af annexin-V/7-amino-actinomycin D (7-AAD) farvning23 og bestemme procentdelen af nekrotiske celler blandt de transformerede NK celler ved hjælp af en flow Flowcytometret.
- For at udføre denne analyse, høst murine og menneskelige NK celler fire dage efter transduktion, vaskes to gange med 10 mL koldt PBS på 500 × g i 5 min, og inkuberes med en Annexin V (PE) / 7-ald kit.
- Bruge passende flow flowcytometri software til at analysere dataene. Vælg live-celle population og analysere udtryk for normal god landbrugspraksis (FITC kanal) som en foranstaltning af viral transduktion24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dextran inducerer den effektive genoverførsel af lentiviral vektor i primære menneskelige og murine NK celler
NK celler blev isoleret og renset fra PBMC (med en renhed på mere end 85%) og inkuberes natten over med rIL-2 300 U/mL. Disse primære NK celler blev derefter transduced med normal god landbrugspraksis lentivirus på varieret multiplicities af infektion (MOI; 3, 10 og 20 IU pr. celle) i 24-godt plader 8 µg/mL Pb, PS eller dextran. Celler var centrifugeres ved 1.000 × g i 60 min og kulturperler (tilstedeværelse af virus) natten over ved 37 ° C i en CO2 inkubator. Celler blev vasket og genopslemmes i friske RPMI1640 komplet medium med rIL-2 300 U/mL for syv dage. Transduktion effektivitet blev evalueret ved flowcytometri for normal god landbrugspraksis udtryk syv dage efter transduktion. Resultaterne viser at dextran effektiviserer lentiviral transduktion i menneskelige NK celler og øger den virale titer, hvilket kan også forbedre procentdelen af transduced NK celler (figur 1).
Murine NK celler blev isoleret og kulturperler som beskrevet i tidligere afsnit. Den ovennævnte protokol blev brugt til at analysere og sammenligne transduktion effektiviteten af Pb, Ps og dextran. Resultaterne i figur 2 viser, at dextran kan forøge effektiviteten af lentiviral vektorer i forhold til Pb eller PS.
Transduktion af NK celler med dextran påvirker ikke deres evne til at mægle effektor funktion
Transduced menneskelige og murine NK celler cytotoksiske kapacitet blev undersøgt af 51Cr-release assays mod K562 og YAC-1 som target-cellerne. Resultaterne præsenteres i fig. 3a og b afsløre at transduktion af NK celler af dextran ikke ændrer negativt ved drab potentiale af transformerede NK celler i forhold til ikke-transduced NK celler. Derudover blev cytokin produktion fra transduced primære NK celler analyseret. IFN-γ generation blev målt ved hjælp af en ELISA. Transduced menneskelige primære NK celler var Co kulturperler med K562 i 24 timer, og supernatanter blev indsamlet til foranstaltning IFN-γ. Resultaterne præsenteres i figur 4a afsløre at dextran har ingen indvirkning på transduced NK celler evne til at producere cytokiner. Som en uafhængig validering, blev transduced NK celler aktiveret med titreret koncentrationer af plade-bundet anti-NKG2D (A10) mAb 18 h. kultur analysere blev indsamlet, og IFN-γ generation blev målt ved ELISA. Resultaterne vist i figur 4b afslører, at transduktion af murine NK celler med dextran har ingen indflydelse på deres evne til at producere cytokiner.
Transduktion af NK celler med dextran påvirker ikke deres cellers levedygtighed
Pb, PS eller dextran indflydelse på levedygtigheden af transduced NK celler blev evalueret ved hjælp af en propidium Iodid (PI) analyse og efterfølgende flow analyser. Resultaterne i figur 5a og b viser, at selv om transducing primære menneskelige og mus NK celler med vira kan fremkalde nekrose i omkring 20% af NK celler, tilsætning af dextran ikke forstærke denne nekrose i forhold til Pb eller PS.
Statistiske analyser blev udført med en to-sidede uparret t-test. P -værdier ≤ 0,05 ansås for betydelig.
Figur 1: Dextran har en højere effektivitet på transduktion af menneskelige primære NK celler.
Primære menneskelige NK celler blev omdannet med MOI af 3, 10 eller 20 IU/celle og var kulturperler i syv dage i nærværelse af Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL), eller dextran (8 µg/mL). Procenter af normal god landbrugspraksis-positive NK-celler blev bestemt ved flowcytometri på dag syv efter transduktion. En af tre uafhængige forsøg er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Dextran har en højere effektivitet på transduktion i murine NK celler.
Primære murine NK celler blev omdannet med et MOI af 30 IU/celle og var kulturperler i syv dage i nærværelse af Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL), eller dextran (8 µg/mL). Procenter af normal god landbrugspraksis-udtrykker celler blev bestemt ved flowcytometri på syv dage efter transduktion. En af tre uafhængige forsøg er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Dextran ændrer ikke NK celle-mægle cytotoksisk aktivitet af transformerede celler.
Primære NK celler blev omdannet med et MOI af 10 IU/celle og var kulturperler i syv dage. YAC-1 og K562 blev brugt som target-cellerne til at finde ud af murine (a) og menneskelige b NK celler, cytotoksiske potentialer, henholdsvis. De viste data er repræsentanter for to uafhængige forsøg. De viste data er gennemsnit med SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Dextran ændrer ikke IFN-γ produktion af primære NK celler.
a) murine NK celler var transduced med en MOI af 30 IE/celle og kulturperler i syv dage. NK-celler blev stimuleret med 2,5 µg/mL af plade-bundet anti-NKG2D antistof til 18 h, og IFN-γ var kvantificeres i kultur analysere ved hjælp af en ELISA. b) transduced menneskelige NK celler blev kulturperler med K562 celler i 24 timer, og IFN-γ produktion blev målt i kultur analysere. De fremlagte data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. De viste data er gennemsnit med SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Transduktion af NK celler med dextran ændrer ikke deres cellernes levedygtighed.
Levedygtighed transformeret menneskelige (a) og mus (b) NK celler var kvantificeret efter farvning for Annexin V (PE) / 7-ald positive celler. De viste data er gennemsnit med SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse viser at brugen af dextran som en kationiske polymer agent effektiviserer lentiviral transduktion af både murine og menneskelige primære NK celler. Derudover har andre kationiske stoffer, såsom Pb eller PS, nogen mærkbar virkning på levering af virale vektorer i menneskelige primære NK celler. Det er tidligere påvist, at Pb kan forøge gen transduktion i human T celler17. Disse resultater tyder imidlertid på at hverken Pb eller PS har en lignende effektivitet på menneskers primære NK celler. I denne undersøgelse, Pb forbedret transduktion effekten kun beskedent i murine NK celler. Det har været vist, at hæmning af intracellulære antiviral forsvarsmekanismer ved hjælp af BX795, en hæmmer af TBK1/IKKɛ og PS som en forstærker kan øge lentiviral transduktion effektivitet25. Ikke desto mindre, resultaterne viste, at dette hæmmer har ingen effekt på transduktion effekten i murine eller menneskelige primære NK celler (data ikke vist).
Resultaterne viser, at dextran kan fremkalde den effektive transduktion af primære menneskelige og mus NK celler, mens PS og Pb har ingen effekt. Resultaterne viser også, at dextran ikke ændrer effektor funktion af NK celler, såsom anti-tumor cytotoksicitet og produktion af pro-inflammatoriske cytokiner. Således, disse resultater viser sig, at levedygtigheden af disse primære NK celler ikke blev ændret ved brug af dextran.
Flere undersøgelser analyseret og sammenlignet transduktion effektiviteten af retroviral vektorer ved hjælp af forskellige kationiske polymerer, med varieret resultater26,27,28. En tidligere undersøgelse sammenlignede transduktion effekten af disse polymerer, ved hjælp af lentiviral vektorer; men dette blev testet i CD4+ T celler16. I en af disse undersøgelser, har det vist sig at Pb har en bedre kapacitet på transduktion på transformeret B-celler og dendritiske celler i forhold til dextran26. I en anden undersøgelse, har det været vist at dextran letter en højere transduktion effektivitet end andre smagsforstærkere i menneskelige B-celler og T celler16. Den aktuelle undersøgelse er først af sin slags, at vores viden, der analyserede og sammenlignede transduktion kapacitet af forskellige polymerer i både menneskelige og murine primære NK celler.
Dextran-baserede gen transductions kan kræve et minimum af to runder af transductions. Disse resultater viser at en runde af transduktion er nok til at nå op til 40% af positivt transduced celler, som er steget op til 100% følgende to runder af transduktion (data ikke vist). En af de største udfordringer i transducing NK-celler er cellernes evne til at bevare udtryk af transduced-genet. De aktuelle resultater vise, transduktion af primære NK celler med dextran er stabil og at NK-celler, der er kulturperler i overværelse af IL-2 kan beholde vektoren og vedligeholde transgen udtryk for fire uger (data ikke vist). Yderligere eksperimenter er forpligtet til at analysere transduktion effektivitet og til at undersøge den samtidige udtryk for flere transgener.
Den kliniske effekt af immun celle-baserede kræftbehandling er at blive valideret af flere institutioner. BIL-transduced T-celler giver fornyet løfte ved sygdom og tilbagefald gratis inddrivelse af kræftpatienter sammenlignet med konventionelle behandlingsformer. Som en del af medfødte immunrespons kræver NK-celler ikke forudgående sensibilisering at mægle deres effektor funktion, herunder anti-tumor cytotoksicitet. På grund af deres hurtige svar er NK-celler en ideel effektor lymfocyt undersæt at mægle en effektiv cellebaserede cancer immunterapi. Trods deres positive egenskaber i tumor anerkendelse og eliminering begrænse de tekniske forhindringer vedrørende genmanipulation at levere transgener den størst klinisk udnyttelse af NK celler.
Elektroporation af mRNA for eksogene genekspression er yderst effektiv og har bedre resultater. MRNA nytte er dog begrænset, da de tillader kun forbigående udtrykket af gener af interesse og dermed er ikke egnet til kliniske applikationer. Den retroviral transduktion af NK-celler er mindre effektive, da det kræver flere runder af transduktion; Derudover kan ikke retroviral vektorer transduce til ikke-dividere celler. Den eneste lovende tilgang til stabil transgen levering er brugen af lentiviral vektorer.
Helt, denne undersøgelse giver en effektiv metode til at levere transgener i primære NK celler, uden at forringe deres effektor funktion. Denne protokol gør NK cellebaserede cancer immunterapi højeffektive og gælder for nye kliniske forsøg. Fremtidige eksperimenter er nødvendige for at bekræfte effektiviteten af denne metode i NK cellebaserede kræft immunoterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hævder nogen finansielle interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Lucia Sammarco og hendes Lulu limonade stå for inspiration, motivation og støtte. Dette arbejde blev støttet i en del af NIH R01 AI102893 og NCI R01 CA179363 (S.M.); NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); Alex Lemonade Stand Foundation (S.M.); Programmet HRHM MACC fondens (S.M.; S.R.; M.S.T); Nicholas Family Foundation (S.M.); Gardetto familie (S.M.); Hyundai lærde Program (M.S.T.); Hyundai håb på hjul (S.R.); MACC fond (M.S.T. og S.M.); children's Research Institute, MCW (S.R.); og Kathy Duffey Fogerty Award (M.J.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
| polybrene (Pb) | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| protamine sulfate (PS) | Sigma-Aldrich | p3369 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATALANTA | S11150 | |
| Penicillin | Corning | 30-001-CI | |
| B-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | |
| sodium pyruvate | Corning | MT25000CI | |
| Interferon gamma (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
| Propidium lodding staining solution | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| Isoflurane | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| NK cell negative selection kit | Stem Cell | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| Mice | Jakson | 664 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| T75 flasks | Cornnig | 430641U | |
| antibody-based negative selection kits | Stem Cell | 19055 | |
| 51Chromium (Cr)-release assays | perkin elmer's | NEZ030 | |
| ELISA kits | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| Sodium Butyrate | Sigma | 5887-5G | |
| Linear polyethylenimine | polysciences | 23966-2 | |
| Ficoll | GE Life Science | 17-1440-03 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV |
References
- Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
- Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
- Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
- Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
- Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95 (2014).
- Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94 (2016).
- Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
- Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
- Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
- Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
- Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
- Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
- Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
- Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
- Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
- Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529 (2009).
- Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
- Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
- Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
- Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
- Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
- Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
- Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
- Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
- Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).
