Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır

Published: January 15, 2018 doi: 10.3791/55063

Summary

Bu çalışmanın amacı hücrelerdeki birincil doğal öldürücü (NK) başarılı gen iletim için izin teknolojileri formüle etmek oldu. İnsan lentiviral iletim dextran aracılı veya fare birincil NK hücreleri sonuçlarında yüksek gen ifade verimliliği. Bu yöntemi, gen iletim NK hücre genetik manipülasyon büyük ölçüde artıracaktır.

Abstract

Doğal öldürücü (NK) hücreye belirli genlerin iletim verimli büyük bir mücadele vardı. Başarılı transductions geliştirme, farklılaşma ve NK hücreleri fonksiyon ilgi gen rolü tanımlamak için kritik öneme sahiptir. Kanserli hastalarda chimeric antijen reseptör (CARs) ile ilgili son gelişmeler eksojen genler efektör lenfositler için teslim etmek etkili bir yöntem ihtiyacını vurgular. Lentiviral-aracılı gen transductions birincil insan veya fare NK hücreleri içine verimliliği önemli kısıtlayıcı bir faktör olduğu önemli ölçüde düşük kalır. Son gelişmeler polybrene gibi Katyonik polimerler kullanılarak geliştirilmiş gen iletim verimliliği T hücreleri gösterir. Ancak, bu ürünlerin NK hücreleri iletim verimliliği artırmak başarısız oldu. Bu iş o dextran dallı glukan polisakkarit gösterir önemli ölçüde iletim insan ve fare birincil NK hücreleri artırır. Bu son derece tekrarlanabilir iletim yöntemi klinik gen teslim uygulamalar ve böylece NK hücre tabanlı kanserli hastalarda. büyük ölçüde artırabilirsiniz insan birincil NK hücreleri transducing için yetkili bir araç sağlar

Introduction

Doğal öldürücü (NK) doğuştan gelen bağışıklık sistemi1büyük lenfositik nüfusu hücrelerdir. NK hücreleri karşı tümörler ve enfeksiyonlar2,3,4ana bilgisayar bağışıklık yanıtının ilk satır savunucuları olarak işlev. NK hücreleri de güçlü sitokinler ve kemokinler5salgılanmasını aracılığıyla tolerans gelişimi merkezi bir rol oynamaktadır. Hedef ve tümör hücreleri ortadan kaldırmak için güçlü yeteneklerini nedeniyle, donör elde edilen insan NK hücreleri kanser6,7için bir adoptive immünoterapi olarak değerlendirmek için birden fazla klinik çalışmalar yürütülmektedir. Aksine T hücreler, NK hücreleri gelişim biyolojisi henüz iyi karakterize8olmak zorundadır. Bu bilgi kısmen genler ilgi fare veya insan birincil NK hücreleri göndermek verimli teknikleri yokluğu nedeniyle eksikliğidir. Bu nedenlerden dolayı hücre hatları yerine Primer hücre en NK hücre çalışmaları yapılmıştır. Bu nedenle, birincil NK hücreleri genler ilgi ile transduce güvenilir ve etkin bir iletişim kuralı için ihtiyaç çok önemlidir.

Bu çalışmada genel amacı lenti - veya Retrovirüsler birincil insan veya fare NK hücreleri transduced tutarlı ve güvenilir bir yöntem formüle etmek oldu.

Büyük ölçüde birincil NK hücreleri geçici dönüşümü kullanarak bu sorunu çözmeye çalıştığınız önceki çalışmalar yapılmıştır. Bu plazmid transfection9,10, Epstein - Barr virüsü (EBV) içerir / retroviral hibrid vektör11, vaksinia vektörler12,13ve14Ad5/F35 chimeric adenoviral vektörel çizimler. Bu teknikler mütevazı verimliliğini rağmen iletim geçici doğasını onlara genetiği değiştirilmiş NK hücreleri uzun süreli kullanımı için uygun olmayan hale getirir. Bir kaç son yıllarda yapılan çalışmalarda retroviral vektörler NK hücreleri, enfeksiyon gen ifade11,15kabul edilebilir bir düzeyde sağlamak için birden fazla döngüleri gerektiren transduce için kullandık. Retroviral vektörler aksine, lentiviral vektörler konak hücre nükleer alma makine viral öncesi entegrasyonu karmaşık çekirdek translocate için kullanabilirsiniz. Bu virüs birincil NK hücreleri dahil olmayan bölme hücrelerdeki çoğaltma büyük bir sınırlayıcı faktördür.

Farklı hücre yüzey reseptörleri ve viral parçacıkların arasındaki etkileşimler viral alımını hücre içine izin verir. Viral zarf proteinleri ve onların soydaş ana bilgisayar reseptörleri arasındaki ilk nişan bu iki arasında mevcut potansiyel negatif ücretleri nedeniyle sınırlı olabilir. Polybrene (Pb), protamine sülfat (PS) veya dextran, gibi Katyonik polimerler ek hücre yüzey reseptörleri için olumlu bir ücret vermek ve böylece viral zarf bağlama çoğaltmak birçok iletim teknikleri arkasındaki mantığı olduğunu proteinler. Bu hücreler16tarafından füzyon verimlilik ve viral parçacıkların alımını artırır. Her ne kadar Türkçe veya PS gen transferi T hücreleri17artırabilir rapor edildi, bunların uygulama birincil NK hücreleri iletim verimliliği herhangi bir etkisi yoktu. Ayrıca, birincil NK hücreleri kullanarak bu Ayıraçlar arasında karşılaştırmalı bir analiz gerçekleştirilmedi. Bu çalışmada, üç Katyonik polimerler iletim verimliliği karşılaştırıldı. Bu üç Katyonik polimerler arasında sadece dextran önemli fare ve insan birincil NK hücreleri içine etkili viral iletim artırır, sonuçlar gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan iletişim kuralları insani ve ahlaki muamele-in hayvan takip ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tıbbi College of Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI Biyomedikal Araştırma Merkezi (BRC) içinde tarafından kabul edildi. İnsan periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) kullanımı kurumsal inceleme Kurulu (IRB) kan Merkezi Wisconsin, Milwaukee, WI kan Araştırma Enstitüsü tarafından kabul edildi.

1. fare, hücre satırları ve vektörel çizimler

  1. C57BL/6 fareler ticari satıcıları tarafından elde etmek. Patojen-Alerjik koşulları fare kolonilerde korumak ve 6 ve 12 hafta yaş arası kadın ve erkek fare kullanın. De-tanımlanan insan PBMCs IRB tarafından onaylanan kaynaklardan elde edilir.
  2. % 20-30 v/v isoflurane propilen glikol fareler anestezi için (1, 2-propanediol, USP sınıf) karışımı hayvanlarla anestezi. Fareler anestezi altında iken kuruluğu önlemek için gözlerinin veteriner merhem uygulamak.
  3. Hayvanlara ötenazi için anestezi indüksiyon sonra servikal çıkığı gerçekleştirin.
    1. Fareler Bankası kuyruk tek elle sıkıca kavra tarafından dizginlemek. Sağlam sopa-tipi kalem veya başparmak ve ilk parmak boyunda, arkası karşı diğer el kafatası tabanında yer.
    2. Çıkık üretmek için el baş hayvan iletmek ve kuyruk temel tutan el ile geriye dönük kablolarıylaberaber bastır frenleyici itin. Servikal doku ayrılması için duygu tarafından çıkığı etkinliğini doğrulamak.
  4. Odası/kafes en az 5 min için hayvanları koruyup onları sadece solunum aktivite yoktur veya algılanabilir bir kalp atışı eksikliği olduğunda kaldırmak.
  5. K562 ve yas-1 hücreleri ticari satıcıları tarafından elde etmek ve RPMI1640 içinde proje % 10 içeren orta ısı FBS inaktive. Düzenli olarak Mikoplazma bulaşma olasılığını dışlamak için bu hücre hatları test.

2. hazırlık ve titrasyon lentiviral vektörlerin

  1. Kültür 5 × 106 293T hücreleri bir çözüm olarak RPMI1640 orta %10 FBS, 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 1 mM sodyum pyruvate, ile 20 mL % %5 7.5 sodyum bikarbonat çözüm ve % 0.001 içeren bir T75 cm2 şişeye gecede Β-mercaptoethanol. %5.2 CO2ile infüzyon 37 ° C kuluçka şişeye koyun.
  2. Tripsin (0.025%)/EDTA (1 mM) fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS). kullanarak 293T hücre hasat Tripsin/EDTA 5 mL PBS içinde ekleyin ve Şişeler 10 dk 37 ° C'de T75 cm2 şişe 293T hücrelerden dekolmanı izin vermek için bir kuluçka için kuluçkaya.
    1. Müstakil hücreleri toplamak ve iki kez tripsin tüm izlerini kaldırmak için PBS ve EDTA içinde yıkayın. Bir hemasitometre içeren hücreleri saymak ve mL başına bir milyon hücre hücre sayıya ayarlayabilirsiniz.
  3. PsPAX2 3.95 µg, pMD2G 1.32 µg ve pLEP-GFP-Puro (in-house BRI oluşturulan EF1alpha organizatörü pWPI pLenti CMV-GFP-Puro bir CMV organizatörü yerine gelen klonlama tarafından) 5,26 µg 293T hücreleri18 transfect19.
    1. 1 mL 150 mm NaCl artı 0.6 mg/mL polyethylenimine 63 µL hazırlamak (PEI; 25.000 kD, doğrusal). İyice karıştırın ve sonra plazmid ekleyip karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya ve hücrelere ekleyin.
    2. 16 h sonrası transfection, eski yerine koymak ile taze orta transfection orta artı 4.5 mM sodyum bütrat. Virüs 48 saat sonrası transfection içeren süpernatant hasat ve 5000 × g de gecede Santrifüjü tarafından konsantre. Malzemeler tabloya bakın.
  4. Seri dilutions gerçekleştirerek 293T hücreleri kullanarak viral titreleri belirlemek ve Akış Sitometresi 72 h sonrası iletim20tarafından tahlil. Viral titreleri ölçmek için bir tedbir olarak yeşil flüoresan protein (GFP) deyimi kullanın.

3. arıtma ve fare birincil NK hücreleri genişlemesi

  1. Fare birincil NK hücreleri21arındırmak. Kısaca, tek hücreli dalak süspansiyonlar B hücreleri ve makrofajlar oluşan yapisan nüfus tüketmek için naylon yün sütunların üzerinden geçmek.
  2. 1000 U/mL İnterlökin (Il) RPMI1640 orta -2 ile %10 FBS, 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 1 mM sodyum pyruvate, % %5 7.5 sodyum bikarbonat ile fare NK hücreleri içeren naylon yün sütundan yapışık olmayan nüfus eluted kültür çözüm ve % 0.001 β-mercaptoethanol (RPMI1640 tam orta).
  3. Orta şişeler olmayan-yapışık T ve NKT hücreleri kaldırmak için bu kültür gün 4 değiştirin; Şişeler için yapıştırılan kalan büyük ölçüde NK hücreleri hücrelerdir. Taze RPMI1640 tam orta ve 1000 U/mL şişe doldurmak için IL-2 20 mL ekleyin.
  4. Hazırlıklar CD3 fazla % 95 ile kullanarak NK hücre özgü işaretleri20 günde 7 Akış Sitometresi tarafından fare NK hücre kültürleri saflığı kontrol-NK1.1+ nüfus.

4. arıtma ve insan birincil NK hücreleri genişlemesi

  1. PBMCs yoğunluk gradient sağlıklı insan gönüllü buffy kat üzerinden tarafından izole et. Kısaca, dikkatli bir şekilde yarı-(HBSS ile) seyreltilmiş hücre yoğunluğu geçişin bir 50 mL kurallı tüp üzerinde 15 mL 35 mL katman. Vasıl 400 × g için sallanan bir kova Open End fren olmadan 20 ° C'de 30 dk santrifüj kapasitesi.
  2. Antikor tabanlı ticari negatif seçim kitleri üreticinin protokolüne göre insan birincil NK hücreleri arındırmak için kullanın.
  3. Yalıtım, NK hücre hazırlıklar saflığı ayirt analizleri tarafından belirler. NK hücre hazırlıkları 20 dk. yıkama 2 µg/mL anti-CD3 ve 4 ° C'de 2 µg/mL anti-CD56 antikorlar ile hücreleri ile iki kez PBS NK hücre popülasyonlarının CD3 yokluğu ve CD56 varlığı hücre yüzeyinde tarafından belirlenen leke.
  4. 4 ° C'de 20 dk antikorlar ile hücre hazırlıkları kuluçkaya, PBS ile yıkayın ve bir Akış Sitometresi analiz. NK hücre hazırlıklar kullanmak ile % 85'den fazla gen iletim için saflık20deneyleri.

5. lentivirus ile fare ve insan birincil NK hücreleri iletim

  1. Fare veya insan birincil NK hücreleri bir 24-şey plaka 0,5 × 105/mL orta GFP lentivirus enfeksiyonu (MOI) 5, 10 ve 20 çokluğu süpernatant huzurunda ve Pb varlığında, askıya alma (8 µg/mL), PS (8 µg/mL) veya dextran (8 µg/mL).
  2. 60 dk 1000 × g de tabak santrifüj kapasitesi.
  3. Süpernatant decanting olmadan kültür hücreleri gecede (16-18 h) %5.2 ile infüzyon 37 ° C kuluçka CO2.
  4. Yıkama PBS ile 10 mL ve tam RPMI1640 kültür orta IL-2 huzurunda 2 ml resuspend (300 U/mL).
  5. İnsan test ve fare birincil NK Hücre-aracılı sitotoksisite karşı K562 ve yas-1, sırasıyla 51Krom (Cr) gerçekleştirerek-yayın deneyleri, çeşitli efektör için hedef hücre oranları22.
    1. Kısaca, bir milyon hedef hücreleri 50 µCi radiolabeled sodyum kromat 51Cr ver. 4-h kuluçka sırada, onlar alımı 51Cr hücresel proteinler içine. İnkübasyon sonunda herhangi bir unincorporated etiketi kaldırmak için hücreleri yıkayın.
    2. 51Cr mutlak, spontan ve deneysel sürümü hedef hücrelerden miktarına göre belirli tümör hücre lizis hesaplayın.
      Not: Pentaplicate deneyler üzerinden belirli lizis yüzdesi hesaplama yapıldı aşağıdaki denklemi kullanarak: % belirli lizis = ((51Cr ortalama deneysel açıklaması - 51Cr ortalama spontan yayın) / (Cr51demek maksimal açıklaması - 51Cr ortalama spontan yayın)) nerede "51Cr ortalama spontan yayın" 51yokluğunda NK hücreleri, hedef hücrelerden serbest Cr ve "51Cr ortalama maksimal yayın" 51Cr х 100, hedef hücre lizis üzerine 2 N hidroklorik asit (HCl) tarafından serbest.
  6. Transduced NK hücreleri gün 7 şişe hafifçe dokunarak hasat.
    1. Plaka bağlı anti-NKG2D (A10) mAb titre konsantrasyonları ile hasat hücreleri gecede anti-NKG2D mAb 2,5 µg/mL konsantrasyonları ile 96-de, yüksek oranda protein-emici polistren levha kaplama tarafından aktif hale getirin.
    2. Her yıkama PBS 100 µL üç kez önce birincil NK hücreleri ilavesi ile iyi.
  7. Sitokinler IFN γ gibi ölçmek için 16 ve 18 s etkinleştirme sonrası arasında bir çok kanallı pipet kullanarak kültür supernatants toplamak. Standart eğrileri enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) kitleri ile sağlanan rekombinant sitokinler kullanarak oluşturun.
  8. Annexin-V/7-amino-actinomycin D (7-AAD) Boyama23 kullanarak NK hücre canlılığı test ve Akış Sitometresi kullanarak dönüştürülmüş NK hücreleri arasında nekrotik hücre yüzde belirlemek.
    1. Bu tahlil gerçekleştirmek için fare ve insan NK hücreleri iletim sonra dört gün hasat iki kez 10 mL 500 × g 5 min için de soğuk PBS ile yıkayın ve bir Annexin-V (PE) kuluçkaya / 7-AAD kiti.
  9. Verileri çözümlemek için uygun Akış Sitometresi yazılımını kullanın. Canlı hücre nüfus seçin ve viral iletim24bir ölçüsü olarak GFP (FITC kanal) ifade analiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dextran birincil insan ve fare NK hücreleri lentiviral vektörü verimli gen transferi neden olmaktadır.

İnsan NK hücreleri izole ve PBMC (bir saflığı % 85'inden fazlası ile) saf ve gecede rIL-2 300 U/mL ile inkübe. Bu birincil NK hücreleri sonra çeşitli ilişkilendirmenin çeşitliliği enfeksiyon, GFP lentivirus ile transduced (MOI; 3, 10 ve 20 IU hücre başına) 8 µg/mL Türkçe, PS veya dextran huzurunda 24-şey tabak içinde. Hücreler için 60 dk 1000 × g, centrifuged ve (virüs huzurunda) gecede CO2 kuluçka 37 ° C'de kültürlü. Hücreleri yıkanmış ve taze RPMI1640 tam orta rIL-2 300 U/mL ile yedi gün boyunca resuspended. İletim verimliliği yedi gün sonra iletim Akış Sitometresi GFP ifade tarafından değerlendirilmiştir. Sonuçları göster: o dextran insan NK hücrelerindeki lentiviral iletim verimliliğini artırır ve ayrıca transduced NK hücreleri (şekil 1) yüzdesini artırabilirsiniz viral titresi artırır.

Fare NK hücreleri izole ve önceki bölümde anlatıldığı gibi kültürlü. Yukarıdaki Protokolü analiz ve Pb, Ps ve dextran iletim verimliliğini karşılaştırmak için kullanıldı. Şekil 2 sonuçlarında göster o dextran lentiviral vektörler Türkçe için karşılaştırıldığında verimliliğini artırmak veya PS

İletim dextran ile NK hücrelerin efektör fonksiyonları aracılık yeteneğini etkilemez.

Transduced insan ve fare NK hücre sitotoksik kapasitesi 51Cr-yayın deneyleri K562 ve yas-1 karşı tarafından hedef hücreler olarak incelenmiştir. Sonuçları şekil 3a ve b sunulan NK hücreleri dextran tarafından iletim olumsuz sigara transduced NK hücrelere kıyasla dönüştürülmüş NK hücreleri öldürme potansiyeli değiştirmez ortaya koyuyor. Ayrıca, transduced birincil NK hücreleri sitokin üretiminden analiz edildi. IFN γ üretimi bir ELISA kullanılarak ölçüldü. Transduced insan birincil NK hücreleri ile K562 24 saat co kültürlü ve supernatants ölçü IFN-γ. toplanmıştır Sonuçları şekil 4a sunulan bu dextran sitokinler üretmek için transduced NK hücreleri yeteneği üzerinde etkisi ortaya koyuyor. Bağımsız bir doğrulama transduced NK hücreleri için 18 h. Kültür supernatants toplanan ve IFN γ üretimi ELISA tarafından ölçüldü plaka bağlı anti-NKG2D (A10) mAb titre konsantrasyonları ile etkinleştirildi. Sonuçlar şekil 4b ' açığa vurmak dextran ile fare NK hücreleri iletim yeteneklerini sitokinler üretmek için üzerinde bir etkisi yoktur.

İletim dextran ile NK hücrelerin hücre canlılığı etkilemez

Türkçe, PS veya dextran etkisi transduced NK hücreleri canlılığı üzerinde bir propidium iyodür (PI) tahlil ve sonraki akış analizleri kullanarak değerlendirilmiştir. Sonuçlar şekil 5a ve b göstermek her ne kadar birincil insan ve fare NK hücreleri virüs ile transducing yaklaşık %20 NK hücre nekroz tetikleyebilir, dextran eklenmesi için Pb karşılaştırıldığında bu nekroz çoğaltmak değil, veya PS

Bir iki uçlu unpaired bir öğrenci t-testi ile istatistiksel analizleri yapıldı. P -değerleri ≤ 0,05 önemli kabul.

Figure 1
Resim 1: İletim insan birincil NK hücrelerin daha yüksek bir verim Dextran var.
Birincil insan NK hücreleri 3, 10 ya da 20 IU/hücre MOI ile değiştirdi ve Pb huzurunda yedi gün boyunca kültürlü (8 µg/mL), PS (8 µg/mL), veya dextran (8 µg/mL). Yüzdeleri GFP pozitif NK hücre iletim takip yedinci gün Akış Sitometresi tarafından belirlenmiştir. Üç bağımsız deneyler biri gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Dextran iletim daha yüksek bir verim fare NK hücreleri vardır.
Birincil fare NK hücreleri 30 IU/hücre bir MOI ile değiştirdi ve Pb huzurunda yedi gün boyunca kültürlü (8 µg/mL), PS (8 µg/mL), veya dextran (8 µg/mL). Yüzdeleri GFP ifade hücre Akış Sitometresi tarafından yedi gün iletim takip belirlenmiştir. Üç bağımsız deneyler biri gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: NK Hücre-aracılı sitotoksik etkinlik dönüştürülmüş hücrelerin Dextran değiştirmez.
Birincil NK hücreleri 10 IU/hücre bir MOI ile değiştirdi ve yedi gün boyunca kültürlü. YAS-1 ve K562 hedef hücreler olarak fare (a) ve insan (b) NK hücreleri, sitotoksik potansiyelleri sırasıyla belirlemek için kullanılmıştır. Gösterilen veriler iki bağımsız deney temsilcileri vardır. Ortalamalar SEM ile gösterilen veriler çoğu Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Dextran birincil NK hücreleri IFN γ üretimi değişikliğe yol açmaz.
a) fare NK hücreleri 30 IU bir MOI ile transduced/hücre ve yedi gün boyunca kültürlü. NK hücreleri plaka bağlı anti-NKG2D antikor 18 h için 2,5 µg/mL ile teşvik ve IFN γ bir ELISA kullanarak kültür supernatants sayılabilir. b) transduced insan NK hücreleri 24 h için K562 hücreler kültürlü ve IFN γ üretimi kültür supernatants ölçülmüştür. Sunulan üç bağımsız deneyler temsilcisi verilerdir. Ortalamalar SEM ile gösterilen veriler çoğu Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: İletim dextran ile NK hücrelerin hücre canlılığı değiştirmez.
Dönüştürülmüş insan (a) ve fare (b) NK hücreleri canlılık Annexin-V (PE) Boyama sonra sayısal / 7-AAD pozitif hücrelerinin. Ortalamalar SEM ile gösterilen veriler çoğu Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Katyonik polimer Ajan fare ve insan birincil NK hücreleri lentiviral iletim verimliliğini artırır gibi bu çalışmada dextran o kullanımını gösterir. Ayrıca, Türkçe veya PS, gibi Katyonik diğer ajanlar insan birincil NK hücreleri viral vektörler teslimini üzerinde fark edilebilir bir etkisi olması. Daha önce Türkçe insan T hücreleri17gen iletim çoğaltmak olabilir kanıtlanmıştır. Bu sonuçlar, ancak, ne Türkçe ne de PS benzer bir verimlilik insan birincil NK hücreleri üzerinde var öneririz. Bu çalışmada, Pb iletim etkinliği sadece mütevazi geliştirilmiş fare NK hücrelerindeki. Hücre içi antiviral savunma mekanizmaları bir artırıcı olarak BX795, TBK1/IKKɛ ve PS bir inhibitörü kullanarak inhibisyonu lentiviral iletim verimliliği25artırabilir gösterilmiştir. Bununla birlikte, sonuçlar bu inhibitörü fare veya insan birincil NK hücreleri (veri gösterilmez) iletim etkinliği üzerinde etkisi yoktur gösterdi.

PS ve Pb etkisi varken o dextran birincil insan ve fare NK hücreleri, verimli iletim neden olabilir sonuçları göstermektedir. Sonuçlar da o dextran NK hücreleri, anti-tümör sitotoksisite ve pro-inflamatuar sitokinlerin üretimini gibi efektör fonksiyonları değiştirmez gösterir. Böylece, bu sonuçlar bu birincil NK hücrelerin canlılık dextran kullanımı ile değişmiş değil ispat.

Birden çok çalışmaları ve analiz retroviral vektörler farklı Katyonik polimerler, çeşitli sonuçlar26,27,28ile kullanarak iletim verimliliği karşılaştırıldığında. Bir önceki çalışmada lentiviral vektörler kullanarak bu polimerler iletim etkinliği karşılaştırıldığında; Ancak, bu CD4 içinde test edildi+ T hücreleri16. Bu çalışmalar birinde Türkçe dönüştürülmüş B hücreleri ve dendritik hücreler dextran26için karşılaştırıldığında iletim daha iyi kapasiteye sahip gösterilmiştir. Başka bir çalışmada, diğer arttırıcılar insan B hücrelerinde daha yüksek bir iletim verimliliği dextran kolaylaştırır ve16T hücreleri gösterilmiştir. Geçerli analiz ve insan ve fare birincil NK hücrelerindeki farklı polimerler iletim kapasitesi karşılaştırıldığında bizim bilgi, türünün ilk çalışmadır.

Gen dextran tabanlı transductions en az iki el transductions gerektirebilir. Bu sonuçlar iletim o bir tur yeterli olduğunu göstermek kadar % 100 şu şekilde artış % 40 olumlu transduced hücrelerinin ulaşmak için iletim (veri gösterilmez) yuvarlar iki. NK hücreleri transducing içinde büyük zorluklardan biri transduced gen ifadesinin korumak için bu hücreleri yeteneğidir. Geçerli sonuçlar dextran içeren birincil NK hücreleri iletim istikrarlı ve IL-2 huzurunda kültürlü NK hücreleri vektör korumak ve transgene ifade dört hafta (veri gösterilmez) korumak gösterilmektedir. Ek deneyler iletim verimliliği çözümlemek ve birden fazla transgenes aynı anda ifade incelemek için gereklidir.

Klinik etkinliğinin karşılaştırılması bağışıklık hücre tabanlı kanser tedavileri birden çok kurumlar tarafından doğrulanan. Araba transduced T hücreleri yenilenmiş söz konvansiyonel tedavilere göre kanserli hastalarda hastalık ve nüks Ücretsiz kurtarma için sağlar. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı bir parçası olarak, NK hücreleri efektör fonksiyonları anti-tümör sitotoksisite arabuluculuk önceki Sensitizasyonu gerektirmez. Onların hızlı tepki nedeniyle NK hücreleri bir etkin hücre tabanlı kanserli hastalarda arabuluculuk için bir ideal efektör lenfosit alt kümesidir. Tümör tanıma ve eleme onların olumlu özellikleri rağmen transgenes teslim etmek için genetik manipülasyon ile ilgili teknik engellerin NK hücrelerin sonuna klinik kullanımı sınırlayın.

Elektroporasyon mRNA eksojen gen ekspresyonu için son derece verimli ve daha iyi sonuçlar vardır. Onlar sadece geçici ifade ilgi genlerin izin ve böylece klinik uygulamaları için uygun değildir ancak, mRNA yarar sınırlıdır. NK hücreleri retroviral iletim iletim birden fazla mermi gerektirir daha az verimli; Ayrıca, retroviral vektörler olmayan bölme hücrelere transduce olamaz. Tek umut verici yaklaşım'istikrarlı transgene dır lentiviral vektörler kullanımıdır.

Özet olarak, bu çalışmada efektör fonksiyonları bozulması olmadan birincil NK hücreleri transgenes sunmak için verimli bir yöntem sağlar. Bu iletişim kuralı NK hücre tabanlı kanserli hastalarda yüksek verimli ve ortaya çıkan klinik deneyler için geçerli yapar. Gelecekteki deneyler NK hücre tabanlı kanser immunotherapies Bu yöntemde etkinliğini doğrulamak için ihtiyaç vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir maddi çıkar çatışması iddia.

Acknowledgments

Lucia Sammarco ve onun Lulu'nun limonata standı ilham, motivasyon ve destek için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen NIH R01 AI102893 ve ncı R01 CA179363 (S.M.) tarafından desteklenmiştir; NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); Alex Lemonade Stand Vakfı (S.M.); HRHM Program MACC Fonu (S.M.; S.R.; M.S.T); Nicholas Aile Vakfı (S.M.); Gardetto ailesi (S.M.); Hyundai bilim adamları (M.S.T.) programı; Hyundai umut gezici (S.R.); MACC Fonu (M.S.T. ve S.M.); Çocuk Araştırma Enstitüsü, MCW (S.R.); ve Kathy Duffey Fogerty Ödülü (M.J.R.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran Sigma-Aldrich 90-64-91-9
polybrene (Pb) Sigma-Aldrich TR-1003
protamine sulfate (PS) Sigma-Aldrich p3369
Trypsin Corning 25-052-CI
RPMI1640 Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum ATALANTA S11150
Penicillin Corning 30-001-CI
B-mercaptoethanol SIGMA M3148
sodium pyruvate Corning MT25000CI
Interferon gamma (IFN-γ ) eBioscience 14-7311-85
Propidium lodding staining solution BD 51-66211E
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher L3000015
Isoflurane PHOENIX NDC 57319-559-05
NK cell negative selection kit Stem Cell 19855
Yac-1 ATCC TIB-160
K562 ATCC CCL-243
Mice Jakson 664
293T cells ATCC CRL-3216
T75 flasks Cornnig 430641U
antibody-based negative selection kits Stem Cell 19055
51Chromium (Cr)-release assays perkin elmer's NEZ030
ELISA kits Ebioscience 00-4201-56
Sodium Butyrate Sigma 5887-5G
Linear polyethylenimine polysciences 23966-2
Ficoll GE Life Science 17-1440-03
HBSS Corning 21-022-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
  2. Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
  3. Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
  4. Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
  5. Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
  6. Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95 (2014).
  7. Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94 (2016).
  8. Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
  9. Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
  10. Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
  11. Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
  12. Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
  13. Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
  14. Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
  15. Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
  16. Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
  17. Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
  18. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529 (2009).
  19. Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
  20. Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
  21. Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
  22. Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
  23. Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
  24. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
  25. Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
  26. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
  27. Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
  28. Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).

Tags

İmmünoloji sayı: 131 iletim birincil NK hücreleri dextran genetik olarak değiştirilmiş lentivirus immünoterapi
Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nanbakhsh, A., Best, B., Riese, M.,More

Nanbakhsh, A., Best, B., Riese, M., Rao, S., Wang, L., Medin, J., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells. J. Vis. Exp. (131), e55063, doi:10.3791/55063 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter