Summary
Het doel van deze studie was om formuleren van technologieën die het mogelijk voor succesvolle gene signaaltransductie in primaire natural killer (NK) cellen maken. De dextran-gemedieerde lentivirale transductie van mens of muis primaire NK cellen leidt tot hogere rendementen van gen expressie. Deze methode van gene transductie zal sterk verbeteren NK cel genetische manipulatie.
Abstract
De efficiënte transductie van specifieke genen in natural killer (NK) cellen is een belangrijke uitdaging geweest. Succesvolle transductions zijn cruciaal voor het definiëren van de rol van het gen van belang in de ontwikkeling, differentiatie en functie van NK-cellen. Recente vooruitgang aan chimeer antigeen receptoren (auto's) in kanker immunotherapie gerelateerde benadrukken de noodzaak van een efficiënte methode voor exogene genen naar effector lymfocyten. De efficiëntie van lentivirale-gemedieerde gen transductions in primaire mens of muis NK cellen blijven aanzienlijk laag, dat is een belangrijke beperkende factor. Recente vorderingen met behulp van kationische polymeren, zoals polybrene, weergeven een verbeterde gene transductie efficiëntie in T cellen. Echter zijn deze producten niet om de efficiëntie van de transductie van NK-cellen te verhogen. Dit werk toont dat dextran, een polysaccharide vertakte glucan, aanzienlijk verbetert de efficiëntie van de transductie van mens en muis primaire NK-cellen. Deze zeer reproduceerbaar transductie methodiek biedt een bevoegde instrument voor menselijke primaire NK-cellen, die enorm klinische gene levering toepassingen en dus NK cel-gebaseerde kanker immunotherapie. verbeteren kunnen transducing
Introduction
Natural killer (NK) cellen zijn de belangrijkste lymfatische bevolking van het aangeboren immuunsysteem1. NK cellen functioneren als de verdedigers van de eerste regel van de immuunrespons van de gastheer tegen infecties en tumoren2,3,4. NK-cellen spelen ook een centrale rol in de ontwikkeling van tolerantie door de afscheiding van krachtige cytokines en chemokines5. Vanwege hun krachtige vermogen te richten en te elimineren van tumorcellen, worden meerdere klinische proeven uitgevoerd om te evalueren van donor-afgeleide menselijke NK cellen als een adoptive-immunotherapie voor kanker6,7. In tegenstelling tot de T-cellen moet de ontwikkelingsbiologie van NK-cellen nog goed gekarakteriseerd8. Dit gebrek aan kennis is gedeeltelijk te wijten aan het gebrek aan efficiënte technieken die genen van belang te aan de muis of menselijke primaire NK-cellen leveren. Om deze redenen, zijn meeste NK-cel studies uitgevoerd in cellijnen, in plaats van elektrische elementen. Daarom is het noodzakelijk om een betrouwbaar en efficiënt protocol te transduce primaire NK-cellen met genen van belang cruciaal.
Het algemene doel van deze studie was om het formuleren van een consistente en betrouwbare methode waarbij primaire mens of lymfkliertest NK-cellen kon worden transduced met lenti- of retrovirussen.
Eerdere studies dat geprobeerd dit probleem aan te pakken zijn uitgevoerd, voornamelijk met behulp van de tijdelijke transformatie van primaire NK-cellen. Dit omvat plasmide transfectie9,10, Epstein - Barr Virus (EBV) / retrovirale hybride vector11, "vacciniavirus" vectoren12,13, en14chimeer adenovirale vectoren AD5-post/F35. Ondanks de bescheiden efficiëntie van deze technieken maakt de voorbijgaande aard van signaaltransductie hen ongeschikt voor het langdurig gebruik van de genetisch gemodificeerde NK-cellen. Een paar recente studies hebben gewend retrovirale vectoren transduce NK-cellen, waarbij meerdere cycli van infectie tot een aanvaardbaar niveau van gen expressie11,15. In tegenstelling tot retrovirale vectoren kunt lentivirale vectoren gastheercel nucleaire importeren machines translocate van de virale pre integratie-complex in de kern. Dit is een belangrijke beperkende factor in de replicatie van het virus in niet-delende cellen, waaronder primaire NK-cellen.
Interacties tussen de verschillende receptoren van het celoppervlak en virale deeltjes toestaan virale opname in de cel. De eerste gevechten tussen de virale envelop eiwitten en hun receptoren cognaat host kunnen worden beperkt wegens de potentiële negatieve kosten bestaan tussen deze twee. De grondgedachte achter vele transductie technieken is dat de toevoeging van kationische polymeren, zoals polybrene (Pb), tijdje sulfaat (PS) of dextran, zou kunnen geven van een positieve lading aan de receptoren van het celoppervlak en daarmee de binding van virale envelop vergroten eiwitten. Dit verhoogt de efficiëntie van de fusie en de opname van de virale deeltjes door de cellen16. Hoewel het is gemeld dat de Pb of PS genenoverdracht van T cellen17kan verbeteren, had hun toepassing geen enkel effect in de efficiëntie van de transductie van primaire NK-cellen. Bovendien heeft een vergelijkende analyse tussen deze reagentia met behulp van primaire NK-cellen niet is uitgevoerd. In deze studie, werden de efficiëntie van de transductie van de drie kationische polymeren vergeleken. De resultaten tonen aan dat, onder deze drie kationische polymeren, alleen dextran aanzienlijk efficiënte virale signaaltransductie in zowel muis als menselijke primaire NK-cellen verbetert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke protocollen gevolgd van de humane en ethische behandeling van dieren en zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) binnen de biomedische Research Center (BRC) van de medische universiteit van Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI. Het gebruik van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) werd goedgekeurd door de institutionele Review Board (IRB) van het bloed onderzoek instituut van het bloed Center van Wisconsin, Milwaukee, WI.
1. muizen, cellijnen en vectoren
- C57BL/6 muizen verkrijgen bij commerciële leveranciers. Handhaven van de kolonies van de muis in pathogenen vrije omstandigheden en gebruik van vrouwelijke en mannelijke muizen tussen de leeftijden van 6 tot 12 weken. De geïdentificeerde menselijke PBMCs verkrijgen IRB-erkende bronnen.
- Anesthetize de dieren met een mengsel van 20-30% v/v Isofluraan in propyleenglycol (1, 2-propaandiol, USP rang) naar het anesthetize van de muizen. Dierenarts zalf toepassen in de ogen te voorkomen dat droogte, terwijl de muizen onder verdoving zijn.
- Uitvoeren om te euthanaseren van de dieren, cervicale dislocatie na de inductie van de anesthesie.
- Beperken de muizen door stevig grijpen de basis van de staart met één hand. Plaats de pen van een stevige stok-type of de duim en de eerste vinger van de andere hand tegen de achterkant van de nek, aan de voet van de schedel.
- Voor de productie van de dislocatie, duw de hand beteugeling van het hoofd van het dier toekomen en duw terwijl het naar achteren trekken met de hand die de staart basis hebt. Controleer of de doeltreffendheid van dislocatie door gevoel voor een scheiding van cervicale weefsel.
- Houden van de dieren in de kamer/kooi voor ten minste 5 minuten en verwijder hen alleen wanneer respiratoire activiteit afwezig is of wanneer er een gebrek aan een detecteerbare hartslag.
- K562 en YAC-1 cellen te verkrijgen van commerciële leveranciers en onderhouden ze in RPMI1640 medium met 10% warmte-geïnactiveerd FBS. Test deze cellijnen periodiek uit te sluiten van de mogelijkheid van mycoplasma verontreiniging.
2. voorbereiding en titratie van lentivirale vectoren
- Cultuur 5 × 106 293T cellen overnachting in een T75 cm2 kolf met een oplossing van 20 mL RPMI1640 medium met 10% FBS 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine, 1 mM natrium pyruvaat, 5% van 7,5% natriumbicarbonaat oplossing, en 0.001% Β-mercaptoethanol. Plaats de kolf in een incubator van de 37 ° C toegediend met 5,2% CO2.
- Oogsten van de cellen van de 293T met behulp van trypsine (0.025%)/EDTA (1 mM) in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 5 mL trypsine/EDTA in PBS en de kolven gedurende 10 minuten in een 37 ° C een incubator voor het toestaan van het detachement van 293T cellen uit de T75 cm2 transportvaten uit te broeden.
- De vrijstaande cellen verzamelen en was ze twee keer in PBS te verwijderen van alle sporen van trypsine en EDTA. Tellen van de cellen met een hemocytometer en aanpassen van het nummer van de cel naar een miljoen cellen per mL.
- Transfect van de 293T cellen18 met 3.95 µg voor psPAX2, pMD2G 1,32 µg en 5.26 µg pLEP-GFP-Puro (gegenereerd intern op BRI door klonen EF1alpha promotor van pWPI in plaats van een CMV-promotor in lolploeg CMV-GFP-Puro)19.
- Bereiden 1 mL van 150 mM NaCl plus 63 µL van 0,6 mg/mL polyethylenimine (PEI; 25.000 kD, lineaire). Meng goed en voeg de plasmiden vervolgens en meng. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens toevoegen aan cellen.
- 16 h na transfectie, vervang het medium van de transfectie met verse medium plus 4.5 mM natrium butyraat. Oogst van de bovendrijvende substantie met virus 48u na transfectie en concentreren door centrifugering van de overnachting bij 5.000 × g. Zie de tabel van de materialen.
- Bepalen van de virale titers cuvetten van 293T door het uitvoeren van seriële verdunningen en assay door stroom cytometry 72 h na transductie20. De expressie voor de groen fluorescente proteïne (GFP) gebruiken als een maatregel te kwantificeren van de virale titers.
3. de zuivering en uitbreiding van lymfkliertest primaire NK-cellen
- Zuiveren lymfkliertest primaire NK cellen21. Kort, pass eencellige milt schorsingen door nylon wol kolommen om afbrekende het aanhangend populaties, bestaande uit de B-cellen en macrofagen.
- Cultuur, de bevolking van niet-aanhanger geëlueerd van de nylon wol kolom waarin lymfkliertest NK-cellen met 1.000 U/mL Interleukine (IL) -2 in RPMI1640 gemiddeld met 10% FBS 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine, 1 mM natrium pyruvaat, 5% van 7,5% natriumbicarbonaat oplossing, en 0.001% β-mercaptoethanol (RPMI1640 compleet medium).
- Wijzigen van het medium van de kolven op dag 4 van deze cultuur te verwijderen de niet-aanhanger T en de NKT cellen; cellen die gekleefd op de kolven blijven zijn grotendeels NK-cellen. Voeg 20 mL van de verse RPMI1640 compleet medium en 1.000 U/mL IL-2 om aan te vullen van de kolven.
- Neem contact op de zuiverheid van de lymfkliertest NK celculturen op dag 7 door stroom cytometry met NK-cel-specifieke markeringen20 preparaten met meer dan 95 gewichtspercenten CD3-NK1.1+ bevolking.
4. zuivering en uitbreiding van menselijke primaire NK-cellen
- Isoleren PBMCs door verloop van de dichtheid van het buffy coats gezonde menselijke vrijwilligers. Kort, zorgvuldig laag 35 mL half-verdund (met HBSS) cellen meer dan 15 mL dichtheid verloop in een canonieke buis van 50 mL. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 30 minuten bij 20 ° C in een swingende emmer rotor zonder rem.
- Gebruik de commerciële antilichaam gebaseerde negatieve selectie kits voor het zuiveren van menselijke primaire NK-cellen volgens protocol van de fabrikant.
- Na het isolement, bepalen de zuiverheid van de NK-cel voorbereidingen door immunofluorescentie analyses. Vlek NK cel preparaten met 2 µg/mL anti-CD3 en 2 µg/mL anti-CD56 antilichamen bij 4 ° C gedurende 20 minuten wassen de cellen tweemaal met PBS NK-cel populaties bepaald door het ontbreken van CD3 en de aanwezigheid van CD56 op het celoppervlak.
- Incubeer de voorbereidingen van de cel met antilichamen voor 20 min bij 4 ° C wassen met PBS en analyseren in een flow-cytometer. NK-cel preparaten gebruiken met meer dan 85% zuiverheid voor de gene transductie testen20.
5. transductie van lymfkliertest en menselijke primaire NK-cellen met lentivirus
- Schorten muis of mens primaire NK-cellen in een 24-well plaat op 0,5 × 105/mL van medium in aanwezigheid van GFP lentivirus supernatant in 5, 10 en 20 multipliciteit van infectie (MOI) en in het bijzijn van Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL) of dextran (8 µg/mL).
- Centrifugeer de platen bij 1000 × g gedurende 60 min.
- Zonder de bovendrijvende vloeistof decanteren, cultuur de cellen 's nachts (16-18 h) in een incubator van de 37 ° C toegediend met 5,2% CO2.
- Wassen met 10 mL PBS en resuspendeer in 2 mL zuiver compleet RPMI1640-kweekmedium in aanwezigheid van IL-2 (300 U/mL).
- Testen van de mens en muis primaire NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit tegen K562 en YAC-1, respectievelijk door het uitvoeren van 51chroom (Cr)-release assays bij gevarieerd effector-naar--doelcel ratio's22.
- Kort, geven een miljoen target cellen 50 µCi van radiolabeled natrium chromaat 51Cr. Tijdens de incubatietijd van 4 uur, ze opname de 51Cr tot cellulaire proteïnen. Aan het eind van de incubatie, wassen de cellen om te verwijderen van elk designated etiket.
- Lysis van de cel van de specifieke tumor berekenen door het bedrag van de absolute, spontane en experimentele versie van 51Cr van de doelcellen.
Opmerking: De berekening van het percentage van specifieke lysis van pentaplicate experimenten werd gedaan met behulp van de volgende vergelijking: % specifieke lysis = ((51Cr bedoel experimentele introductie - 51Cr gemiddelde spontane release) / (51Cr bedoel maximale release - 51Cr bedoel spontane release)) х 100, waar "51Cr gemiddelde spontane release" is de 51Cr vrijgelaten uit de doelcellen in het ontbreken van NK-cellen en "51Cr gemiddelde maximale release" is de 51Cr doelcellen op lysis verlost door zoutzuur 2 N (HCl).
- Oogst de getransduceerde NK-cellen op dag 7 door zachtjes te tikken op de kolven.
- Activeer de geoogste cellen met milliliters gestelde concentraties van plaat-gebonden anti-NKG2D (A10) mAb door coating 96-Wells, hoog eiwit-absorberend polystyreen platen met 2,5 µg Mo/mL concentraties van anti-NKG2D mAb's nachts.
- Wassen elk goed met 100 µL van PBS drie keer vóór de toevoeging van primaire NK-cellen.
- Verzamelen van supernatant van cultuur met behulp van een precisiepipet meerkanaals tussen 16 en 18 h Activering achteraf te kwantificeren van cytokines zoals IFN-γ. Het genereren van standaard krommen met behulp van de recombinante cytokines voorzien van enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits.
- Het percentage van necrotisch cellen onder de getransformeerde NK-cellen met behulp van een stroom cytometer te testen van de levensvatbaarheid van de NK-cellen met behulp van Annexine-V/7-amino-actinomycin D (7-AAD) kleuring23 .
- Voor het uitvoeren van deze test, oogst de NK lymfkliertest en menselijke cellen van vier dagen na de signaaltransductie, was twee keer met 10 mL koude PBS bij 500 × g gedurende 5 minuten elk, en broeden met een Annexin-V (PE) / 7-AAD kit.
- Passende stroom cytometry software gebruiken om de gegevens te analyseren. Selecteer de live-celpopulatie en analyseren van de expressie van GFP (FITC kanaal) als een maatregel van virale transductie24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dextran induceert de efficiënte genenoverdracht van lentivirale vector in primaire menselijke en lymfkliertest NK-cellen
Menselijke NK cellen werden geïsoleerd en gezuiverd van PBMC (met een zuiverheid van meer dan 85%) en 's nachts geïncubeerd met rIL-2 300 U/mL. Werden vervolgens getransduceerde deze primaire NK-cellen met GFP lentivirus op gevarieerde multipliciteit van infectie (MOI; 3, 10 en 20 IU per cel) in 24-Wells-platen in het bijzijn van 8 µg/mL Pb, PS of dextran. De cellen waren gecentrifugeerd bij 1000 × g gedurende 60 min en gekweekt (in aanwezigheid van virus) 's nachts bij 37 ° C in een broedstoof CO2 . Cellen werden gewassen en in vers RPMI1640 compleet medium met rIL-2 300 U/mL geresuspendeerde gedurende zeven dagen. De efficiëntie van de signaaltransductie werd beoordeeld door stroom cytometry voor GFP expressie zeven dagen na transductie. Resultaten tonen aan dat dextran verbetert de efficiëntie van lentivirale signaaltransductie in menselijke NK-cellen en verhoogt de virale titer, die kan ook het verbeteren van het percentage getransduceerde NK-cellen (Figuur 1).
Lymfkliertest NK-cellen werden geïsoleerd en gekweekt zoals beschreven in de vorige sectie. Het bovenstaande protocol werd gebruikt voor het analyseren en vergelijken van de efficiëntie van de transductie van Pb, Ps en dextran. In Figuur 2 blijkt dat dextran kan het vergroten van de efficiëntie van lentivirale vectoren in vergelijking met Pb of Psalm
Transductie van NK-cellen met dextran heeft geen invloed op hun vermogen om te bemiddelen effector functies
De cytotoxische capaciteit van getransduceerde menselijke en lymfkliertest NK-cellen werd onderzocht door 51Cr-release assays tegen K562 en YAC-1 als de doelcellen. Resultaten gepresenteerd in Figuur 3a en b blijkt dat de transductie van NK-cellen door dextran niets aan negatief het potentieel van de doden van getransformeerde NK-cellen ten opzichte van niet-getransduceerde NK-cellen verandert. Bovendien was de cytokine productie uit getransduceerde primaire NK cellen geanalyseerd. IFN-γ generatie werd gemeten met behulp van een ELISA. Getransduceerde menselijke primaire NK cellen waren mede gekweekte met K562 gedurende 24 uur, en het supernatant werden verzameld tot maatregel IFN-γ. Resultaten gepresenteerd in figuur 4a onthullen dat dextran heeft geen invloed op het vermogen van getransduceerde NK-cellen te cytokines produceren. Als een onafhankelijke validatie, waren getransduceerde NK-cellen geactiveerd met milliliters gestelde concentraties van plaat-gebonden anti-NKG2D (A10) mAb voor 18 h. cultuur supernatant werden verzameld en IFN-γ generatie werd gemeten door ELISA. Resultaten die worden weergegeven in figuur 4b onthullen dat de transductie van lymfkliertest NK-cellen met dextran heeft geen invloed op hun vermogen om te produceren van cytokines.
Transductie van NK-cellen met dextran heeft geen invloed op hun levensvatbaarheid van de cellen
De invloed van Pb, PS of dextran op de levensvatbaarheid van getransduceerde NK-cellen werd geëvalueerd aan de hand van een test van de jodide (PI) propidium en latere stroom analyses. Resultaten in figuur 5a en b tonen aan dat, hoewel transducing primaire mens en muis NK cellen met virussen leiden necrose in ongeveer 20% van NK-cellen tot kan, de toevoeging van dextran niet deze necrose in vergelijking met Pb vergroten deed of Psalm
Statistische analyses werden uitgevoerd met een tweezijdige ongepaarde Student t-test. P -waarden ≤ 0,05 significant werden beschouwd.
Figuur 1: Dextran heeft een hogere efficiëntie van de transductie van menselijke primaire NK-cellen.
Primaire menselijke NK-cellen werden omgevormd met MOI van 3, 10 of 20 IU/cel en gekweekte waren voor zeven dagen in de aanwezigheid van Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL), of dextran (8 µg/mL). Percentages van GFP-positieve NK cellen werden vastgesteld door stroom cytometry op dag 7 na de signaaltransductie. Een van de drie onafhankelijke experimenten is aangetoond. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Dextran heeft een hogere efficiëntie van signaaltransductie in lymfkliertest NK-cellen.
Primaire lymfkliertest NK-cellen werden getransformeerd met een MOI van 30 IU/cel en gekweekte waren voor zeven dagen in de aanwezigheid van Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL), of dextran (8 µg/mL). Percentages van GFP-uiten cellen werden vastgesteld door stroom cytometry op zeven dagen na de signaaltransductie. Een van de drie onafhankelijke experimenten is aangetoond. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Dextran wijzigt niet de NK-cel-gemedieerde cytotoxische activiteit van getransformeerde cellen.
Primaire NK-cellen werden getransformeerd met een MOI van 10 IU/cel en gekweekte waren voor zeven dagen. YAC-1 en K562 werden gebruikt als de doelcellen te bepalen van de cytotoxische mogelijkheden van lymfkliertest (a) en menselijke (b) NK-cellen, respectievelijk. De gegevens die worden weergegeven zijn vertegenwoordigers van twee onafhankelijke experimenten. De gegevens die worden weergegeven zijn gemiddelden met SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Dextran verandert niets aan de IFN-γ-productie van primaire NK-cellen.
a) lymfkliertest NK-cellen werden getransduceerde met een MOI van 30 IU/cel en gekweekte gedurende zeven dagen. NK-cellen werden gestimuleerd met 2,5 µg Mo/mL van plaat-gebonden anti-NKG2D antilichamen tegen 18u en IFN-γ was supernatant van cultuur met behulp van een ELISA gekwantificeerd. b) getransduceerde menselijke NK-cellen werden gekweekt met K562 cellen gedurende 24 uur, en de productie van IFN-γ werd gemeten in supernatant van cultuur. De gepresenteerde gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. De gegevens die worden weergegeven zijn gemiddelden met SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Transductie van NK-cellen met dextran verandert niets aan hun levensvatbaarheid van de cellen.
De levensvatbaarheid van getransformeerde mens (a) en (b) NK-cellen van muis werd gekwantificeerd na kleuring voor Annexin-V (PE) / 7-AAD positieve cellen. De gegevens die worden weergegeven zijn gemiddelden met SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie toont aan dat het gebruik van dextran als een agent van kationische polymeer de efficiëntie van de lentivirale transductie van zowel menselijke als lymfkliertest primaire NK-cellen verbetert. Bovendien hebben andere kationogene stoffen, als Pb of PS, geen waarneembaar effect op de levering van virale vectoren naar menselijke primaire NK-cellen. Eerder, is gebleken dat Pb gene signaaltransductie in menselijke T cellen17kan vergroten. Deze resultaten suggereren echter Pb noch PS hebben een vergelijkbare efficiëntie op menselijke primaire NK-cellen. In deze studie, Pb verbeterd de signaaltransductie werkzaamheid slechts bescheiden in lymfkliertest NK-cellen. Het is aangetoond dat de remming van de intracellulaire antivirale afweermechanismen met behulp van BX795, een inhibitor van TBK1/IKKɛ, en PS als een versterker de efficiëntie van lentivirale transductie25 verhogen kan. Echter toonden de resultaten aan dat deze Inhibitor van de omwenteling geen invloed op de werkzaamheid van de signaaltransductie in lymfkliertest of menselijke primaire NK-cellen (gegevens niet worden weergegeven heeft).
De resultaten tonen aan dat dextran kan veroorzaken de efficiënte transductie van primaire mens en muis NK cellen, terwijl PS en Pb geen effect hebben. Uit de resultaten blijkt ook dat dextran verandert niets aan de effector functies van NK-cellen, zoals anti-tumor cytotoxiciteit en de productie van pro-inflammatoire cytokines. Dus, deze resultaten bewijzen dat de levensvatbaarheid van deze primaire NK-cellen niet door het gebruik van dextran was gewijzigd.
Meerdere studies geanalyseerd en vergeleken van de efficiëntie van de transductie van retrovirale vectoren met behulp van verschillende kationische polymeren, met uiteenlopende resultaten26,27,28. Een eerdere studie vergeleek de werkzaamheid van de transductie van deze polymeren met behulp van lentivirale-vectoren; echter werd dit getest in CD4+ T cellen16. In één van deze studies, heeft het aangetoond dat Pb een betere capaciteit van signaaltransductie getransformeerde B-cellen en dendritische cellen vergeleken met dextran26 heeft. In een andere studie, heeft het aangetoond dat dextran een hogere efficiëntie van de transductie dan andere smaakversterkers in menselijke B-cellen vergemakkelijkt en T16 cellen. De huidige studie is de eerste in zijn soort, om onze kennis, die geanalyseerd en vergeleken van de capaciteit van de transductie van verschillende polymeren in zowel menselijke als lymfkliertest primaire NK-cellen.
Dextran gebaseerde gene transductions kunnen vereisen een minimum van twee rondes van transductions. Deze resultaten tonen aan dat een ronde van signaaltransductie genoeg om te komen tot 40% van de positief getransduceerde cellen, die omhoog wordt verhoogd tot 100% volgende twee rondes van signaaltransductie (gegevens niet worden weergegeven). Een van de belangrijkste uitdagingen in de transducing van NK-cellen is het vermogen van deze cellen te behouden van de expressie van het getransduceerde gen. De huidige resultaten tonen aan dat de transductie van primaire NK-cellen met dextran stabiel is en dat de NK-cellen die worden gekweekt in aanwezigheid van IL-2 kunnen behouden van de vector en onderhouden van transgenic expressie voor vier weken (gegevens niet worden weergegeven). Extra experimenten zijn vereist voor het analyseren van de transductie efficiëntie en te onderzoeken van de gelijktijdige weergave van meerdere transgenen.
De klinische werkzaamheid van immuun cel-gebaseerde kankertherapieën is gevalideerd door meerdere instellingen. AUTO-getransduceerde T-cellen zorgen voor hernieuwde belofte voor het herstel en herval-ziektevrije van kankerpatiënten in vergelijking met conventionele therapieën. Als onderdeel van de aangeboren immuunresponsen vereisen NK-cellen geen voorafgaande overgevoeligheid te bemiddelen hun effector functies, met inbegrip van anti-tumor cytotoxiciteit. Als gevolg van hun snelle reactie zijn NK-cellen een ideale effector lymfocyt deelverzameling te bemiddelen een efficiënte cel-gebaseerde kanker immunotherapie. Ondanks hun positieve kenmerken in de erkenning van de tumor en eliminatie beperken de technische hindernissen met betrekking tot de genetische manipulatie te leveren transgenen het zo volledig klinische gebruik van NK-cellen.
Electroporation van mRNA voor exogene genexpressie is zeer efficiënt en heeft betere resultaten. MRNA hulpprogramma is echter beperkt, omdat zij toestaan dat alleen de voorbijgaande expressie van genen van belang en daardoor niet geschikt voor klinische toepassingen zijn. De retrovirale transductie van NK-cellen is minder efficiënt zijn als er meerdere rondes van transductie; Bovendien kunnen niet retrovirale vectoren transduce in niet-delende cellen. Het enige veelbelovende aanpak voor stabiele transgenic levering is het gebruik van lentivirale vectoren.
Over het geheel genomen is deze studie biedt een efficiënte methode om te transgenen leveren in primaire NK-cellen, zonder afbreuk te doen aan hun effector functies. Dit protocol maakt NK cel-gebaseerde kanker immunotherapie, zeer efficiënte en toepassing op opkomende klinische proeven. Toekomstige experimenten zijn nodig om de doeltreffendheid van deze methode in NK kanker cel-gebaseerde immuuntherapie valideren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs beweren geen financieel belangenconflict.
Acknowledgments
Wij danken Lucia Sammarco en haar Lulu's limonade staan voor inspiratie, motivatie en ondersteuning. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH R01 AI102893 en NCI R01 CA179363 (S.M.); NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); de Alex Lemonade Stand Stichting (S.M.); het programma van de HRHM van het Fonds MACC (S.M.; S.R.; M.S.T); de Nicolaas Family Foundation (S.M.); de Gardetto familie (S.M.); de Hyundai geleerden Program (M.S.T.); Hyundai hoop op wielen (S.R.); het Fonds MACC (M.S.T. en S.M.); de Children's Research Institute, MCW (S.R.); en de Kathy Duffey Fogerty Award (M.J.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
| polybrene (Pb) | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| protamine sulfate (PS) | Sigma-Aldrich | p3369 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATALANTA | S11150 | |
| Penicillin | Corning | 30-001-CI | |
| B-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | |
| sodium pyruvate | Corning | MT25000CI | |
| Interferon gamma (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
| Propidium lodding staining solution | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| Isoflurane | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| NK cell negative selection kit | Stem Cell | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| Mice | Jakson | 664 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| T75 flasks | Cornnig | 430641U | |
| antibody-based negative selection kits | Stem Cell | 19055 | |
| 51Chromium (Cr)-release assays | perkin elmer's | NEZ030 | |
| ELISA kits | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| Sodium Butyrate | Sigma | 5887-5G | |
| Linear polyethylenimine | polysciences | 23966-2 | |
| Ficoll | GE Life Science | 17-1440-03 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV |
References
- Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
- Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
- Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
- Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
- Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95 (2014).
- Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94 (2016).
- Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
- Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
- Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
- Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
- Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
- Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
- Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
- Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
- Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
- Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529 (2009).
- Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
- Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
- Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
- Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
- Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
- Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
- Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
- Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
- Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).
