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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Dextrane augmente l’efficacité de la Transduction des gènes des cellules NK primaires murines et humaines

Published: January 15, 2018 doi: 10.3791/55063
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 1,5,6,7
1Laboratory of Molecular Immunology and Immunotherapy, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 2Vector Core Lab, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 3Laboratory of Lymphocyte Biology, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 4Laboratory of Stem Cell Transcriptional Regulation, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 5Department of Microbiology and Immunology, The Medical College of Wisconsin, 6Department of Pediatrics, The Medical College of Wisconsin, 7Department of Medicine, The Medical College of Wisconsin

Summary

L’objectif de cette étude était de formuler des technologies permettant la transduction réussie de gène dans les cellules primaires de le natural killer (NK). L’induite par le dextran de transduction des gènes de l’homme ou les résultats de cellules NK primaires de souris à une efficacité accrue les expression de gène. Cette méthode de transduction gène améliorera la manipulation génétique de cellules NK.

Abstract

La transduction efficace de gènes spécifiques dans les cellules tueuses naturelles de (NK) a été un défi majeur. Transductions réussies sont essentielles pour définir le rôle du gène d’intérêt dans le développement, la différenciation et la fonction des cellules NK. Avances récentes relies aux récepteurs d’antigènes chimérique (RAC) en immunothérapie contre le cancer accentuent la nécessité d’une méthode efficace livrer des gènes exogènes aux lymphocytes effecteurs. Les efficacités de transductions génique par l’intermédiaire des gènes humains primaires ou cellules NK souris restent très faibles, qui est un facteur limitatif important. Les avancées récentes à l’aide de polymères cationiques, comme polybrene, montrent une efficacité de transduction amélioration génétique dans les cellules T. Toutefois, ces produits n’a pas à améliorer l’efficacité de la transduction des cellules NK. Ce travail montre que dextran, un polysaccharide de glucane ramifié, améliore considérablement l’efficacité de la transduction de l’homme et les cellules NK primaires de souris. Cette méthodologie de transduction hautement reproductible fournit un outil compétent pour transduction primaire NK les cellules humaines, qui peuvent améliorer considérablement les demandes de livraison de génétique clinique et donc d’immunothérapie des cancers basés sur les cellules NK.

Introduction

Natural killer (NK) cellules sont la population lymphocytaire majeure du système immunitaire inné1. Les cellules NK fonctionnent comme les défenseurs de la première ligne de la réponse immunitaire hôte contre infections et tumeurs2,3,4. Les cellules NK jouent également un rôle central dans le développement de la tolérance par le biais de la sécrétion de cytokines puissant et chimiokines5. En raison de leur puissante capacité à cibler et éliminer les cellules tumorales, plusieurs essais cliniques sont en cours pour évaluer le dérivé donneur de cellules NK humaines comme une immunothérapie adoptive pour cancer6,7. Contrairement aux cellules T, la biologie du développement des cellules NK doit encore être bien caractérisés8. Cette ignorance est partiellement due à l’absence de techniques efficaces qui offrent des gènes d’intérêt à la souris ou les cellules primaires humaines de NK. Pour ces raisons, la plupart des études de NK-cellule ont été menées dans des lignées cellulaires, plutôt que dans les cellules primaires. Par conséquent, la nécessité d’un protocole fiable et efficace transmettre des cellules NK primaires avec des gènes d’intérêt est cruciale.

L’objectif général de cette étude était de formuler une méthode cohérente et fiable par lequel des cellules primaires humaines ou murins NK pourraient être transduites avec lenti - ou rétrovirus.

Des études antérieures qui a tenté de remédier à ce problème ont été réalisées, dans une large mesure à l’aide de la transformation passagère des cellules NK primaires. Cela inclut le plasmide transfection9,10, Virus Epstein - Barr (EBV) / hybride retroviral vector11, Vaccine vecteurs12,13et Ad5/F35 chimérique vecteurs adénoviraux14. Malgré l’efficacité modeste de ces techniques, la nature transitoire de la transduction les rend impropres à l’utilisation à long terme des cellules NK génétiquement modifiés. Quelques études récentes ont utilisé des vecteurs rétroviraux pour transmettre les cellules NK, nécessitant plusieurs cycles d’infection pour atteindre un niveau acceptable de gene expression11,15. Contrairement aux vecteurs rétroviraux, vecteurs LENTIVIRAUX peuvent utiliser machinery import nucléaire cellule hôte de translocation complexe viral avant intégration dans le noyau. Il s’agit d’un facteur limitatif important dans la réplication du virus dans les cellules non-divisant, incluent des cellules NK primaires.

Interactions entre les différents récepteurs de surface cellulaire et particules virales permettent absorption virale dans la cellule. Les engagements initiaux entre les protéines de l’enveloppe virale et leurs récepteurs apparentés hôte pourraient être limitées en raison des charges négatives potentielles existant entre ces deux. La raison d’être de nombreuses techniques de transduction est que l’ajout de polymères cationiques, comme polybrene (Pb), du sulfate de protamine (PS) ou dextran, pourrait donner une charge positive sur les récepteurs de surface cellulaire et ainsi augmenter la fixation de l’enveloppe virale protéines. Cela augmentera l’efficacité de la fusion et l’absorption des particules virales par les cellules16. Bien qu’il ait été rapporté que Pb ou PS peut améliorer de transfert de gènes dans les cellules de T17, leur application n’avait aucun effet à l’efficacité de la transduction des cellules NK primaires. En outre, une analyse comparative entre ces réactifs à l’aide des cellules NK primaires n’a pas effectuée. Dans cette étude, on a comparé l’efficacité de la transduction des trois polymères cationiques. Les résultats montrent que, parmi ces trois polymères cationiques, seulement de dextran améliore considérablement la transduction virale efficace dans les souris et les cellules primaires humaines de NK.

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Protocol

Tous les protocoles d’animaux suivis le traitement humain et éthique des animaux et ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) dans le centre de recherche biomédicale (BRC) du Collège médical du Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI. L’utilisation de cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) a été approuvée par l’Institutional Review Board (IRB) de l’Institut de recherche de sang de le sang Centre du Wisconsin, Milwaukee, WI.

1. souris, lignées de cellules et vecteurs

  1. Obtenir des souris C57BL/6 auprès de fournisseurs commerciaux. Maintenir les colonies de souris dans des conditions exempts de micro-organismes pathogènes et d’utiliser des souris mâles et femelles âgés de 6 à 12 semaines. Obtenir des PBMC humaines dépersonnalisées provenant de sources approuvées à la CISR.
  2. Anesthésier les animaux avec un mélange de 20 à 30 % v/v isoflurane en propylène glycol (1, 2-propanediol, grade USP) à anesthésier les souris. EFP pommade pour les yeux à prévenir le dessèchement tandis que les souris sont sous anesthésie.
  3. Pour euthanasier les animaux, effectuer une dislocation cervicale après l’induction de l’anesthésie.
    1. Immobiliser les souris en agrippant fermement la base de la queue d’une main. Placez un stylo robuste de type bâton ou le pouce et l’index de l’autre main contre l’arrière du cou, à la base du crâne.
    2. Pour produire la dislocation, pousser la main interdisant à la tête de l’animal vers l’avant et pousser vers le bas tout en tirant vers l’arrière avec la main qui tient la queue de base. Vérifier l’efficacité de la dislocation de sentiment pour une séparation des tissus du col.
  4. Garder les animaux dans la chambre/cage pendant au moins 5 min et supprimez-les uniquement lorsque l’activité respiratoire est absente ou lorsqu’il y a un manque d’un battement de coeur détectable.
  5. Obtenir les cellules K562 et YAC-1 provenant des fournisseurs commerciaux et leur maintien en RPMI1640 milieu contenant 10 % inactivés par la chaleur FBS. Tester ces lignées cellulaires périodiquement afin d’exclure la possibilité de contamination par mycoplasmes.

2. préparation et titrage des vecteurs LENTIVIRAUX

  1. Cellules en culture 5 × 106 293 t du jour au lendemain dans une fiole de2 cm de T75 contenant une solution de 20 mL de milieu de RPMI1640 avec 10 % FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, pyruvate de sodium 1 mM, 5 % de solution de bicarbonate de sodium 7,5 % et 0,001 % Β-mercaptoéthanol. Placer la fiole dans un incubateur à 37 ° C infusé avec 5,2 % CO2.
  2. Récolter les cellules 293 t à l’aide de la trypsine (0.025%)/EDTA (1 mM) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 5 mL de trypsine/EDTA dans du PBS et incuber les flacons pendant 10 min dans un 37 ° C un incubateur pour permettre le détachement des cellules 293 t de ces flacons T75 de2 cm.
    1. Recueillir les cellules individuelles et les laver deux fois dans du PBS pour éliminer toute trace de trypsine et EDTA. Compter les cellules avec un hémocytomètre et ajuster le nombre de cellules à 1 million de cellules / mL.
  3. Transfecter les cellules 293 t18 avec 3,95 µg de psPAX2 1.32 µg de pMD2G et 5,26 µg de propice-GFP-Puro (généré interne à l’IRB en clonant EF1alpha promoteur de pWPI à la place d’un promoteur de CMV chez pLenti CMV-GFP-Puro)19.
    1. Préparer 1 mL de NaCl 150 mM et 63 µL de 0,6 mg/mL polyéthylènimine (PEI ; 25 000 kD, linéaire). Bien mélanger puis ajouter les plasmides et mélanger. Incuber pendant 20 min à température ambiante, puis l’ajouter aux cellules.
    2. transfection après 16 h, remplacer le milieu de la transfection avec un milieu frais et le butyrate de sodium 4,5 mM. Récolter le surnageant contenant après transfection de virus 48 h et concentré par une centrifugation à 5 000 × g. Consultez la Table des matières.
  4. Déterminer les titres viraux à l’aide de cellules 293 t en effectuant des dilutions sériées et dosage par écoulement cytometry 72 h après transduction20. Utiliser l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) comme une mesure pour quantifier les titres viraux.

3. purification et l’expansion des cellules NK primaires murines

  1. Purifier le murin de cellules NK primaire21. En bref, passer des suspensions rate unicellulaire dans les colonnes de laine en nylon pour épuiser les populations adhérentes constitué des macrophages et des lymphocytes B.
  2. Les populations non adhérents éluées de la colonne de laine en nylon qui contient des cellules NK avec 1 000 U/mL interleukine (IL) -2 dans un milieu RPMI1640 avec 10 % FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, pyruvate de sodium 1 mM, 5 % de bicarbonate de sodium 7,5 % de la culture solution et 0,001 % de β-mercaptoéthanol (RPMI1640 milieu complet).
  3. Changer le milieu de ces flacons au jour 4 de cette culture pour éliminer les non adhérents T et des cellules NKT ; les cellules qui restent collés à ces flacons sont en grande partie les cellules NK. Ajouter 20 mL de milieu complet frais de RPMI1640 et 1 000 U/mL IL-2 pour reconstituer les fioles.
  4. Vérifier la pureté des cultures de cellules NK murines jour 7 par cytométrie de flux avec des marqueurs spécifiques des cellules NK20 utilisant des préparations contenant plus de 95 % du CD3 population NK1.1+ –.

4. purification et l’expansion des cellules primaires humaines de NK

  1. Isoler les PBMC par gradient de densité de buffy manteaux de volontaires sains. Brièvement, soigneusement la couche 35 mL de cellules dilué de moitié (avec HBSS) plus de 15 mL de gradient de densité dans un tube de 50 mL canonique. Centrifuger à 400 × g pendant 30 min à 20 ° C dans un rotor oscillant de seau sans frein.
  2. Les kits commerciaux sélection négative à base d’anticorps permet de purifier les cellules NK primaires humaines selon le protocole du fabricant.
  3. Suite à l’isolement, déterminer la pureté des préparations de cellules NK par les analyses de l’immunofluorescence. Tache de préparations de cellules NK avec 2 µg/mL anti-CD3 et des anticorps anti-CD56 µg/mL 2 à 4 ° C pendant 20 min. laver les cellules deux fois avec les populations de cellules NK de PBS, déterminées par l’absence de CD3 et la présence de CD56 sur la surface de la cellule.
  4. Incuber les préparations de cellules avec des anticorps pendant 20 min à 4 ° C, laver avec du PBS et d’analyser dans un cytomètre en flux. Utiliser des préparations de cellules NK avec plus de 85 % des analyses de pureté pour la transduction du gène20.

5. transduction des murins et humains primaires cellules NK avec lentivirus

  1. Suspendre la souris ou cellules humaines primaires de NK dans une plaque 24 puits à 0,5 × 105/ml de milieu en présence de lentivirus GFP surnageante à 5, 10 et 20 multiplicité d’infection (MOI) et en présence de Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL) ou dextran (8 µg/mL).
  2. Centrifuger les plaques à 1 000 × g pendant 60 min.
  3. Sans décantation le surnageant, de la culture des cellules pendant la nuit (16-18 h) dans un incubateur à 37 ° C infusé avec 5,2 % CO2.
  4. Laver avec 10 mL de PBS et remettre en suspension dans 2 mL de milieu de culture complet RPMI1640 en présence de IL-2 (300 U/mL).
  5. Tester l’humain et de souris primaire cytotoxicité à médiation cellulaire NK contre K562 et YAC-1, respectivement en réalisant 51chrome (Cr)-tests de libération à varient rapports effecteur-à-cible-cellule22.
    1. En bref, donner 1 million µCi 50 cellules de cible du chromate de sodium radioactif 51Cr. Pendant la période d’incubation de 4 h, ils l’absorption la 51Cr dans les protéines cellulaires. À la fin de l’incubation, laver les cellules pour enlever toutes les étiquettes individuelles.
    2. Calculer la lyse des cellules tumorales spécifique par la quantité de libération absolue, spontanée et expérimentale de 51Cr par les cellules de cible.
      NOTE : Le calcul du pourcentage de lyse spécifique d’expériences de pentaplicate a été fait à l’aide de l’équation suivante : lyse spécifique % = ((51Cr signifie la dissémination expérimentale - libération spontanée moyenne de 51Cr) / (51Cr signifie sortie maximale - 51Cr signifie libération spontanée)) x 100, où «51libération spontanée moyenne Cr » est le 51Cr libéré par les cellules de cible en l’absence des cellules NK et «51libération maximale moyenne Cr » est le 51Cr libérés par les cellules de cible à la lyse par 2 N d’acide chlorhydrique (HCl).
  6. Récolter les cellules NK transduits jour 7 en tapotant les fioles.
    1. Activer les cellules récoltées avec des concentrations titrées de plaque lié aux anti-NKG2D (A10) mAb en enduisant de 96 puits, protéine hautement absorbants des plaques en polystyrène avec 2,5 concentrations µg/mL anti-NKG2D mAb du jour au lendemain.
    2. Laver chaque bien avec 100 µL de PBS trois fois avant l’ajout de cellules NK primaires.
  7. Recueillir les surnageants de culture à l’aide d’une pipette multi-canaux entre 16 et 18 h après activation de quantifier des cytokines telles que l’IFN-γ. Générer des courbes standard utilisant les cytokines recombinantes fournies avec les kits d’enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  8. Tester la viabilité de cellules NK utilisant annexine-V/7-amino-l’actinomycine D (7-AAD) coloration23 et déterminer le pourcentage de cellules nécrotiques parmi les cellules NK transformées à l’aide d’un cytomètre en flux.
    1. Pour effectuer ce test, récolte le murin et humain NK cellules quatre jours après la transduction, laver deux fois avec 10 mL de PBS froid à 500 × g pendant 5 min chacun et incuber avec une annexine-V (PE) / kit 7-AAD.
  9. Logiciel de cytométrie en flux approprié permet d’analyser les données. Sélectionnez la population de cellules vivantes et d’analyser l’expression de la GFP (canal FITC) en guise de transduction virale24.

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Representative Results

Dextran induit le transfert génique efficace de vecteur lentiviral dans les cellules primaires humaines et murines NK

Cellules NK humaines ont été isolés et purifiés de PBMC (avec une pureté de plus de 85 %) et incubés pendant la nuit avec rIL-2 300 U/mL. Ces cellules NK primaires ont été ensuite transduites avec lentivirus GFP à varié multiplicités d’infection (MOI ; 3, 10 et 20 UI par cellule) en plaques 24 puits en présence de 8 Pb µg/mL, PS ou dextran. Les cellules ont été centrifugés à 1 000 × g pendant 60 min et cultivées (en présence de virus) une nuit à 37 ° C dans un incubateur à CO2 . Les cellules ont été lavées et remis en suspension dans un milieu frais RPMI1640 complet avec rIL-2 300 U/mL pendant sept jours. L’efficacité de la transduction a été évaluée par cytométrie de flux pour l’expression de la GFP, sept jours après la transduction. Les résultats montrent que dextrane augmente l’efficacité de la transduction des gènes dans les cellules humaines de NK et augmente le titre viral, ce qui peut aussi améliorer le pourcentage de cellules NK transduits (Figure 1).

Des cellules NK ont été isolées et cultivées comme décrit dans la section précédente. Le protocole ci-dessus a été utilisé pour analyser et comparer l’efficacité de la transduction du Pb, Ps et dextran. Dans la Figure 2 , les résultats montrent que dextran peut augmenter l’efficacité des vecteurs LENTIVIRAUX par rapport au Pb ou PS

Transduction des cellules NK avec dextran n’affecte pas leur capacité de provoquer des fonctions effectrices

La capacité cytotoxique des cellules NK transduits humaines et murines a été examinée par des essais de 51Cr libération contre K562 et YAC-1 comme les cellules cibles. Les résultats présentés dans les figures 3 a et b révèlent que la transduction des cellules NK de dextran ne modifie pas négativement le potentiel de tuer des cellules NK transformées par rapport aux non-transduites les cellules NK. En outre, la production de cytokines des cellules NK primaires transduits a été analysée. Génération d’IFN-γ a été mesurée en utilisant une technique ELISA. Transduite des cellules NK humaines primaires ont été conjointement cultivés avec K562 pendant 24 h, et le surnageant ont été recueillis à mesure IFN-γ. Résultats présentés dans la Figure 4 a révèlent que dextran n’a aucune incidence sur la capacité des cellules NK transduits à produire des cytokines. Comme une validation indépendante, les cellules NK transduits ont été activés avec concentrations titrées de mAb plaque lié aux anti-NKG2D (A10) car les surnageants de Culture de 18 h. ont été prélevés, et génération d’IFN-γ a été mesurée par ELISA. Résultats présentés dans la Figure 4 b révèlent que la transduction des cellules NK murins avec dextran n’a aucun effet sur leur capacité à produire des cytokines.

Transduction des cellules NK avec dextran n’affecte pas leur viabilité cellulaire

L’influence de dextran, PS ou Pb sur la viabilité des cellules NK transduits a été évaluée à l’aide d’un test (PI) de l’iodure de propidium et analyses des flux ultérieurs. Dans la Figure 5 a et b , les résultats démontrent que, bien que la transduction de l’homme primaire et des cellules NK souris avec virus peut induire une nécrose dans environ 20 % des cellules NK, l’ajout de dextran augmenter pas cette nécrose par rapport au Pb ou PS

Les analyses statistiques ont été réalisées avec un à deux points non apparié t-test de Student. P -valeurs ≤ 0,05 étaient considérés comme importants.

Figure 1
Figure 1 : Dextrane a une plus grande efficacité de la transduction des cellules primaires humaines de NK.
Les cellules NK humaines primaires ont été transformées avec MOI de 3, 10 ou 20 IU/cellule et ont été cultivées pendant sept jours en présence de Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL), ou dextran (8 µg/mL). Pourcentages de cellules NK GFP-positives ont été déterminées par cytométrie en flux jour sept après la transduction. Un des trois expériences indépendantes est indiqué. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Dextrane a une plus grande efficacité de la transduction dans des cellules NK.
Des cellules NK murines primaires ont été transformées avec un MOI de 30 IU/cellule et ont été cultivées pendant sept jours en présence de Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL), ou dextran (8 µg/mL). Pourcentages de cellules exprimant le GFP ont été déterminées par cytométrie à sept jours qui suivent la transduction. Un des trois expériences indépendantes est indiqué. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Dextran ne modifie pas l’activité cytotoxique médiée par les cellules NK de cellules transformées.
Les cellules NK primaires ont été transformées avec un MOI de 10 IU/cellule et ont été cultivées pendant sept jours. YAC-1 et K562 servaient de cellules cibles pour déterminer le potentiel cytotoxique des murins (a) et humains des cellules NK (b), respectivement. Les données présentées sont des représentants des deux expériences indépendantes. Les chiffres indiqués sont des moyennes avec SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Dextran ne modifie pas la production d’IFN-γ de cellules NK primaires.
un) des cellules NK sont transduites avec un MOI de 30 UI/cellulaire et cultivées pendant sept jours. Les cellules NK sont stimulées avec 2,5 µg/mL d’anticorps lié aux plaque anti-NKG2D pendant 18 h, et IFN-γ a été quantifié dans les surnageants de culture à l’aide d’une technique ELISA. b) transduits cellules NK humaines ont été cultivées avec les cellules K562 pendant 24 h, et la production d’IFN-γ a été mesurée dans les surnageants de culture. Les données présentées sont représentatifs des trois expériences indépendantes. Les chiffres indiqués sont des moyennes avec SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Transduction des cellules NK avec dextran ne modifie pas la viabilité de leurs cellules.
La viabilité de l’homme transformé (a) et des cellules NK (b) de souris a été quantifiée après coloration pour l’annexine-V (PE) / cellules positives 7-AAD. Les chiffres indiqués sont des moyennes avec SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Cette étude démontre que l’utilisation de dextran, un agent de polymère cationique améliore l’efficacité de la transduction des gènes des cellules NK primaires murins et humains. En outre, autres agents cationiques, comme Pb ou PS, n’ont aucun effet perceptible sur la prestation des vecteurs viraux dans les cellules primaires humaines de NK. Auparavant, il a été démontré que le Pb peut augmenter transduction du gène humain de cellules T17. Ces résultats, cependant, suggèrent que ni Pb ni PS ont une efficacité similaire sur les cellules primaires humaines de NK. Dans cette étude, Pb a amélioré l’efficacité de la transduction seulement modestement dans des cellules NK. Il a été démontré que l’inhibition des mécanismes de défense antivirales intracellulaires à l’aide de BX795, un inhibiteur de TBK1/IKKɛ et PS comme un exhausteur de peut augmenter l' efficacité de transduction LENTIVIRAUX25. Néanmoins, les résultats ont montré que cet inhibiteur n’a aucun effet sur l’efficacité de la transduction dans murines ou humaines primaire les cellules NK (données non présentées).

Les résultats démontrent que dextran peut induire la transduction efficace des humains primaires et des cellules NK de souris, alors que le PS et le Pb n’ont aucun effet. Les résultats montrent également que dextran n’altère pas les fonctions effectrices des cellules NK, comme antitumorale cytotoxicité et la production de cytokines pro-inflammatoires. Ainsi, ces résultats prouvent que la viabilité de ces cellules NK primaires n’est pas altérée par l’usage du dextran.

Plusieurs études analysé et comparativement l’efficacité de la transduction des vecteurs rétroviraux à l’aide de différents polymères cationiques, avec des résultats variés26,27,28. Une étude antérieure a comparé l’efficacité de la transduction de ces polymères à l’aide de vecteurs LENTIVIRAUX ; Cependant, ceci a été testé dans CD4 des cellules de+ T16. Dans l’une de ces études, il a été démontré que Pb a une meilleure capacité de transduction sur des cellules transformées de B et les cellules dendritiques comparés au dextran26. Dans une autre étude, il a été démontré que le dextran facilite une plus grande efficacité de transduction qu’autres exhausteurs dans les cellules B humaines et cellules T16. La présente étude est la première du genre, à notre connaissance, qui a analysé et comparé les capacités de transduction des différents polymères dans les cellules NK primaires humaines et murines.

Transductions génique à base dextran peuvent exiger un minimum de deux séries de transductions. Ces résultats montrent qu’un seul tour de transduction est suffisant pour atteindre jusqu'à 40 % de cellules transduits positivement, ce qui est augmenté à 100 % à la suite deux rondes de transduction (données non présentées). Un des défis majeurs dans la transduction des cellules NK est la capacité de ces cellules à préserver l’expression du gène transduite. Les résultats démontrent que la transduction des cellules NK primaires avec dextran est stable et que les cellules NK qui sont cultivées en présence de IL-2 peuvent retenir le vecteur et maintenir l’expression du transgène pendant quatre semaines (données non présentées). Des expériences additionnelles sont nécessaires pour analyser l’efficacité de la transduction et d’examiner l’expression simultanée de plusieurs transgènes.

L’efficacité clinique des thérapies contre le cancer sur les cellules immunitaires est en cours de validation par plusieurs établissements. Cellules de T voiture-transduites prévoient promesse renouvelée le recouvrement exempts de maladies et de rechute des patients atteints de cancer par rapport aux traitements conventionnels. Dans le cadre des réponses immunitaires innées, les cellules NK ne nécessitent pas de sensibilisation préalable d’arbitrer leurs fonctions effectrices, y compris la cytotoxicité anti-tumorale. En raison de leur intervention rapide, les cellules NK sont un sous-ensemble de lymphocytes effecteurs idéal d’arbitrer une immunothérapie efficace axée sur les cellules du cancer. Malgré leur caractère positifs dans la reconnaissance de la tumeur et l’élimination, les obstacles techniques au sujet de la manipulation génétique pour livrer des transgènes limitent la toute utilisation clinique des cellules NK.

Électroporation des ARNm de l’expression génétique exogène est très efficace et a de meilleurs résultats. Cependant, utilitaire d’ARNm est limitée, car ils permettent seulement l’expression transitoire de gènes d’intérêt et ainsi, ne sont pas adaptés pour des applications cliniques. La transduction rétrovirale des cellules NK est moins efficace car elle nécessite plusieurs cycles de transduction ; en outre, vecteurs rétroviraux ne transduce en non de division de cellules. La seule approche prometteuse pour la livraison de transgene stable est l’utilisation de vecteurs LENTIVIRAUX.

Au total, cette étude fournit une méthode efficace pour livrer des transgènes dans des cellules NK primaires, sans nuire à leurs fonctions effectrices. Ce protocole rend immunothérapie des cancers basés sur les cellules NK, hautement efficace et applicable aux nouveaux essais cliniques. Expériences futures sont nécessaires pour valider l’efficacité de cette méthode dans les immunothérapies du cancer à base de cellules NK.

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Disclosures

Les auteurs font ne valoir aucun conflit d’intérêts financiers.

Acknowledgments

Nous remercions Lucia Sammarco et Lemonade Stand de sa Lulu pour l’inspiration, de motivation et de soutien. Ce travail a été soutenu en partie par NIH R01 AI102893 et NCI R01 CA179363 (S.M.) ; NHLBI-HL087951 (S.R.) ; NIH-CA151893-K08 (M.J.R.) ; NCI 1R01CA164225 (L.W) ; l’Alex Lemonade Stand Fondation (S.M.) ; le programme MDHR du fonds MACC (S.M. ; S.R. ; MAGNIN) ; la Fondation de la famille de Nicholas (S.M.) ; la famille Gardetto (S.M.) ; les chercheurs de Hyundai de programme (M.S.T.) ; Espoir de Hyundai sur roues (S.R.) ; la caisse de la Scam (M.S.T. et S.M.) ; Institut de recherche de l’HME, MCW (S.R.) ; et le prix de Kathy Duffey Fogerty (M.J.R.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran Sigma-Aldrich 90-64-91-9
polybrene (Pb) Sigma-Aldrich TR-1003
protamine sulfate (PS) Sigma-Aldrich p3369
Trypsin Corning 25-052-CI
RPMI1640 Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum ATALANTA S11150
Penicillin Corning 30-001-CI
B-mercaptoethanol SIGMA M3148
sodium pyruvate Corning MT25000CI
Interferon gamma (IFN-γ ) eBioscience 14-7311-85
Propidium lodding staining solution BD 51-66211E
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher L3000015
Isoflurane PHOENIX NDC 57319-559-05
NK cell negative selection kit Stem Cell 19855
Yac-1 ATCC TIB-160
K562 ATCC CCL-243
Mice Jakson 664
293T cells ATCC CRL-3216
T75 flasks Cornnig 430641U
antibody-based negative selection kits Stem Cell 19055
51Chromium (Cr)-release assays perkin elmer's NEZ030
ELISA kits Ebioscience 00-4201-56
Sodium Butyrate Sigma 5887-5G
Linear polyethylenimine polysciences 23966-2
Ficoll GE Life Science 17-1440-03
HBSS Corning 21-022-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
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Numéro 131 Transduction cellules NK primaires dextran immunologie lentivirus génétiquement modifiés immunothérapie
Dextrane augmente l’efficacité de la Transduction des gènes des cellules NK primaires murines et humaines
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Nanbakhsh, A., Best, B., Riese, M.,… More

Nanbakhsh, A., Best, B., Riese, M., Rao, S., Wang, L., Medin, J., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells. J. Vis. Exp. (131), e55063, doi:10.3791/55063 (2018).

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