Summary
מטרת מחקר זה הייתה לגבש טכנולוגיות המאפשרות התמרה חושית מוצלחת גנים בתאים ראשי טבעי רוצח (NK). בתיווך לתוספי התמרה חושית lentiviral של האדם או העכבר הראשי NK תאים תוצאות יעילות גבוהה יותר של ביטוי ג'ין. שיטה זו של ג'ין התמרה חושית ישפר במידה רבה מניפולציה גנטית של תאי NK.
Abstract
התמרה חושית יעילה של גנים ספציפיים לתאי (NK) רוצח טבעי היה אתגר גדול. Transductions מוצלחת הם קריטיים באשר להגדרת תפקידו של הגן עניין בפיתוח, בידול, התפקוד של תאי NK. התפתחויות אחרונות הקשורות חיסוני סרטן אנטיגן chimeric רצפטורים (מכוניות) להדגיש את הצורך שיטה יעילה לספק גנים אקסוגני לימפוציטים. היעילות של transductions lentiviral בתיווך גנים לתוך האדם העיקרי או תאי NK בעכבר להישאר נמוך באופן משמעותי, וזה גורם מגביל הגדולות. התפתחויות אחרונות באמצעות פולימרים cationic, כגון polybrene, מראים יעילות התמרה חושית משופרת גנים בתאי T. עם זאת, מוצרים אלה נכשל לשפר את היעילות התמרה חושית של תאי NK. זה מצביעה לתוספי הזה, רב-סוכר קנים גלוקן, משפר באופן משמעותי את יעילות התמרה חושית של האדם ואת העכבר הראשי תאי NK. מתודולוגיה זו התמרה חושית מאוד לשחזור מספק כלי מוכשר transducing האנושי תאי NK העיקרי, אשר יכול מאוד לשפר את ג'ין קליניים מסירה יישומים ובכך חיסוני סרטן המבוסס על תאי NK.
Introduction
תאים (NK) רוצח טבעי הם האוכלוסייה לימפוציטית העיקריים של מערכת החיסון המולדת1. תאי NK לפעול המגינים השורה הראשונה של התגובה החיסונית מארח נגד גידולים ודלקות2,3,4. תאי NK גם לשחק תפקיד מרכזי בהתפתחות של סובלנות דרך ההפרשה של ציטוקינים חזק ונוגדנים5. בשל היכולת שלהם חזק כדי למקד לחסל תאים סרטניים, מתנהלים ניסויים קליניים מרובים כדי להעריך נגזר תורם תאי NK אדם כמו חיסוני המאמצת עבור סרטן6,7. בניגוד תאי T, ביולוגיה התפתחותית תאי NK טרם להיות מאופיין היטב8. חוסר ידע היא חלקית בשל העדר של טכניקות יעיל לספק הגנים של עניין מהעכבר או תאי NK ראשי אדם. מסיבות אלה, רוב תאי NK מחקרים נערכו שורות תאים, ולא בתאים הראשי. לכן, הצורך פרוטוקול אמין ויעיל מגלי תאי NK ראשי עם הגנים של עניין חיוני.
המטרה הכוללת של מחקר זה היה לגבש שיטה עקבית ומהימנה שבו תאי NK אנושית או מאתר ראשי יכול להיות transduced עם lenti - או רטרווירוסים.
מחקרים מוקדמים יותר לניסיון כדי לטפל בבעיה זו בוצעו, בעיקר באמצעות הטרנספורמציה ארעית של תאי NK העיקרי. זה כולל פלסמיד תרביות תאים9,10, וירוס אפשטיין בר (EBV) / היברידית retroviral וקטור11, vaccinia המומנט12,13, ו Ad5/F35 וקטורים adenoviral chimeric14. למרות היעילות צנוע של טכניקות אלה, הארעיות התמרה חושית גורם להם מתאים ניצול לטווח ארוך של תאי NK מהונדסים. מספר מחקרים שנערכו לאחרונה השתמשו וקטורים retroviral כדי מגלי תאי NK, הדורשות מספר מחזורים של זיהום להשגת רמת גן ביטוי11,15. בניגוד retroviral וקטורים, וקטורים lentiviral ניתן להשתמש מכונות ייבוא גרעיני התא המארח כדי translocate המתחם אינטגרציה קדם נגיפי לתוך הגרעין. זה גורם מרכזי הגבלת השכפול של הנגיף ללא חלוקת תאים, אשר כוללים תאי NK העיקרי.
אינטראקציות בין חלקיקים נגיפיים שונים התא קולטנים היתר ספיגת ויראלי לתוך התא. למשימות הראשונית בין החלבונים מעטפת נגיפית קולטנים cognate המארח שלהם יכולה להיות מוגבלת האישומים שלילית פוטנציאלית הקיימת בין השניים. הרציונל מאחורי טכניקות התמרה חושית רבים נמצא כי התוספת של פולימרים cationic, כגון polybrene (Pb), מה לעזאזל קרה סולפט (PS) או לתוספי, יכול לתת התא קולטנים מטען חיובי, ובכך להגדיל את הכריכה של מעטפת נגיפית חלבונים. זה יהיה להגדיל את היעילות פיוז'ן, תפיסה של חלקיקי נגיפי על ידי תאי ה-16. למרות דווח כי חמאת בוטנים או PS יכולים לשפר העברה גנטית בתאי T17, היישום שלהם לא היה כל השפעה יעילות התמרה חושית של תאי NK העיקרי. יתר על כן, ניתוח השוואתי בין אלה ריאגנטים באמצעות תאי NK הראשי לא בוצעה. במחקר זה, היעילות התמרה חושית פולימרים cationic שלושה הושוו. התוצאות מציגות, בין פולימרים cationic, שלושה אלה רק לתוספי מחזק באופן ניכר את התמרה חושית ויראלי יעיל לתוך גם העכבר וגם תאי NK ראשי אדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים בעלי חיים עקב הטיפול הומאני ומוסרי של בעלי חיים, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) בתוך ביו מחקר מרכז (BRC) של הרפואי של ויסקונסין (MCW), מילווקי, אינטרנט אלחוטי. השימוש של תאי תאי דם היקפיים אנושי (PBMCs) אושרה על-ידי המוסדיים סקירה לוח (IRB) של מכון המחקר דם של מרכז דם של ויסקונסין, מילווקי, אינטרנט אלחוטי.
1. עכברים, שורות תאים ווקטורים
- להשיג C57BL/6 עכברים של ספקים מסחריים. לשמור על המושבות העכבר בתנאים ללא הפתוגן ולהשתמש עכברים הנקביים והזכריים בין הגילאים 6 עד 12 שבועות. להשיג בטל מזוהה PBMCs האנושי ממקורות שאושרו על-ידי IRB.
- עזים ומתנגד החיות בתערובת של 20-30% איזופלוריין וי/v בפרופילן גליקול (1, 2-propanediol, כיתה USP) כדי עזים ומתנגד העכברים. החל הוטרינר משחה לעיניים למניעת יובש ואילו העכברים הם תחת הרדמה.
- להרדים את החיות, לבצע פריקה צוואר הרחם לאחר תנאי הגיוס של הרדמה.
- לרסן את העכברים מאת אוחז בחוזקה בבסיס הזנב עם יד אחת. הצב עט מקל חסון-סוג או את האגודל והאצבע הראשון של היד השנייה נגד האחורי של הצוואר, בבסיס הגולגולת.
- כדי לייצר את פריקה, לדחוף את היד הרחקה ראש החיה קדימה ויש לדחוף למטה תוך משיכת לאחור עם היד אוחזת בזנב הבסיס. לאמת את האפקטיביות של פריקה על ידי רגש כלפי הפרדה של רקמות צוואר הרחם.
- להרחיק את החיות הקאמרית/כלוב לפחות 5 דקות ולהסיר אותם רק כאשר פעילות הנשימה נעדר או כאשר יש חוסר דופק לזיהוי.
- לקבל K562 ותאי YAC-1 של ספקים מסחריים ולשמור אותם ב RPMI1640 בינוני המכיל 10% חום-לא פעיל FBS. מבחן שורות תאים אלו מעת לעת כדי לא לכלול את האפשרות לזיהום mycoplasma.
2. והכנה טיטור של וקטורים lentiviral
- תרבות 5 × 106 293T תאים לינה בקבוקון2 ס מ T75 המכיל פתרון של 20 מ של RPMI1640 בינוני עם 10% FBS, פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg/mL 100, 1 מ מ נתרן פירובט, 5% של 7.5% סודיום ביקרבונט פתרון ו- 0.001% Β-mercaptoethanol. מקם את הבקבוקון חממה 37 ° C עם 5.2% CO2.
- לקצור את התאים 293T באמצעות טריפסין (0.025%)/EDTA (1 מ מ) בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS). הוסף 5 מ של טריפסין/EDTA ב- PBS, דגירה המבחנות 10 דקות ב 37 ° C אינקובטור כדי לאפשר התנתקות של תאים 293T T75 המבחנות2 ס מ.
- לאסוף את התאים מנותקת ולשטוף אותם פעמיים ב- PBS להסיר את עקבות של טריפסין, EDTA. לספור את התאים עם hemocytometer ולהתאים את המספר של התא מיליון תאים לכל mL.
- Transfect תאים 293T18 עם 3.95 µg של psPAX2, ב- 1.32 µg של pMD2G µg 5.26 של pLEP-GFP-פורו (נוצר בחברה ב BRI על-ידי שיבוט יזם EF1alpha מ- pWPI במקום מקדם CMV ב pLenti CMV-GFP-Puro)19.
- להכין 1 מ"ל של 150 מ מ NaCl פלוס µL 63 של 0.6 מ"ג/מ"ל polyethylenimine (פיי; 25,000 kD, לינארית). מערבבים היטב, ואז מוסיפים את פלסמידים ומערבבים. תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להוסיף זה לתאים.
- 16 h שלאחר תרביות תאים, החלף המדיום תרביות תאים עם טרי בינוני פלוס 4.5 מ מ נתרן butyrate. לקצור את תגובת שיקוע המכיל וירוס 48 שעות שלאחר תרביות תאים, להתרכז על ידי צנטריפוגה לילה ב 5,000 × g. עיין בטבלה חומרים.
- לקבוע את titers ויראלי באמצעות תאים 293T על-ידי ביצוע דילולים טורי ואת וזמינותו לזרום cytometry 72 h התמרה חושית שלאחר20. השתמש בביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כאמצעי לכמת את titers ויראלי.
3. הרחבת תאי NK העיקרי מאתר וטיהור
- לטהר מאתר ראשי NK תאים21. בקצרה, עוברים מתא בודד הטחול המתלים באמצעות ניילון עמודות צמר כדי לרוקן את אוכלוסיות חסיד המורכב תאים B ו מקרופאגים.
- תרבות האוכלוסיות שאינם מחסידי eluted ניילון צמר עמודה המכילה תאי NK מאתר עם אינטרלוקין U/mL 1,000 (IL)-2 RPMI1640 בינוני עם 10% FBS, פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg/mL 100, 1 מ מ נתרן פירובט, 5% של 7.5% סודיום ביקרבונט הפתרון, 0.001% β-mercaptoethanol (בינוני מלא RPMI1640).
- לשנות את המדיום מן המבחנות ביום 4 של תרבות זו להסיר את הלא-חסיד T ואת NKT תאים; תאים אשר נותרו מודבקת על המבחנות הם בעיקר תאי NK. הוסף 20 מ של טרי RPMI1640 מלאה בינונית, 1,000 U/mL il-2 לחדש המבחנות.
- לבדוק את הטוהר של התרבויות התא NK מאתר ביום 7 עד cytometry זרימה עם סמנים ייחודיים תא NK20 באמצעות תכשירים עם יותר מ- 95% של CD3–NK1.1+ האוכלוסיה.
4. טיהור והרחבה של תאי NK ראשי אדם
- לבודד PBMCs על ידי צפיפות הדרגתי של מעילים באפי של מתנדבים בני אדם בריאים. בקצרה, בזהירות שכבה 35 מ של תאים חצי-מדולל (עם HBSS) מעל 15 מ"ל של דחיסות צבע בשפופרת הקנוני 50-mL. צנטריפוגה ב g × 400 למשך 30 דקות ב- 20 ° C ברוטור דלי מתנדנדים ללא בלם.
- השתמש את ערכות הבחירה שלילי נוגדן מבוססי מסחרי לטהר את תאי NK ראשי אדם על פי הפרוטוקול של היצרן.
- בעקבות הבידוד, לקבוע את הטוהר של ההכנות התא NK על ידי ניתוחים immunofluorescence. כתם ההכנות התא NK עם 2 µg/mL אנטי CD3 ו- 2 µg/mL נוגדנים anti-CD56 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לשטוף את התאים פעמיים עם אוכלוסיות התא PBS NK נקבע על ידי העדר של CD3 ואת נוכחותם של CD56 על פני התא.
- דגירה ההכנות תא עם נוגדנים במשך 20 דקות ב 4 ° C, לשטוף עם PBS, לנתח ב- cytometer זרימה. השתמש ההכנות התא NK עם יותר מ-85% טוהר עבור התמרה חושית ג'ין מבחני20.
5. התמרה חושית של מאתר אנושי ראשוני NK ותאי עם lentivirus
- להשעות את העכבר או תאי NK ראשי אדם לתוך צלחת 24-ובכן-0.5 × 105/mL של מדיום בנוכחות GFP lentivirus supernatant-5, 10 ו- 20 הריבוי של זיהום (MOI) ובפני Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL) או לתוספי (8 µg/mL).
- Centrifuge הלוחות ב g × 1000 עבור 60 דקות.
- בלי decanting את תגובת שיקוע, התרבות התאים בין לילה (16-18 h) חממה 37 ° C עם 5.2% CO2-
- לשטוף עם 10 מ"ל של PBS ו resuspend ב 2 מ"ל של מדיום תרבות RPMI1640 מלא בנוכחות il-2 (300 U/mL).
- מבחן האדם ואת העכבר הראשי NK תאית cytotoxicity נגד K562, YAC-1, בהתאמה על-ידי ביצוע 51כרום (Cr)-שחרור מבחני-מגוונות אפקטור-כדי--תא היעד יחסי22.
- בקצרה, לתת מיליון היעד תאים 50 µCi של נתרן radiolabeled כרומט 51Cr. במהלך זמן הדגירה 4-h, הם ספיגת 51Cr לתוך החלבונים. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים כדי להסיר כל תווית לא מעובדות.
- לחשב גידול ספציפי תא פירוק לפי כמות שחרור מוחלט, ספונטנית, ניסיוני של 51Cr תאי היעד.
הערה: החישוב של אחוז מסוים פירוק של ניסויים pentaplicate נעשה באמצעות המשוואה הבאה: פירוק ספציפית % = ((51Cr אומר מהדורה ניסויית - 51Cr לשחרור ספונטני מרושע) / (51Cr אומר שחרור מקסימלי - 51Cr אומר לשחרור ספונטני)) х 100, כאשר "51Cr לשחרור ספונטני מרושע" הוא 51Cr שוחרר מן התאים היעד בהיעדרו של תאי NK ו- "51Cr שחרור מקסימלי רעה" היא 51Cr שוחרר מן התאים היעד בעת פירוק על ידי 2 N חומצת מימן כלורי (HCl).
- לקצור תאי NK transduced ביום 7 על-ידי בעדינות הקשה המבחנות.
- להפעיל את התאים שנקטפו עם ריכוזים, טיטרציה של mAb מאוגד-צלחת אנטי-NKG2D (A10) על ידי ציפוי לוחות פוליסטירן 96-ובכן, מאוד חלבון-כושר ספיגה עם µg/mL 2.5, ריכוזי mAb אנטי-NKG2D בן לילה.
- לשטוף כל טוב עם µL 100 ל- PBS שלוש פעמים לפני התוספת של תאי NK העיקרי.
- לאסוף את התרבות supernatants באמצעות פיפטה רב ערוצית של בין 16 ו 18 h אחר-הפעלה לכמת ציטוקינים כגון IFN-γ. ליצור עקומות רגיל באמצעות של ציטוקינים רקומביננטי סיפק מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) ערכות.
- לבחון את הכדאיות התא NK באמצעות annexin-V/7-אמינו-ואקטינומיצין D (7-מ) צביעת23 ולקבוע את האחוזים של תאים עם נמק בין תאי NK טרנספורמציה באמצעות cytometer של זרימה.
- לביצוע הזה assay, קציר תאי NK מאתר והאנושי ארבעה ימים לאחר התמרה חושית, לשטוף פעמיים עם 10 מ"ל של PBS קר ב 500 g × למשך 5 דקות ולאחר דגירה עם Annexin-V (PE) / ערכת 7-מ.
- להשתמש בתוכנה cytometry זרימה המתאים כדי לנתח את הנתונים. בחר את האוכלוסייה לחיות תאים ולנתח את הביטוי של GFP (ערוץ FITC) כאמצעי של התמרה חושית ויראלי24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לתוספי המניע את העברה גנטית יעיל של וקטור lentiviral תאי NK העיקרי של מאתר ואנושי
תאי NK אדם היו מבודדים מטוהרת מכל PBMC (עם טוהר של יותר מ-85%), מודגרות בין לילה עם rIL-2 300 U/mL. אלה בתאי NK העיקרי היו אז transduced עם lentivirus GFP-multiplicities מגוונת של זיהום (MOI; 3, 10, ו- 20 לכל תא IU) ב- 24-ובכן צלחות בנוכחות 8 µg/mL Pb, PS או לתוספי. תאים centrifuged-1000 g × עבור 60 דקות, תרבותי (בנוכחות וירוס) בן לילה ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO. התאים היו נשטפים, resuspended RPMI1640 טרי שלם בינוני עם rIL-2 300 U/mL עבור שבעה ימים. התמרה חושית יעילות הוערך על ידי cytometry זרימה לביטוי GFP שבעה ימים לאחר התמרה חושית. התוצאות מראות לתוספי הזה משפר את היעילות של התמרה חושית lentiviral בתאי NK אדם ומגביר את כייל ויראלי, אשר יכול גם לשפר את אחוז תאי NK transduced (איור 1).
תאי NK מאתר היו מבודדים, תרבותי כפי שתואר בסעיף הקודם. הפרוטוקול הנ ל שימש כדי לנתח ולהשוות את היעילות התמרה חושית של חמאת בוטנים, Ps, לתוספי. תוצאות באיור 2 מראות לתוספי הזה יכול להגדיל את היעילות של וקטורים lentiviral בהשוואה חמאת בוטנים או PS.
התמרה חושית של תאי NK עם לתוספי אינו משפיע על היכולת שלהם לתווך אפקטור פונקציות
הקיבולת ציטוטוקסיות של תאי NK transduced של האדם ושל מאתר נבדק על ידי מבחני 51Cr-שחרור נגד K562, YAC-1 כמו תאי היעד. התוצאות שהוצגו איור 3a ו- b חושפים כי התמרה חושית של תאי NK מאת לתוספי לא שלילית לשנות את הפוטנציאל הרג תאי NK טרנספורמציה בהשוואה לתאי NK-transduced. בנוסף, ייצור ציטוקינים מתאי NK transduced העיקרי היה ניתח. IFN-γ דור נמדדה באמצעות של אליסה. Transduced תאי NK אדם העיקרי היו בתרבית במשותף עם K562 במשך 24 שעות ביממה, supernatants נאספו מודדים IFN-γ. תוצאות המוצגים באיור 4a לחשוף שאת לתוספי שאין לה השפעה על היכולת של תאי NK transduced לייצר ציטוקינים. כמו אימות עצמאית, תאי NK transduced הופעלו עם ריכוזים, טיטרציה של צלחת מכורך אנטי-NKG2D (A10) mAb עבור ה 18 תרבות supernatants נאספו, IFN-γ דור נמדדה על ידי אליסה. תוצאות שמוצג באיור 4b לחשוף התמרה חושית תאי NK מאתר עם לתוספי שיש אין השפעה על היכולת שלהם לייצר ציטוקינים.
התמרה חושית של תאי NK עם לתוספי אינה משפיעה על הנביטה התאים שלהם
השפעת Pb, PS או לתוספי על הכדאיות של תאי NK transduced הוערך שימוש assay יודיד (PI) propidium וניתוחים זרימה עוקבות. תוצאות ב איור 5a ו- b להדגים כי, למרות transducing האדם העיקרי ותאי NK בעכבר עם וירוסים יכול לגרום לנמק כ-20% תאי NK, התוספת של לתוספי לא להגדיל זה נמק בהשוואה ל- Pb או PS.
ניתוחים סטטיסטיים בוצעו עם מבחן t-זנבית אינטראקצית של התלמיד. P -≤ ערכים 0.05 נחשבו משמעותית.
איור 1: לתוספי יש על יעילות גבוהה יותר של התמרה חושית של תאי NK ראשי אדם.
תאי NK אדם ראשי נהפכו עם MOI של IU/תא 3, 10 או 20, היו בתרבית במשך שבעה ימים בנוכחות Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL), או לתוספי (8 µg/mL). האחוזים של תאי NK GFP-חיוביות נקבעו על ידי cytometry זרימה ביום שבעה בעקבות את התמרה חושית. אחד הניסויים עצמאית שלושה מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: לתוספי יש על יעילות גבוהה יותר של התמרה חושית בתאי NK מאתר.
תאי NK מאתר ראשי נהפכו עם MOI של 30 IU/תא, היו בתרבית במשך שבעה ימים בנוכחות Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL), או לתוספי (8 µg/mL). אחוזי תאים לבטא-GFP נקבעו על ידי cytometry זרימה-שבעה ימים בעקבות את התמרה חושית. אחד הניסויים עצמאית שלושה מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: לתוספי לשנות לא NK תאית ציטוטוקסיות פעילות של תאים טרנספורמציה.
תאי NK העיקרי נהפכו עם MOI של 10 IU/תא, היו בתרבית במשך שבעה ימים. YAC-1 ו- K562 שימשו כתאים היעד כדי לקבוע את הפוטנציאליות ציטוטוקסיות של תאי NK (ב) מאתר (א) ואנושי, בהתאמה. הנתונים המוצגים הם נציגים של שני ניסויים עצמאית. הנתונים המוצגים הם ממוצעים ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: לתוספי אינו משנה IFN-γ לייצור תאי NK העיקרי.
a) תאי NK מאתר היו transduced עם MOI של 30 IU/תא ותרבותית במשך שבעה ימים. תאי NK היו מגורה עם 2.5 µg/mL של צלחת מכורך אנטי-NKG2D נוגדנים עבור 18 h, IFN-γ הייתה לכמת ב תרבות supernatants באמצעות של אליסה. b) תאי NK אדם transduced היו תרבותי עם תאים K562 במשך 24 שעות ביממה, ההפקה IFN-γ נמדד supernatants תרבות. הנתונים המוצגים הם נציג של 3 ניסויים עצמאית. הנתונים המוצגים הם ממוצעים ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: התמרה חושית של תאי NK עם לתוספי אינו משנה את הנביטה התאים שלהם.
הכדאיות של האדם טרנספורמציה (א) ותאי NK (ב) של העכבר היה לכמת לאחר צביעת עבור Annexin-V (PE) / 7-מ תאים חיוביים. הנתונים המוצגים הם ממוצעים ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר זה מדגים את השימוש לתוספי כמו סוכן פולימר cationic משפר את היעילות התמרה חושית lentiviral של תאי NK מאתר והאדם העיקרי. בנוסף, cationic סוכנים אחרים, כגון חמאת בוטנים או PS, יש השפעה ניכרת על המסירה של וקטורים ויראלי לתוך תאי NK ראשי אדם. בעבר, זה הוכח כי Pb אפשר להגדיל התמרה חושית הגן האנושי T תאים17. תוצאות אלה, לעומת זאת, מראים כי לא Pb ולא PS יש על יעילות דומה על תאי NK ראשי האדם. במחקר זה, Pb שיפור היעילות התמרה חושית בלבד בצניעות בתאי NK מאתר. הוכח, כי עיכוב של מנגנוני הגנה תאיים נגיפים באמצעות BX795, מעכב של TBK1/IKKɛ, PS ועיצוב יכול להגביר את היעילות של התמרה חושית lentiviral25. עם זאת, התוצאות הראו כי המדכא הזה יש השפעה על היעילות התמרה חושית בתאים מאתר או אדם ראשי NK (נתונים לא מוצג).
התוצאות מדגימים שלתוספי הזה יכול לגרום את התמרה חושית יעילה של האדם העיקרי ותאים NK בעכבר, בעוד PS ו- Pb אין השפעה. התוצאות מציגות גם שלתוספי הזה אינו משנה את הפונקציות אפקטור של תאי NK, כגון אנטי הגידול cytotoxicity ואת הייצור של ציטוקינים פרו-דלקתיים. לפיכך, תוצאות אלה מוכיחים כי הכדאיות של אלה בתאי NK הראשי לא שונה על ידי שימוש לתוספי.
מחקרים רבים ניתחו, והשוו את היעילות התמרה חושית של retroviral וקטורים באמצעות פולימרים cationic שונים, עם תוצאות מגוונות26,27,28. מחקר קודם אחד לעומת היעילות התמרה חושית של פולימרים אלה באמצעות וקטורים lentiviral; עם זאת, זה נבחנה ב- CD4+ T תאים16. באחד המחקרים הללו, הוכח כי Pb יש קיבולת טובה יותר של התמרה חושית על תאי B טרנספורמציה, תאים דנדריטים בהשוואה לתוספי26. במחקר אחר, הוכח כי לתוספי מקלה על יעילות התמרה חושית גבוהה יותר מאשר אחרים משפרי בתאי B אנושי, T תאים16. המחקר הנוכחי הוא הראשון מסוגו, לידע שלנו, מנותח, בהשוואה הקיבולת התמרה חושית של פולימרים שונים בתאים אנושיים וטכנולוגיים מאתר ראשי NK.
Transductions ג'ין מבוססי לתוספי עשויים לדרוש מינימום של שני סיבובים של transductions. תוצאות אלו מראות כי סיבוב אחד של התמרה חושית מספיק להגיע עד 40% של תאים באופן חיובי transduced, אשר היא להגדיל עד 100% בעקבות 2 כדורים של התמרה חושית (נתונים לא מוצג). אחד האתגרים הגדולים ב transducing תאי NK היא היכולת של תאים אלה כדי לשמר את הביטוי של הגן transduced. התוצאות הנוכחי מדגימים התמרה חושית תאי NK ראשי עם לתוספי יציב, כי התאים NK מתורבתים בנוכחות il-2 באפשרותך לשמר וקטור ולתחזק transgene ביטוי במשך ארבעה שבועות (נתונים לא מוצג). ניסויים נוספים נדרשים כדי לנתח את היעילות התמרה חושית ולבחון את הביטוי בו-זמניות של transgenes מרובים.
היעילות הקלינית של טיפולי סרטן מבוססי תאים חיסוניים מאומתת על-ידי מוסדות מרובים. תאי T transduced רכב מספקים הבטחה מחודשת המחלה-relapse נטול התאוששות של חולי סרטן בהשוואה טיפולים קונבנציונליים. כחלק מולדת תגובות מערכת החיסון, תאי NK אינם דורשים רגישות מוקדמת עולה כדי לתווך את הפונקציות אפקטור שלהם, כולל אנטי הגידול cytotoxicity. עקב תגובה מהירה שלהם, הם תאי NK ערכה לימפוציט אפקטור אידיאלי לתווך על חיסוני סרטן יעילה מבוססת-תא. למרות תכונותיהם החיוביות זיהוי הגידול, חיסול, המכשולים הטכניים לגבי מניפולציה גנטית כדי לספק transgenes להגביל ניצול קלינית fullest של תאי NK.
אלקטרופורציה של mRNA על ביטוי גנים אקסוגני הוא יעיל ביותר ובעל תוצאות טובות יותר. עם זאת, ה-mRNA השירות היא מוגבלת, שכן הם מאפשרים רק התבטאות הגנים של עניין חולף, ובכך אינם מתאימים ליישומים קליניים. התמרה חושית retroviral תאי NK יעילה פחות כפי שהוא דורש מספר סיבובים של התמרה חושית; יתר על כן, וקטורים retroviral לא מגלי-חלוקת תאים. הגישה מבטיח רק למשלוח transgene יציב הוא השימוש של וקטורים lentiviral.
בסך הכל, מחקר זה מספק שיטה יעילה כדי לספק transgenes לתאי NK ראשי, בלי ופוגע הפונקציות אפקטור שלהם. פרוטוקול זה גורם חיסוני סרטן המבוסס על תאי NK מאוד יעילים וישימים המתעוררים ניסויים קליניים. ניסויים עתידיים נחוצים כדי לאמת את היעילות של שיטה זו של NK סרטן מבוססת-תא immunotherapies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים טוענים אין ניגוד אינטרסים כספיים.
Acknowledgments
אנו מודים לוסיה Sammarco, לולו שלה לימונדה לעמוד השראה, מוטיבציה, תמיכה. עבודה זו היה נתמך בחלקה על ידי NIH R01 AI102893 ו CA179363 R01 NCI (בארקדיה); NHLBI-HL087951 (ס. ר); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); קרן דוכן לימונדה אלכס (בארקדיה); התוכנית HRHM של הקרן MACC (בארקדיה; ס. ר; M.S.T); הקרן המשפחתית על ניקולס (בארקדיה); משפחת Gardetto (בארקדיה); החוקרים יונדאי התוכנית (M.S.T.); יונדאי תקווה על גלגלים (ס. ר); הקרן MACC (M.S.T. וש. מ.); מכון המחקר של הילדים, MCW (ס. ר); ופרס קטי Duffey פוגרטי (M.J.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
| polybrene (Pb) | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| protamine sulfate (PS) | Sigma-Aldrich | p3369 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATALANTA | S11150 | |
| Penicillin | Corning | 30-001-CI | |
| B-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | |
| sodium pyruvate | Corning | MT25000CI | |
| Interferon gamma (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
| Propidium lodding staining solution | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| Isoflurane | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| NK cell negative selection kit | Stem Cell | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| Mice | Jakson | 664 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| T75 flasks | Cornnig | 430641U | |
| antibody-based negative selection kits | Stem Cell | 19055 | |
| 51Chromium (Cr)-release assays | perkin elmer's | NEZ030 | |
| ELISA kits | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| Sodium Butyrate | Sigma | 5887-5G | |
| Linear polyethylenimine | polysciences | 23966-2 | |
| Ficoll | GE Life Science | 17-1440-03 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV |
References
- Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
- Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
- Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
- Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
- Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95 (2014).
- Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94 (2016).
- Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
- Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
- Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
- Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
- Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
- Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
- Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
- Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
- Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
- Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529 (2009).
- Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
- Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
- Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
- Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
- Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
- Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
- Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
- Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
- Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).
