Summary
이 연구의 목표는 기본 자연적인 살인자 (NK) 세포에서 성공적인 유전자 변환에 대 한 허용 하는 기술을 공식화 했다. 인간의 lentiviral 변환 dextran 중재 또는 더 높은 유전자 식 효율성에 마우스 기본 NK 세포 결과. 이 방법은 유전자 변환의 NK 세포 유전자 조작을 향상 방대 하 게 됩니다.
Abstract
자연적인 살인자 (NK) 세포에 특정 유전자의 효율적인 변환 주요 도전 하고있다. 성공적인 transductions는 개발, 차별화, 및 NK 세포의 기능에 관심사의 유전자의 역할을 정의 하는 데 중요 합니다. 암 immunotherapy에 공상 항 원 수용 체 (자동차)에 관련 된 최근의 진보 effector 세포에 세 유전자를 전달 하는 효율적인 방법에 대 한 필요성을 강조 합니다. 기본 인간 또는 마우스 NK 세포 중재 lentiviral 유전자 transductions의 효율성 유지 크게 낮은 주요 제한 요인입니다. 최근 진보 양이온 중합체, polybrene, 등을 사용 하 여 T 세포에서 향상 된 유전자 변환 효율을 표시 합니다. 그러나, 이러한 제품 NK 셀의 변환 효율을 개선 하지 못했습니다. 이 작품 보여줍니다 그 dextran, 분기 글 루 칸 다 당 류, 크게는 인간의 변환 효율 및 마우스 기본 NK 세포 향상 됩니다. 이 높은 재현성 변환 방법론 인간의 기본 NK 세포, 임상 유전자 배달 응용 프로그램 및 따라서 NK 세포 기반 암 immunotherapy. 훨씬 향상 시킬 수 있는 시험을 위한 유능한 도구를 제공 합니다.
Introduction
자연적인 살인자 (NK) 세포는 타고 난 면역 시스템1의 주요 림프모구 인구. NK 세포는 종양과 감염2,,34에 대 한 호스트 면역 반응의 첫 번째 라인 수비수로 작동합니다. NK 세포는 또한 발산5와 강력한 cytokines의 분 비를 통해 관용의 개발에 중심 역할을 한다. 종양 세포를 대상으로 그들의 강력한 능력으로 인해 여러 임상 시험 암6,7에 대 한 입양 immunotherapy로 인간 NK 세포 기증자 파생 된을 평가 하기 위해 실시 되고있다. 달리 T 세포, NK 세포의 발달 생물학이 있다 아직 잘 특징8. 지식의이 부족은 부분적으로 마우스 또는 인간의 기본 NK 세포의 유전자를 전달 하는 효율적인 기술의 부재 때문입니다. 이러한 이유로 대부분의 NK 세포 연구 1 차 셀 대신 셀 라인에서 실시 되었습니다. 따라서, 안정적이 고 효율적인 프로토콜 transduce 기본 NK 세포의 유전자에 대 한 필요성은 중요 합니다.
이 연구의 전반적인 목표는 기본 인간 또는 murine NK 세포 lenti-또는 레트로 바이러스 불리고 수 있는 일관 되 고 신뢰할 수 있는 방법을 공식화 했다.
이 문제를 해결 하려고 하는 이전 연구, 크게 기본 NK 세포의 과도 변화를 사용 하 여 수행 되었습니다. 이 플라스 미드 transfection9,10, 엡 스타인-바 바이러스 (EBV) 포함 / 하이브리드 retroviral 벡터11, vaccinia 벡터12,13및 Ad5/F35 공상 adenoviral 벡터14. 이러한 기술의 겸손 한 효율성에도 불구 하 고 변환의 과도 특성은 그들이 유전자 변형된 NK 세포의 장기 활용에 적합 합니다. 몇 가지 최근 연구 transduce NK 세포, 감염 유전자 표현11,15의 수락 가능한 수준을 달성 하기의 여러 주기를 요구를 retroviral 벡터를 사용 했습니다. Retroviral 벡터, 달리 lentiviral 벡터는 바이러스 사전 통합 복잡 한 핵으로 이동 하 호스트 세포 핵 가져오기 기계를 사용할 수 있습니다. 이것은 기본 NK 세포를 포함 하는 비 분열 세포에서 바이러스의 복제에 주요 제한 요소 이다.
다른 세포 표면 수용 체와 바이러스 성 입자 사이 상호 작용 셀으로 바이러스 성 통풍 관을 허용합니다. 바이러스 성 봉투 단백질 및 그들의 동족 호스트 수용 체 사이의 초기 계약이 두 가지 사이의 기존 잠재적인 부정적인 요금 때문에 제한 될 수 있습니다. 많은 변환 기법 뒤에 근거는 polybrene (Pb), protamine 황산 (PS), 등 dextran, 양이온 중합체의 세포 표면 수용 체에 포지티브 차지를 줄 수 있고 그로 인하여 증가 바이러스 성 봉투의 바인딩 단백질입니다. 이 셀16퓨전 효율성과 바이러스 성 입자의 통풍 관을 증가할 것 이다. Pb 또는 PS 향상 시킬 수 있는 T 세포17에 유전자 이동으로 보고 되어, 그들의 응용 프로그램 없 어떤 효과 기본 NK 셀의 변환 효율에서. 또한, 기본 NK 세포를 사용 하 여 이러한 시 약 사이의 비교 분석 하지 수행 되었습니다. 이 연구에서는 3 개의 양이온 중합체의 변환 효율성 비교 되었다. 결과,이 3 개의 양이온 폴리머 중 dextran만 크게 향상 마우스 및 인간의 기본 NK 세포로 효율적인 바이러스 성 변환 보여.
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Protocol
모든 동물 프로토콜 동물의 자비 롭 고 윤리적인 치료를 따 랐 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 내는 생물 의학 연구 센터 (BRC) 의학 대학 위스콘신 (MCW), 밀워키, 위스콘신에 의해 승인 했다. 인간 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)를 사용 하 여 혈액 센터 위스콘신, 밀워키, 위스콘신의 혈액 연구소의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었다.
1. 마우스, 셀 라인, 및 벡터
- 상용 공급 업체에서 C57BL/6 마우스를 가져옵니다. 병원 체-무료 조건에서 마우스 식민지를 유지 하 고 6과 12 주 사이의 암컷과 수 컷 쥐를 사용 하 여. IRB 승인 소스에서 취소 확인 된 인간의 PBMCs를 가져옵니다.
- Anesthetize는 마우스를 프로필 렌 글리콜 (1, 2-propanediol, USP 급료)에 20-30 %v / v isoflurane의 혼합물으로 동물 anesthetize 쥐 마 취하는 동안 건조를 방지 하기 위해 눈에 수 의사 연 고를 적용 합니다.
- 동물 안락사, 마 취 유도 후 자 궁 경부 전위를 수행 합니다.
- 단단히 쥐고 한 손으로 꼬리의 기지에 의해 쥐를 제 지. 튼튼한 스틱 형 펜 또는 엄지와 첫 번째 손가락, 목의 뒤에 대 한 다른 한편의 두개골의 기지에서 배치 합니다.
- 전위를 생성 하려면 동물의 머리 앞으로 하 고 기본 꼬리를 잡고 손으로 뒤로 당기면 밀어 억제 손을 밀어. 자 궁 경부 조직의 분리에 대 한 느낌으로 전위의 효과 확인 합니다.
- 적어도 5 분 동안 챔버/장에 동물을 유지 하 고 있을 때는 탐지의 부족 또는 호흡 활동은 결 석 하는 경우에 그들을 제거.
- 상업용 공급 업체에서 K562과 YAC-1 세포를 가져오고 RPMI1640에서 그들을 유지 하는 것 10%를 포함 하는 중간 열 비활성화 FBS. 이러한 셀 라인 mycoplasma 오염의 가능성을 제외을 정기적으로 테스트 합니다.
2. 준비 및 lentiviral 벡터의 적정
- 문화 5 × 106 293T 세포 포함 된 솔루션 10 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 1mm 나트륨 pyruvate, RPMI1640 매체의 20 mL의 5% 7.5% 나트륨 중 탄산염 용액의 0.001% T75 cm2 플라스 크에서 하룻밤 Β-mercaptoethanol입니다. 5.2% CO2주입 37 ° C 배양 기에서 플라스 크를 놓습니다.
- 트립 신 (0.025%)/EDTA (1mm) 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 사용 하 여 293T 세포 수확. PBS에서 트립 신/EDTA의 5 mL을 추가 하 고 37 ° C T75 cm2 플라스 크에서 293T 세포의 분리를 허용 하는 인큐베이터에서에서 10 분 동안 flasks를 품 어.
- 분리 된 세포를 수집 하 고 PBS trypsin의 모든 흔적을 제거 하 고 EDTA에 두 번 그들을 씻어. hemocytometer와 셀 고 mL 당 1 백만 셀에 셀 번호를 조정 합니다.
- PsPAX2의 3.95 µ g, 1.32 µ g의 pMD2G, 및 pLEP-GFP-순수 하지 않아 (생성 된 사내 브리 pLenti CMV GFP 순수 하지 않아에에서 CMV 발기인 대신 pWPI에서 EF1alpha 발기인 복제에 의해)의 5.26 µ g 293T 세포18 transfect19.
- 150 mM NaCl의 1 mL 플러스 0.6 mg/mL polyethylenimine의 63 µ L를 준비 (페이; 25000 kD, 선형). 잘 혼합 후는 플라스 미드를 추가 하 고 혼합. 실 온에서 20 분 동안 incubate 고 셀에 추가 합니다.
- 16 h 후 transfection, 대체 신선한 매체와 transfection 매체 플러스 4.5 m m 나트륨 낙 산 염. 포함 하는 바이러스 48 h 후 transfection 상쾌한 수확 하 고 5000 × g에서 하룻밤 원심 분리에 의해 집중. 자료 테이블을 참조 하십시오.
- 293T 세포를 사용 하 여 직렬 희석을 수행 하 여 바이러스 titers를 확인 하 고 시험의 흐름 cytometry 72 h 후 변환20. 측정으로 녹색 형광 단백질 (GFP)의 식을 사용 하 여 바이러스 titers을 계량.
3. 정화와 murine 기본 NK 세포의 확장
- 정화 murine 기본 NK 세포21. 간단히, 단일 셀 비장 정지 나일론 양모 열 B 세포와 대 식 세포로 구성 된 부착 인구를 고갈을 통해 전달 합니다.
- 문화 비 점착 인구 eluted murine NK 세포 1000 U/mL 인터 루 킨 (IL)-2 RPMI1640 매체에 10 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 1mm 나트륨 pyruvate, 7.5% 나트륨 중 탄산염의 5%를 포함 하는 나일론 양모 열에서 솔루션, 그리고 0.001% β-mercaptoethanol (RPMI1640 완전 한 매체).
- 하루에 4의 비 부착 T와 NKT 세포; 제거 하이 문화는 플라스 크에서 매체를 변경 준수는 플라스 크에 남아 있는 세포는 주로 NK 세포. 20 mL 신선한 RPMI1640 완전 한 매체 및 1000 U/mL는 플라스 크를 보충 하기 위해 일리노이-2 추가 합니다.
- NK 세포 특정 마커20 CD3의 95% 이상으로 준비를 사용 하 여 하루 7 cytometry에 murine NK 세포 배양의 순도 확인-NK1.1+ 인구.
4. 정화와 인간의 기본 NK 세포의 확장
- 건강 한 인간의 지원 자의 버 피 코트에서 밀도 그라데이션에 의해 PBMCs를 격리 합니다. 잠시, 신중 하 게 반-희석 (HBSS) 셀 밀도 그라데이션 50 mL 정식 튜브에서의 15 mL 이상 35 mL 레이어. 브레이크 없이 진동 물통 회전자에 20 ° C에서 30 분 400 × g에서 원심.
- 상업 항 체 기반 부정적인 선택 키트를 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 기본 인간 NK 세포를 정화.
- 절연, 다음 면역 형광 분석으로 NK 세포 준비의 순도 결정 합니다. PBS NK 세포 인구 세포 표면에 CD56의 존재와 CD3의 부재에 의해 결정으로 두 번 NK 세포 준비 2 µ g/mL 안티-CD3와 4 ° C에서 2 µ g/mL 안티 CD56 항 체 20 분 세척에 대 한 셀을 얼룩.
- 4 ° C에서 20 분에 대 한 항 체와 세포 준비 품 어, PBS로 세척 하 고 교류 cytometer에서 분석. NK 세포 준비를 사용 하 여 85% 이상의 순도 유전자 변환에 대 한 분석 실험20.
5. 변환 lentivirus와 murine 및 인간의 기본 NK 세포의
- GFP lentivirus 감염 (MOI)의 5, 10, 그리고 20 다양성에서 표면에 뜨는 존재와 Pb의 존재 하는 매체의 0.5 × 105/mL에서 마우스 또는 24-잘 접시의 인간의 기본 NK 세포를 일시 중단 (8 µ g/mL), PS (8 µ g/mL) 또는 dextran (8 µ g/mL).
- 60 분에 대 한 1000 × g에서 격판덮개 원심
- 셀 하룻밤 (16-18 h) 5.2% 주입 37 ° C 배양 기에서 문화는 상쾌한 decanting, 없이 공동2.
- 10 mL의 PBS로 세척 하 고 일리노이-2의 완전 한 RPMI1640 문화 매체의 2 mL에 resuspend (300 U/mL).
- 인간을 테스트 하 고 51크롬 (Cr)을 수행 하 여 각각 기본 NK 세포 중재 된 세포 독성 K562과 YAC-1에 대 한 마우스-릴리스 분석 실험에서 다양 한 이펙터-대상 셀 비율22.
- 간단히, 방사선된 나트륨 크롬 51Cr의 1 백만 대상 셀 50 µCi를 제공 합니다. 4-h 인큐베이션 기간 동안, 그들은 이해는 51Cr 세포 단백질으로. 외피의 끝에, 어떤 비법 인된 라벨을 제거 하는 세포를 씻어.
- 대상 셀에서 51Cr의 절대 자연과 실험 자료의 양에 의해 특정 종양 세포 세포의 용 해를 계산 합니다.
주: pentaplicate 실험에서 특정 세포의 비율의 계산 수행은 다음 수식을 사용 하 여: % 특정 세포 = ((51Cr 의미 실험 자료- 51Cr 의미 자연 방출) (51의 Cr 의미 / 최대한 출시- 51Cr 의미 자연 스러운 릴리스)) х 100, 어디 "51Cr 의미 자발적인 방출" 51NK 세포의 부재에서 대상 셀에서 발표 하는 Cr 이며 "51Cr 말은 최대한 릴리스" 51Cr 2 N 염 산 (HCl)에 의해 대상 세포 세포의 용 해 시에서 발표.
- 7 일에는 플라스 크를 부드럽게 눌러 transduced NK 세포를 수확.
- 밤새 안티 NKG2D mAb의 2.5 µ g/mL 농도와 96-잘, 높은 단백질 흡수 폴리스 티 렌 플레이트를 코팅 하 여 플레이트-바인딩 안티-NKG2D (A10) mAb의 적정 한 농도와 수확된 셀을 활성화 합니다.
- 각 씻어 주 NK 세포의 추가 하기 전에 세 번 PBS의 100 µ L로 잘.
- 문화 supernatants 크린 시 토 킨 IFN-γ 등 계량 h 후 활성화 16와 18 사이 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 수집 합니다. 재조합 cytokines 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 키트와 함께 제공 된를 사용 하 여 표준 곡선을 생성 합니다.
- Annexin-V/7-아미노-악티노마이신 D (7-AAD) 얼룩23 을 사용 하 여 NK 세포 생존 능력을 테스트 하 고 교류 cytometer를 사용 하 여 변환 된 NK 세포 중 회 저 성 세포의 비율을 결정 합니다.
- 이 분석을 수행 하려면 수확 murine 및 인간 NK 세포 변환, 후 4 일 두 번 5 분 각, 500 × g에서 차가운 PBS의 10 mL로 씻어과 Annexin V (PE)와 함께 알을 품고 / 7 AAD 키트.
- 적절 한 흐름 cytometry 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석. 라이브 세포 인구를 선택 하 고 바이러스 성 변환24의 GFP (FITC 채널)의 식을 분석.
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Representative Results
Dextran 유도 lentiviral 벡터 기본 인간과 murine NK 세포에서의 효율적인 유전자 이동
인간 NK 세포 격리 및 (85% 이상의 순도)와 PBMC에서 정화 되었고 rIL-2 300 U/mL와 함께 밤새 껏 알을 품. 이러한 기본 NK 세포 감염의 다양 한 복합성에 GFP lentivirus로 불리고 다음 했다 (나; 3, 10, 및 셀 20 IU) 8 µ g/mL Pb, PS, 또는 dextran 있을 때 24-잘 접시에. 셀 60 분 1000 × g에서 centrifuged 그리고 CO2 배양 기에서 37 ° C에서 하룻밤 배양 (바이러스)의 존재. 셀 씻어 고 7 일에 대 한 rIL-2 300 U/mL와 함께 신선한 RPMI1640 완전 한 매체에서 resuspended. 변환 효율 cytometry GFP 식 변환 후 7 일 평가 했다. 결과 dextran 인간 NK 세포에 lentiviral 변환의 효율성을 강화 하 고 또한 불리고 NK 세포 (그림 1)의 비율을 향상 시킬 수 있는 바이러스 titer 증가 표시 됩니다.
Murine NK 세포는 고립 되었고 이전 섹션에 설명 된 대로 양식. 위의 프로토콜 분석 하 고 Pb, Ps, 및 dextran의 변환 효율을 비교 사용 되었다. 그림 2 에 결과 표시는 dextran Pb에 비해 lentiviral 벡터의 효율성을 증가 수 있습니다 또는 추
Dextran NK 셀의 변환 effector 기능을 중재 하는 능력에 영향을 주지 않습니다.
불리고 인간과 murine NK 세포의 세포 독성 용량 대상 셀으로 K562과 YAC-1에 대 한 51Cr-릴리스 분석 실험에 의해 시험 되었다. 그림 3a 와 b 에 결과 공개 dextran NK 셀 변환 부정적인 비 불리고 NK 세포에 비해 변형 된 NK 세포의 살해 가능성이 변경 되지 않습니다. 또한, 기본 NK 세포 transduced cytokine 생산 분석 했다. IFN-γ 세대는 ELISA를 사용 하 여 측정 했다. 인간의 기본 NK 세포 transduced 24 h, K562와 공동 경작 그리고 측정 IFN-γ. 는 supernatants 수집 된 그림 4a 에 결과 공개는 dextran cytokines을 생산 하는 불리고 NK 세포의 기능에 아무런 영향을 미치지. 독립적인 검증으로 NK 세포 transduced 했다 활성화 플레이트-바인딩 안티-NKG2D (A10) mAb의 적정 한 농도 18 헤 문화 supernatants 수집, 그리고 IFN-γ 세대 ELISA에 의해 측정 되었다. 그림 4b 에 표시 된 결과 공개는 dextran murine NK 셀의 변환 cytokines을 생산 하는 그들의 능력에 영향을 주지 않습니다.
Dextran와 NK 세포의 변환 그들의 세포 생존 능력에 영향을 미치지 않습니다.
불리고 NK 세포의 생존에 Pb, PS, 또는 dextran의 영향 propidium 요오드 화물 (PI) 분석 결과 및 후속 흐름 분석을 사용 하 여 평가 되었습니다. 그림 5a 와 b 에 결과 설명, 기본 인간과 마우스 NK 세포 바이러스 시험 NK 세포의 약 20%에 괴 사를 일으킬 수 있다, 비록 dextran의 추가 않았다 하지 증대 Pb에 비해이 괴 사 또는 추
통계 분석은 양측 짝이 없는 학생의 t-검정을 수행 했다. P-값 ≤ 0.05 중요 한 고려 되었다.
그림 1: Dextran 인간의 기본 NK 세포의 변환의 높은 효율성을 있다.
기본 인간 NK 세포 3, 10, 또는 20 IU/셀의 나로 변형 되었다와 Pb의 존재 7 일에 대 한 교양 했다 (8 µ g/mL), PS (8 µ g/mL), 또는 dextran (8 µ g/mL). GFP-긍정적인 NK 세포의 비율 했다 cytometry 7 변환 다음 당일에 결정 됩니다. 3 개의 독립적인 실험 중 하나에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Dextran murine NK 세포에 변환의 높은 효율성을 있다.
기본 murine NK 세포 30 IU/셀의 나로 변형 되었다와 Pb의 존재 7 일에 대 한 교양 했다 (8 µ g/mL), PS (8 µ g/mL), 또는 dextran (8 µ g/mL). GFP 표현 세포의 백분율은 cytometry 변환 다음 7 일에 결정 됩니다. 3 개의 독립적인 실험 중 하나에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Dextran 변형 된 세포의 세포 독성 활동을 중재 하는 세포는 NK를 수정 하지 않습니다.
기본 NK 세포 10 IU/셀의 나로 변형 되었다 하 고 7 일에 대 한 교양 했다. YAC-1와 K562 각각 murine (a)와 인간 (b) NK 세포의 세포 독성 잠재력을 확인 하려면 대상 셀으로 사용 되었다. 표시 된 데이터는 두 개의 독립적인 실험의 대표자. 표시 된 데이터는 평균 SEM.와 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: Dextran 기본 NK 세포의 IFN-γ 생산을 변경 되지 않습니다.
a) murine NK 세포 30 IU의 나로 불리고 있었다/셀 및 7 일 동안 배양. NK 세포는 18 h에 대 한 항 체 플레이트-바인딩 안티-NKG2D의 2.5 µ g/mL로 자극 했다 그리고 IFN-γ는 ELISA를 사용 하 여 문화 supernatants에 계량 했다. 인간 NK 세포 b) 불리고 K562 셀 24 h에 대 한 교양 했다 그리고 IFN-γ 생산 문화 supernatants 측정 되었다. 제시 하는 데이터는 3 개의 독립적인 실험의 대표. 표시 된 데이터는 평균 SEM.와 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: dextran와 NK 세포의 변환은 그들의 세포 생존 능력을 변경 하지 않습니다.
변형 된 인간 (a)와 마우스 (b) NK 세포의 생존 능력은 Annexin V (PE)에 대 한 얼룩 후 계량 / 7 AAD 긍정적인 세포. 표시 된 데이터는 평균 SEM.와 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 연구는 양이온 폴리머 에이전트 murine 및 인간의 기본 NK 세포의 lentiviral 변환 효율 향상 dextran의 사용 하는 보여줍니다. 또한, 다른 양이온 대리인, Pb 등 PS, 아무 인지할 수에 영향을 바이러스 성 벡터의 기본 인간 NK 세포에. 이전에, Pb 인간 T 세포17에 유전자 변환 증가 수 있습니다 입증 되었습니다. 그러나 이러한 결과, Pb도 PS 기본 인간 NK 세포에 비슷한 효율을가지고 제안. 이 연구에서 Pb만 겸손 하 게 변환 효능 향상 murine NK 세포에서. 그것은 보였다는 증강으로 BX795, TBK1/IKKɛ, 및 PS의 억제제를 사용 하 여 세포내 항 바이러스 방어 메커니즘의 저해 lentiviral 변환 효율25증가 시킬 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 결과 보여주었다이 억제제는 murine 인간의 기본 NK 세포 (데이터 표시 되지 않음)에 변환 효능에 영향을 주지 않습니다.
결과 dextran PS 및 Pb는 영향을 주지 않습니다 있지만 기본 마우스 NK 세포의 효율적인 변환 일으킬 수 보여줍니다. 결과 또한 그 dextran NK 세포, 항 종양 세포 독성과 프로-염증 성 cytokines의 생산 등의 이펙터 기능을 변경 하지 않습니다 보여. 따라서, 이러한 결과 이러한 기본 NK 세포의 생존 dextran의 사용에 의해 변경 되지 않았을 증명.
여러 연구 분석 하 고 다른 양이온 폴리머를 사용 하 여 다양 한 결과26,,2728와 retroviral 벡터의 변환 효율을 비교. 한 이전 연구 lentiviral 벡터;를 사용 하 여 이러한 고분자의 변환 효능 비교 그러나,이 CD4 테스트를 했다+ T 세포16. 이러한 연구 중 하나에서 그것은 Pb에 변형된 B 세포와 수지상 세포 dextran26에 비해 변환의 더 나은 용량을가지고 표시 되었습니다. 또 다른 연구에서는, 그것은 보였다 dextran 용이 인간 B 세포에서 다른 강화 보다 더 높은 변환 효율 및 T 세포16. 현재의 연구는 우리의 지식, 분석 하 고 인간과 murine 기본 NK 세포에 다른 고분자의 변환 용량을 비교 하는 그것의 종류의 첫번째 이다.
Dextran 기반 유전자 transductions transductions의 2 라운드의 최소가 필요할 수 있습니다. 이러한 결과 표시 변환의 한 라운드 정도면 두 변환 (데이터 표시 되지 않음)의 라운드 최대 40% 긍정적으로 불리고 셀의 100% 다음에 증가 됩니다. NK 세포 시험에서 주요 과제 중 하나 transduced 유전자의 표정을 유지 하기 위해 이러한 세포의 기능입니다. 현재 결과 dextran 기본 NK 셀의 변환 안정적 이며 일리노이-2 존재 교양 NK 세포 수는 벡터를 유지 하 고 transgene 식 4 주 (데이터 표시 되지 않음)에 대 한 유지를 보여줍니다. 추가 실험은 변환 효율성을 분석 하 고 여러 transgenes의 동시 식 검사에 필요 합니다.
면역 세포 기반 암 치료의 임상 효능 여러 기관에 의해 검증 되 고 있다. 자동차 불리고 T 세포 기존의 치료에 비해 암 환자의 질병 재발 없는 복구에 대 한 새로운된 약속을 제공 합니다. 타고 난 면역 반응의 일환으로, NK 세포는 이전 sensitization effector 기능, 안티 종양 세포 독성을 포함 하 여 중재 필요 하지 않습니다. 때문에 그들의 급속 한 응답, NK 세포는 효율적인 세포 기반 암 immunotherapy 중재 하는 이상적인 이펙터 림프 구 집합. 종양 인식 및 제거에서 그들의 긍정적인 특성에도 불구 하 고 transgenes 전달 하기 위해 유전자 조작에 관한 기술적인 장애물 NK 세포의 가득 차 있는 임상 활용을 제한 합니다.
외 인 유전자 발현에 대 한 mRNA의 Electroporation 매우 효율적 이며 더 나은 결과 있다. 그러나, mRNA 유틸리티는 제한 된, 그들은 관심사의 유전자의 과도 한 식만을 허용 하 고 그로 인하여 임상 응용 프로그램에 적합 하지 않습니다. NK 세포의 retroviral 변환 변환;의 여러 라운드 필요로 비효율적입니다. 또한, retroviral 벡터는 비 분열 세포에 transduce 수 없습니다. 안정적인 transgene 배달에 대 한 유일한 유망한 접근 lentiviral 벡터의 사용 이다.
이 연구 effector 기능을 방해 하지 않고 transgenes 기본 NK 세포로 전달 하는 효율적인 방법을 제공 합니다. 이 프로토콜은 NK 세포 기반 암 immunotherapy 매우 효율적이 고 신흥 임상 시험에 적용 합니다. 미래 실험에서 NK 세포 기반 암 immunotherapies이 메서드의 효능을 확인 하기 위해 필요 합니다.
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Disclosures
금융 분쟁의 관심을 주장 하는 저자.
Acknowledgments
우리는 루시아 Sammarco와 그녀의 룰 루의 레모네이드 스탠드 영감, 동기 부여, 및 지원을 위한 감사합니다. 이 작품은 NIH R01 AI102893와 NCI R01 CA179363 (S.M.);에 의해 부분적으로 지원 NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); 알렉스 레모네이드 스탠드 재단 (S.M.); MACC 기금 (S.M.;의 HRHM 프로그램 S.R.; M.S.T); 니콜라스 가족 재단 (S.M.); Gardetto 가족 (S.M.); 현대 학자 (M.S.T.) 프로그램; 바퀴 (S.R.);에 현대 희망 MACC 기금 (M.S.T. 및 S.M.); 어린이 연구소, MCW (S.R.); 그리고 캐시 Duffey Fogerty 수상 (M.J.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
| polybrene (Pb) | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| protamine sulfate (PS) | Sigma-Aldrich | p3369 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATALANTA | S11150 | |
| Penicillin | Corning | 30-001-CI | |
| B-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | |
| sodium pyruvate | Corning | MT25000CI | |
| Interferon gamma (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
| Propidium lodding staining solution | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| Isoflurane | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| NK cell negative selection kit | Stem Cell | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| Mice | Jakson | 664 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| T75 flasks | Cornnig | 430641U | |
| antibody-based negative selection kits | Stem Cell | 19055 | |
| 51Chromium (Cr)-release assays | perkin elmer's | NEZ030 | |
| ELISA kits | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| Sodium Butyrate | Sigma | 5887-5G | |
| Linear polyethylenimine | polysciences | 23966-2 | |
| Ficoll | GE Life Science | 17-1440-03 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV |
References
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