Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Dekstran forbedrer Lentiviral signaltransduksjon effektiviteten av Murine og menneskelig primære NK celler

Published: January 15, 2018 doi: 10.3791/55063
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 1,5,6,7
1Laboratory of Molecular Immunology and Immunotherapy, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 2Vector Core Lab, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 3Laboratory of Lymphocyte Biology, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 4Laboratory of Stem Cell Transcriptional Regulation, Blood Research Institute, The Blood Center of Wisconsin, 5Department of Microbiology and Immunology, The Medical College of Wisconsin, 6Department of Pediatrics, The Medical College of Wisconsin, 7Department of Medicine, The Medical College of Wisconsin

Summary

Målet med denne studien var å formulere teknologi som tillater for vellykket genet signaltransduksjon i primære naturlig killer () Celler NK. Den dekstran-mediert lentiviral signaltransduksjon menneske eller musen primære NK celler resulterer i høyere gene expression effektivitet. Denne metoden av genet signaltransduksjon vil vesentlig forbedre NK cellen genetisk manipulasjon.

Abstract

Den effektive Albin på bestemte gener i naturlige killer (NK) celler har vært en stor utfordring. Vellykket transductions er avgjørende for definering av rollen for genet av interesse i utvikling, differensiering og funksjon av NK celler. Nylige fremskritt gjelder chimeric antigen reseptorer (biler) i kreft immunterapi fremhever behovet for effektiv metode å levere eksogene gener til effektor lymfocyttene. Effektiviteten av lentiviral-mediert genet transductions i primære menneske eller musen NK celler forblir betydelig lav, som er en viktig faktor som begrenser. Nylige fremskritt bruker kationisk polymerer, som polybrene, viser en forbedret genet signaltransduksjon effektivitet i T-celler. Men kunne disse produktene forbedre signaltransduksjon effektiviteten av NK celler. Dette arbeidet viser at dekstran, en forgrenet Glukan polysakkarid, vesentlig forbedrer signaltransduksjon menneske musen primære NK celler. Denne svært reproduserbar signaltransduksjon metoden gir et kompetent verktøy for transducing menneskelige primære NK celler, som kan langt bedre kliniske gen levering programmer og dermed NK cellebasert kreft immunterapi.

Introduction

Naturlig killer (NK) celler er store lymfatisk befolkningen av medfødte immunsystemet1. NK celler fungerer som første linje forsvarerne av verten immunrespons mot svulster og infeksjoner2,3,4. NK celler også spille en sentral rolle i utviklingen av toleranse gjennom utskillelsen av potente cytokiner og chemokines5. Potent evne til å målrette og eliminere kreftceller, er flere kliniske forsøk gjennomført for å vurdere donor-avledet menneskelige NK celler som en adoptive immunterapi for kreft6,7. I motsetning til T-celler har utviklingsbiologi av NK celler ennå å være godt karakterisert8. Denne mangelen på kunnskap er delvis på grunn av fravær av effektive teknikker som leverer gener rundt til musen eller menneskelige primære NK celler. For disse grunner, har de fleste NK celler studier vært gjennomført i linjer, ikke i primære celler. Derfor er behovet for en pålitelig og effektiv protokoll som skal transduce primære NK celler med gener av interesse avgjørende.

Det overordnede målet med denne studien var å formulere en konsistent og pålitelig metode som primære menneskelige eller murine NK celler kan være transduced med lenti- eller retroviruses.

Tidligere studier som forsøkte å løse dette problemet har blitt utført, hovedsakelig bruker forbigående transformasjonen av primære NK celler. Dette inkluderer plasmider transfection9,10, Epstein - Barr Virus (EBV) / retroviral hybrid vektor11, vaccinia vektorer12,13, og Ad5/F35 chimeric adenoviral vektorer14. Til tross for beskjeden effektiviteten av disse teknikkene gjør forbigående natur signaltransduksjon dem uegnet for langsiktig bruk av genmodifiserte NK cellene. Noen studier har brukt retroviral vektorer for å transduce NK celler, som krever flere sykluser av infeksjon å oppnå et akseptabelt nivå gene expression11,15. I motsetning til retroviral vektorer, kan lentiviral vektorer bruke verten celle kjernefysiske import maskiner for å translocate viral før integrering komplekset i kjernen. Dette er en viktig begrensende faktor i replikering av viruset i ikke-dele celler, som inkluderer primære NK celler.

Interaksjoner mellom ulike celle-overflate reseptorer og virus partikler tillater viral opptak inn i cellen. De første engasjementer mellom viral konvolutt proteiner og deres beslektet vert reseptorer kan være begrenset på grunn av potensielle negative kostnadene eksisterende mellom disse to. Begrunnelsen bak mange signaltransduksjon teknikker er at tillegg av kationisk polymerer, som polybrene (Pb), protamine sulfate (PS) eller dekstran, kan gi en positiv ladning til celle-overflate reseptorer og dermed øke binding av viral konvolutten proteiner. Dette vil øke fusion effektiviteten og opptaket av viral partikler av celler16. Selv om det har blitt rapportert at Pb eller PS kan forbedre genoverføring i T celler17, har programmet ikke noen effekt i signaltransduksjon effektiviteten av primære NK celler. Videre er en komparativ analyse mellom disse reagensene bruke primære NK celler ikke utført. I denne studien ble signaltransduksjon effektiviteten av de tre kationisk polymerer sammenlignet. Resultatene viser at blant disse tre kationisk polymerer, bare dekstran signifikant øker effektiv viral signaltransduksjon inn både mus og menneskelige primære NK celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr protokoller fulgte Human og etikken behandling av dyr og ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) innen biomedisinsk forskning Center (BRC) av Medical College i Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI. Bruk av menneskelige perifert blod mononukleære celler (PBMCs) ble godkjent av institusjonelle Review Board (IRB) av blod Research Institute of Blood Center of Wisconsin, Milwaukee, WI.

1. mus, linjer og vektorer

  1. Få C57BL/6 mus fra kommersielle leverandører. Vedlikeholde musen koloniene i patogen-gratis forhold og bruke kvinnelige og mannlige mus mellom 6 og 12 uker. Få de identifiserte menneskelige PBMCs fra IRB-godkjente kilder.
  2. Bedøve dyrene med en blanding av 20-30% v/v isoflurane i propylenglykol (1, 2-propanediol, USP klasse) til å bedøve musene. Veterinæren salve gjelde øynene for å hindre tørrhet mens mus er under narkose.
  3. For å avlive dyrene, utføre cervical forvridning etter induksjon av anestesi.
    1. Holde musene av fast fatte foten av halen med én hånd. Plass en solid pinne-type penn eller tommel og første finger på den andre hånden mot baksiden av halsen, ved foten av skallen.
    2. For å produsere forvridning, skyve hånden holde dyr videresende og presse ned mens du trekker bakover med hånden holder halen base. Kontrollere effektiviteten av forvridning ved følelse for en separasjon av cervical vev.
  4. Holde dyr i kammer/byrået for minst 5 min og fjerne dem bare når luftveiene aktivitet er fraværende eller når det er mangel på et synlig hjerteslag.
  5. Få K562 og YAC-1 celler fra kommersielle leverandører og opprettholde dem i RPMI1640 medium som inneholder 10% inaktivert FBS. Teste disse cellelinjer regelmessig for å utelukke muligheten for mycoplasma forurensning.

2. forberedelse og titrering lentiviral vektorer

  1. Kultur 5 × 106 293T celler overnatte i en MT75 cm2 kolbe som inneholder en løsning av 20 mL RPMI1640 medium med 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 1 mM natrium pyruvate, 5% av 7,5% natrium bikarbonat løsning og 0,001% Β-mercaptoethanol. Plass flasken i en 37 ° C inkubator tilført 5,2% CO2.
  2. Høste 293T cellene med trypsin (0.025%)/EDTA (1 mM) i fosfat-bufret saltvann (PBS). Legg til 5 mL av Trypsin/EDTA i PBS og ruge flasker i 10 minutter i en 37 ° C en inkubator å tillate brøkdel av 293T celler fra MT75 cm2 flasker.
    1. Samle frittliggende cellene og vaske dem to ganger i PBS å fjerne ethvert spor av trypsin og EDTA. Telle celler med en hemocytometer og justere celle nummer én million celler per mL.
  3. Transfect 293T celler18 3,95 µg av psPAX2, 1.32 µg av pMD2G og 5.26 µg av pLEP-GFP-Puro (generert internt på BRI av kloning EF1alpha promoter fra pWPI i stedet for en CMV promoter i pLenti CMV-GFP-Puro)19.
    1. Forberede 1 mL av 150 mM NaCl pluss 63 µL av 0.6 mg/mL polyethylenimine (PEI; 25.000 kD, lineær). Bland godt og deretter Legg plasmider og bland. Ruge for 20 min i romtemperatur, og deretter legge den til celler.
    2. 16 h etter transfection, Erstatt hva mediet med fersk medium pluss 4,5 mM natrium butyrate. Høste nedbryting inneholder virus 48 timer etter transfection og ved overnatting sentrifugering 5000 × g. Se tabellen materialer.
  4. Bestemme viral titers benytter 293T celler ved å utføre føljetong fortynninger og analysen av flyt cytometri 72 h etter signaltransduksjon20. Bruke uttrykk for grønne fluorescerende protein (GFP) som mål for å kvantifisere viral titers.

3. rensing og utvidelse av murine primære NK celler

  1. Rense murint primære NK celler21. Kort, passere encellede milt suspensjoner gjennom nylon ull kolonner til deplete tilhenger befolkningen består av B-celler og makrofager.
  2. Kultur ikke-tilhenger befolkningen elut nylon ull kolonnen som inneholder murine NK celler med 1000 U/mL interleukin (IL) -2 i RPMI1640 medium med 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 1 mM natrium pyruvate, 5% av 7,5% natrium bikarbonat løsning og 0,001% β-mercaptoethanol (RPMI1640 komplett medium).
  3. Endre medium fra flasker på dag 4 kultur fjerne ikke-tilhenger T og NKT celler. celler som er adhered til flasker er hovedsakelig NK celler. Legge til 20 mL fersk RPMI1640 fullstendig medium og 1000 U/mL IL-2 å fylle på flasker.
  4. Sjekk renheten av murine NK cellekulturer på dag 7 av flowcytometri med NK celle-spesifikke indikatorer20 forberedelser med mer enn 95% av CD3-NK1.1+ befolkningen.

4. rensing og utvidelse av menneskelige primære NK celler

  1. Isolere PBMCs ved tetthet gradert fra buffy strøk av friske frivillige. Kort, nøye lag 35 mL av halv-fortynnet (med HBSS) celler over 15 mL tetthet gradert i et 50-mL kanoniske rør. Sentrifuge 400 × g i 30 min ved 20 ° C i en svingende bøtte rotor uten brems.
  2. Bruke de kommersielle antistoff-baserte negative utvalg kits for å rense menneskelige primære NK celler i henhold til produsentens protokollen.
  3. Etter isolasjon, avgjøre renheten av NK celle forberedelsene av immunofluorescence analyser. Stain NK celle preparater med 2 µg/mL anti-CD3 og 2 µg/mL anti-CD56 antistoffer i 4 ° C i 20 min. vask cellene to ganger med PBS NK celle populasjoner bestemmes av fravær av CD3 og tilstedeværelsen av CD56 på cellens overflate.
  4. Inkuber celle forberedelser med antistoffer for 20 min på 4 ° C, vask med PBS og analysere i et flow cytometer. Bruke NK celle forberedelser med mer enn 85% renhet for genet signaltransduksjon søk20.

5. signaltransduksjon murine og menneskelig primære NK celler med lentivirus

  1. Suspendere mus eller menneskelige primære NK celler i en 24-vel plate på 0,5 × 105/mL medium i nærvær av GFP lentivirus supernatant på 5, 10 og 20 mangfold av infeksjon (MOI) og i nærvær av Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL) eller dekstran (8 µg/mL).
  2. Sentrifuge platene 1000 × g for 60 min.
  3. Uten dekantere vin nedbryting, kultur cellene natten (16-18 h) i en 37 ° C inkubator tilført 5,2% CO2.
  4. Vask med 10 mL PBS og resuspend i 2 mL komplett RPMI1640 kultur medium i nærvær av IL-2 (300 U/mL).
  5. Test menneskelige og mus primære NK celle-mediert cytotoksisitet mot K562 og YAC-1, henholdsvis ved å utføre 51krom (Cr)-utgivelsen analyser på varierte effektor-målcellen prosenter22.
    1. Kort, gi en million målet celler 50 µCi i radiolabeled natrium chromate 51Cr. Imens 4-h inkubering, de opptak i 51Cr i mobilnettet proteiner. På slutten av inkubering, vask celler å fjerne noen kommunefritt plateselskap.
    2. Beregne bestemt svulst celle lysis av mengden absolutt, spontane og eksperimentelle utgivelsen av 51Cr fra målcellene.
      Merk: Beregningen av andelen bestemt lysis fra pentaplicate eksperimenter ble gjort ved hjelp av følgende ligning: % bestemt lysis = ((51Cr mener eksperimentelle release - 51Cr mener spontan utgivelsen) / (51Cr mener maksimal release - 51Cr mener spontan release)) х 100, der "51Cr mener spontan utgivelsen" er 51Cr løslatt fra målcellene i fravær av NK celler og "51Cr betyr maksimal utgivelsen" 51Cr utgitt fra målcellene på lysis av 2 N saltsyre (HCl).
  6. Høste transduced NK cellene på dag 7 av trykke forsiktig på flasker.
    1. Aktivere høstet cellene med titrerte konsentrasjoner av plate-bundet anti-NKG2D (A10) mAb belegg 96-brønnen, høyt protein-absorberende polystyren plater med 2,5 µg/mL konsentrasjonen av anti-NKG2D mAb over natten.
    2. Vask hver med 100 µL av PBS tre ganger før tillegg av primære NK celler.
  7. Samle kultur supernatants bruker en flerkanals pipette mellom 16 og 18 h etter aktivisering å kvantifisere cytokiner som IFN-γ. Generere standard kurver ved hjelp av rekombinant cytokiner med enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) kits.
  8. Teste NK cellen med annexin-V/7-amino-actinomycin D (7-AAD) flekker23 og bestemme prosent av nekrotisk celler blant transformert NK celler ved hjelp av en flow cytometer.
    1. For å utføre denne analysen, harvest murine og menneskelig NK celler fire dager etter transduction, vaske to ganger med 10 mL kaldt PBS på 500 × g i 5 min og ruge med en Annexin-V (PE) / 7-AAD kit.
  9. Bruk riktige flyten cytometri programvare for å analysere dataene. Velg live-celle befolkningen og analysere uttrykk for GFP (FITC kanal) som et mål på viral signaltransduksjon24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dekstran induserer effektiv genet overføring av lentiviral vektor i primære menneskelige og murine NK celler

Menneskelige NK celler ble isolert og renset fra PBMC (med renhet av mer enn 85%) og ruges natten med rIL-2 300 U/mL. Disse primære NK-cellene var så transduced med GFP lentivirus på varierte multiplicities infeksjon (MOI; 3, 10 og 20 IU per celle) i 24-og plater i nærvær av 8 µg/mL Pb, PS, eller dekstran. Celler var sentrifugeres 1000 × g for 60 min og kultivert (i nærvær av virus) natten på 37 ° C i en CO2 inkubator. Cellene ble vasket og resuspended i fersk RPMI1640 fullstendig medium med rIL-2 300 U/mL i syv dager. Signaltransduksjon effektiviteten ble evaluert av flowcytometri for GFP uttrykk syv dager etter signaltransduksjon. Resultatene viser at dekstran forbedrer effektiviteten i lentiviral signaltransduksjon i menneskelige NK celler og øker viral titer, som kan også forbedre andelen transduced NK celler (figur 1).

Murine NK celler ble isolert og kultivert som beskrevet i den tidligere delen. Over protokollen ble brukt til å analysere og sammenligne signaltransduksjon effektiviteten av Pb, Ps og dekstran. Resultatene i figur 2 viser at dekstran kan øke effektiviteten av lentiviral vektorer sammenlignet Pb eller PS.

Signaltransduksjon av NK celler med dekstran påvirker ikke deres evne til å megle funksjoner effektor

Cytotoksiske kapasiteten på transduced menneskelige og murine NK celler ble undersøkt av 51Cr-release analyser mot K562 og YAC-1 som målcellene. Resultatene presenteres i figur 3a og b avslører at signaltransduksjon NK celler av dekstran ikke negativt endrer drapet potensialet av transformert NK celler i forhold til ikke-transduced NK celler. I tillegg ble cytokin produksjonen fra transduced primære NK celler analysert. IFN-γ generasjon ble målt ved hjelp av en ELISA. Transduced menneskelige primære NK celler var co kulturperler med K562 24 h, og supernatants var samlet til mål IFN-γ. Resultatene presenteres i figur 4a avslører at dekstran har ingen innvirkning på evnen til transduced NK celler til å produsere cytokiner. Som en uavhengig validering, ble transduced NK celler aktivert med titrerte konsentrasjoner av plate-bundet anti-NKG2D (A10) mAb 18 h. kultur supernatants var samlet og IFN-γ generasjon ble målt med ELISA. Resultatene som vises i figur 4b avslører at signaltransduksjon murine NK celler med dekstran har ingen effekt på deres evne til å produsere cytokiner.

Signaltransduksjon av NK celler med dekstran påvirker ikke deres cellen levedyktighet

Påvirkning av Pb, PS, eller dekstran på levedyktigheten til transduced NK celler ble vurdert ved hjelp av en propidium iodide (PI) analysen og påfølgende flyt analyser. Figur 5a og b demonstrere at, selv om transducing primære menneskelige og mus NK celler med virus, kan det føre til nekrose i ca 20% av NK celler, tillegg av dekstran ikke utvider denne nekrose sammenlignet Pb eller PS.

Statistiske analyser ble utført med en tosidig kort Student t-test. P -verdier ≤ 0,05 ble regnet som betydelige.

Figure 1
Figur 1: Dekstran har en høyere effektivitet av signaltransduksjon av menneskelige primære NK celler.
Primære menneskelige NK celler ble forvandlet med MOI 3, 10 eller 20 IU/cellen og ble kultivert i syv dager i nærvær av Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL), eller dekstran (8 µg/mL). Prosenter av GFP-positive NK celler ble fastsatt av flowcytometri på dag syv etter signaltransduksjon. En av tre uavhengige eksperimenter vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Dekstran har en høyere effektivitet av signaltransduksjon murine NK celler.
Primære murine NK celler ble forvandlet med en MOI 30 IU/cellen og ble kultivert i syv dager i nærvær av Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL), eller dekstran (8 µg/mL). Prosentandeler av GFP-uttrykke celler ble fastsatt av flowcytometri på sju dager etter signaltransduksjon. En av tre uavhengige eksperimenter vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Dekstran endrer ikke NK celle-mediert cytotoksiske aktiviteten transformert celler.
Primære NK celler ble forvandlet med en MOI 10 IU/cellen og ble kultivert i syv dager. YAC-1 og K562 ble brukt som målcellene for å bestemme cytotoksiske potensialet av murine (a) og menneskelige (b) NK celler, henholdsvis. Dataene er representanter for to uavhengige eksperimenter. Dataene er gjennomsnitt med SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Dekstran ikke endrer IFN-γ produksjonen av primære NK celler.
a) murine NK celler ble transduced med en MOI av 30 IU/celle og kultivert i syv dager. NK celler ble stimulert med 2,5 µg/mL plate-bundet anti-NKG2D antistoff 18 h og IFN-γ ble kvantifisert i kultur supernatants bruker en ELISA. b) transduced menneskelige NK celler ble kultivert med K562 celler for 24 h, og IFN-γ produksjonen ble målt i kultur supernatants. Dataene som presenteres er tre uavhengige eksperimenter. Dataene er gjennomsnitt med SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Albin på NK celler med dekstran endrer ikke deres cellen levedyktighet.
Levedyktigheten til transformert menneskelig (a) og mus (b) NK celler ble kvantifisert etter farging for Annexin-V (PE) / 7-AAD positiv celler. Dataene er gjennomsnitt med SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne studien viser at bruk av dekstran som en kationisk polymer agent forbedrer lentiviral signaltransduksjon effektiviteten av både murine og menneskelige primære NK celler. I tillegg har andre kationisk agenter, som Pb eller PS, ingen merkbar innvirkning på levering av viral vektorer i menneskets primære NK celler. Tidligere har det vært vist at Pb kan utvide genet signaltransduksjon i menneskelige T celler17. Disse resultatene, men foreslår at Pb verken PS har en lignende effektivitet på menneskelige primære NK celler. I denne studien Pb forbedret signaltransduksjon effekten bare beskjedent i murine NK celler. Det har vist at hemming av intracellulær antiviral forsvarsmekanismer med BX795, en inhibitor av TBK1/IKKɛ, og PS som en enhancer kan øke lentiviral signaltransduksjon effektivitet25. Likevel viste resultatene at dette hemmer har ingen innvirkning på signaltransduksjon effekten i murine eller menneskelig primære NK celler (data ikke vist).

Resultatene viser at dekstran kan indusere den effektive signaltransduksjon primære menneskelige og mus NK celler, mens PS og Pb har ingen effekt. Resultatene viser også at dekstran ikke endrer funksjoner effektor av NK celler, for eksempel anti-tumor cytotoksisitet og produksjon av pro-inflammatoriske cytokiner. Dermed viser disse resultatene at levedyktigheten til disse primære NK-cellene ikke er blitt endret ved bruk av dekstran.

Flere studier analysert og sammenlignet signaltransduksjon effektiviteten av retroviral vektorer med ulike kationisk polymerer, med varierte resultater26,27,28. En tidligere studie sammenlignet signaltransduksjon effekten av disse polymerer bruker lentiviral vektorer; men dette ble testet i CD4+ T celler16. I en av disse studiene, har det vært vist at Pb har en bedre kapasitet på signaltransduksjon transformert B-celler og dendrittiske celler sammenlignet med dekstran26. I en annen studie, har det vært vist at dekstran muliggjør en høyere signaltransduksjon effektivitet enn andre enhancers i menneskelige B-celler og T celler16. Denne studien er først i sitt slag, til vår kunnskap, som analyseres og sammenlignes signaltransduksjon kapasiteten av ulike polymerer i både menneskelig og murine primære NK celler.

Dekstran-baserte genet transductions krever minst to runder av transductions. Disse resultatene viser at en runde med signaltransduksjon er nok til å nå opp til 40% av positivt transduced celler, som er økt opp til 100% følgende to runder med signaltransduksjon (data ikke vist). En av de store utfordringene i transducing Celler NK er evnen til disse cellene for å bevare uttrykket av transduced genet. Gjeldende resultater viser at signaltransduksjon primære NK celler med dekstran er stabil og at NK cellene er kultivert i nærvær av IL-2 kan beholde vektoren og opprettholde transgene uttrykk i fire uker (data ikke vist). Flere eksperimenter er pålagt å analysere signaltransduksjon effektivitet og undersøke samtidige uttrykk for flere effekter av transgener.

Kliniske effekten av immun cellebasert kreft behandlinger valideres av flere institusjoner. BIL-transduced T-celler gir sykdomsfri og tilbakefall utvinningen av pasienter i forhold til konvensjonell terapi fornyet løftet. Som del av medfødte immunreaksjoner krever NK celler ikke forutgående allergi å megle deres effektor funksjoner, inkludert anti-tumor cytotoksisitet. På grunn av deres rask respons er NK celler et ideelt effektor lymfocytt delsett å megle en effektiv cellebasert kreft immunterapi. Til tross for deres positive attributter i svulst anerkjennelse og eliminering begrense teknisk hindrene om genetisk manipulering å levere effekter av transgener fulle klinisk utnyttelsen av NK celler.

Electroporation av mRNA for eksogene genuttrykk er svært effektiv og har bedre resultater. MRNA verktøyet er imidlertid begrenset, som de tillater bare forbigående uttrykket av gener av interesse og dermed er ikke egnet for klinisk bruk. Den retroviral signaltransduksjon av NK celler er mindre effektiv fordi den krever flere runder med signaltransduksjon; Videre kan ikke retroviral vektorer transduce i ikke-dele celler. Den eneste lovende tilnærmingen for stabil transgene levering er bruken av lentiviral vektorer.

Helt, denne studien gir en effektiv metode for å levere effekter av transgener i primære NK celler, uten å svekke deres funksjoner effektor. Denne protokollen gjør NK cellebasert kreft immunterapi svært effektiv og gjelder for nye kliniske studier. Senere eksperimenter for å bekrefte effekten av denne metoden i NK cellebasert kreft immunotherapies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder noen økonomisk interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Lucia Sammarco og hennes Lulu Lemonade Stand for inspirasjon, motivasjon og støtte. Dette arbeidet var støttes delvis av NIH R01 AI102893 og NCI R01 CA179363 (S.M.); NHLBI-HL087951 (SR); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); Alex Lemonade Stand grunnlaget (Romagna); HRHM programmet i MACC Fund (Romagna; LØPING; M.S.T); Nicholas Family Foundation (Romagna); Gardetto familien (Romagna); Hyundai forskere programmet (M.S.T.); Hyundai håp på hjul (SR); MACC fondet (M.S.T. og Santa Maria) Children's Research Institute, MCW (SR); og Kathy Duffey Fogerty Award (M.J.R.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran Sigma-Aldrich 90-64-91-9
polybrene (Pb) Sigma-Aldrich TR-1003
protamine sulfate (PS) Sigma-Aldrich p3369
Trypsin Corning 25-052-CI
RPMI1640 Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum ATALANTA S11150
Penicillin Corning 30-001-CI
B-mercaptoethanol SIGMA M3148
sodium pyruvate Corning MT25000CI
Interferon gamma (IFN-γ ) eBioscience 14-7311-85
Propidium lodding staining solution BD 51-66211E
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher L3000015
Isoflurane PHOENIX NDC 57319-559-05
NK cell negative selection kit Stem Cell 19855
Yac-1 ATCC TIB-160
K562 ATCC CCL-243
Mice Jakson 664
293T cells ATCC CRL-3216
T75 flasks Cornnig 430641U
antibody-based negative selection kits Stem Cell 19055
51Chromium (Cr)-release assays perkin elmer's NEZ030
ELISA kits Ebioscience 00-4201-56
Sodium Butyrate Sigma 5887-5G
Linear polyethylenimine polysciences 23966-2
Ficoll GE Life Science 17-1440-03
HBSS Corning 21-022-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
  2. Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
  3. Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
  4. Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
  5. Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
  6. Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95 (2014).
  7. Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94 (2016).
  8. Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
  9. Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
  10. Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
  11. Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
  12. Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
  13. Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
  14. Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
  15. Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
  16. Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
  17. Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
  18. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529 (2009).
  19. Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
  20. Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
  21. Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
  22. Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
  23. Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
  24. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
  25. Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
  26. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
  27. Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
  28. Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).

Tags

Immunologi problemet 131 signaltransduksjon primære NK celler dekstran lentivirus genmodifiserte immunterapi
Dekstran forbedrer Lentiviral signaltransduksjon effektiviteten av Murine og menneskelig primære NK celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nanbakhsh, A., Best, B., Riese, M.,… More

Nanbakhsh, A., Best, B., Riese, M., Rao, S., Wang, L., Medin, J., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells. J. Vis. Exp. (131), e55063, doi:10.3791/55063 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter