Summary
Målet med denna studie var att formulera teknik som möjliggör framgångsrik gen transduktion i primära natural killer (NK) celler. Av dextran-medierad lentiviral transduktion av mänskliga eller mus primära NK celler resultat i högre gen uttryck effektivitet. Denna metod av genen transduktion kommer att avsevärt förbättra NK cell genetisk manipulation.
Abstract
Den effektiva transduktion av specifika gener i natural killer (NK) celler har varit en stor utmaning. Framgångsrika transductions är avgörande för att definiera rollen av genen sevärdheter i utveckling, differentiering och funktion av NK-celler. Senaste framstegen relaterade till chimära antigen receptorer (bilar) i cancer immunoterapi accentuera behovet av en effektiv metod att leverera exogena gener till ljudeffektläget lymfocyter. Effektivitetsvinsterna av lentiviral-medierad gen transductions in i primära mänskliga eller mus NK celler förblir signifikant låga, vilket är en viktig begränsande faktor. Senaste framstegen med katjoniska polymerer, såsom polybrene, visar en förbättrad gen transduktion effektivitet i T-celler. Men dessa produkter inte att förbättra de transduktion effektivitetsvinsterna av NK-celler. Detta arbete visar att dextran, en förgrenad glukan polysackarid, avsevärt förbättrar transduktion effektiviteten av mänskliga och mus primära NK-celler. Denna mycket reproducerbara transduktion metod ger en behöriga verktyg för transducing mänskliga primära NK-celler, som kan förbättra klinisk gene delivery program och därmed NK cell-baserad cancer immunoterapi.
Introduction
Natural killer (NK) celler är större lymfatisk befolkningen av det medfödda immunsystem1. NK-celler fungerar som första raden försvarare av värd immunsvaret mot tumörer och infektioner2,3,4. NK-celler också spela en central roll i utvecklingen av tolerans genom utsöndringen av potenta cytokiner och chemokiner5. Tack vare sin potenta förmåga att identifiera och eliminera tumörceller, genomförs flera kliniska prövningar för att utvärdera givare-härledda mänskliga NK celler som en adoptiv immunterapi för cancer6,7. I motsats till T-celler ännu utvecklingsbiologin av NK-celler vara välkarakteriserad8. Denna brist på kunskap är delvis på grund av avsaknad av effektiva tekniker som levererar gener av intresse till mus eller mänskliga primära NK celler. Av dessa skäl, har de flesta NK-cell studier utförts i cellinjer i stället för primära celler. Behovet av ett tillförlitligt och effektivt protokoll till transduce primära NK-celler med gener av intresse är därför avgörande.
Det övergripande målet med denna studie var att formulera en konsekvent och tillförlitlig metod som primära mänskliga murina NK celler eller kunde vara sensorik med lenti- eller retrovirus.
Tidigare studier som försökt att lösa detta problem har utförts, till stor del med den övergående omvandlingen av primära NK-celler. Detta inkluderar plasmid transfection9,10, Epstein - Barr Virus (EBV) / retrovirala hybrid vektor11, vaccinia vektorer12,13, och Ad5/F35 chimära adenovirala vektorer14. Trots den blygsamma effektiviteten av dessa tekniker gör övergående arten av transduktion dem olämpliga för ett långsiktigt utnyttjande av genetiskt modifierade NK-celler. Några färska studier har använt retrovirala vektorer transduce NK-celler, som kräver flera cykler av infektion att uppnå en acceptabel nivå av gen uttryck11,15. I motsats till retrovirala vektorer, kan lentiviral vektorer använda värd-cell nuclear importera maskiner till translocate komplexet viral före integration in i cellkärnan. Detta är en viktig begränsande faktor i replikeringen av viruset i icke-dela celler, som inkluderar primära NK-celler.
Interaktioner mellan olika cellytan receptorer och viruspartiklar tillåta viral upptag in i cellen. Ursprungliga kopplingarna mellan de virala kuvert proteinerna och deras cognate värd receptorer kan vara begränsad på grund av de potentiella negativa laddningar mellan dessa två. Logiken bakom många transduktion tekniker är att tillägg av katjoniska polymerer, såsom polybrene (Pb), protaminsulfat (PS) eller dextran, kan ge en positiv laddning till cellytan receptorer och därmed öka bindningen av virala kuvert proteiner. Detta kommer att öka fusion effektivitet och utnyttjande av viruspartiklarna i celler16. Även om det har rapporterats att Pb eller PS kan förbättra genöverföring i T celler17, har deras tillämpning inte någon effekt i transduktion effektiviteten av primära NK-celler. Dessutom har en jämförande analys mellan dessa reagenser med primära NK-celler inte utförts. I denna studie jämfördes transduktion effektivitetsvinsterna av de tre katjoniska polymererna. Resultaten visar att bland dessa tre katjoniska polymerer, endast dextran avsevärt förbättrar effektiv viral transduktion i både mus och människans primära NK-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur protokoll följt för human och etisk behandling av djur och godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) inom biomedicinsk forskning Center (BRC) vid Medical College of Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI. Användning av humana perifera mononukleära blodceller (PBMC) godkändes av den institutionella granskning Board (IRB) för blod Research Institute i Wisconsin blod Center, Milwaukee, WI.
1. möss, cellinjer och vektorer
- Erhålla C57BL/6 möss från kommersiella leverantörer. Underhålla mus kolonierna i patogenfria villkor och använda kvinnliga och manliga möss i åldrarna 6 och 12 veckor. Erhålla avidentifierad mänskliga PBMC från IRK-godkända källor.
- Söva djuren med en blandning av 20-30% v/v isofluran i propylenglykol (1, 2-propandiol, USP grade) att söva möss. Tillämpa vet salva till ögonen att förhindra torrhet medan mössen är under narkos.
- För att avliva djuren, utföra cervikal dislokation efter induktion av anestesi.
- Hindra möss genom att greppa fast basen av svansen med ena handen. Placera en robust stick-typ penna eller tummen och pekfingret av den andra handen mot baksidan av halsen, vid basen av skallen.
- För att producera störningen, Skjut den hand fasthållande huvudet av djuret framåt och trycka ner samtidigt som du drar bakåt med handen som håller svansen bas. Kontrollera effektiviteten i störningen av känsla för en separation av cervikal vävnad.
- Hålla djuren i kammaren/buren minst 5 minuter och ta bort dem bara när andnings aktivitet är frånvarande eller när det finns en brist på ett påvisbart hjärtslag.
- Få K562 och YAC-1 celler från kommersiella leverantörer och behålla dem i RPMI1640 medium innehållande 10% Värmeinaktiverade FBS. Testa dessa cellinjer regelbundet för att utesluta möjligheten av mycoplasma kontaminering.
2. upprättande och titrering av lentiviral vektorer
- Kultur 5 × 106 293T celler med övernattning i en T75 cm2 kolv som innehåller en lösning av 20 mL RPMI1640 medium med 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 1 mM natrium pyruvat, 5% 7,5% natriumbikarbonatlösning och 0.001% Β-merkaptoetanol. Placera kolven i ett 37 ° C inkubator infunderas med 5,2% CO2.
- Skörda de 293T cellerna använder trypsin (0.025%)/EDTA (1 mM) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt 5 mL av Trypsin/EDTA i PBS och inkubera kolvar i 10 min i en 37 ° C en inkubator för att avskiljandet av 293T celler från T75 cm2 kolvar.
- Samla de fristående cellerna och tvätta dem två gånger i PBS att avlägsna alla spår av trypsin och EDTA. Räkna cellerna med en hemocytometer och justera cell nummer och en miljon celler per mL.
- Transfect 293T celler18 med 3,95 µg av psPAX2, 1,32 µg av pMD2G och 5,26 µg av pLEP-GFP-Puro (genereras internt på BRI av kloning EF1alpha promotorn från pWPI i stället för en CMV promotor i pLenti CMV-GFP-Puro)19.
- Förbereda 1 mL av 150 mM NaCl plus 63 µL av 0,6 mg/mL polyethylenimine (PEI; 25.000 kD, linjär). Blanda väl och tillsätt plasmidsna och blanda. Inkubera i 20 min i rumstemperatur och sedan lägga till celler.
- 16 h efter transfection, Ersätt transfection mediet med färska medium plus 4,5 mM natrium butyrate. Skörda supernatanten innehållande virus 48 h efter transfection och koncentrera sig genom natten centrifugering vid 5.000 × g. Se tabellen material.
- Bestämma var viral titrarna med 293T celler genom att utföra seriespädningar och analys av flöde flödescytometri 72 h efter transduktion20. Använda uttrycket av grönt fluorescerande protein (GFP) som en åtgärd för att kvantifiera de virala titrarna.
3. rening och expansion av murina primära NK-celler
- Rena murina primära NK celler21. Kort, passera encelliga mjälte suspensioner genom nylon ull kolumner att tömma de vidhäftande populationer bestående av B-celler och makrofager.
- Kultur icke-anhängare befolkningarna elueras från nylon ull kolumnen som innehåller murina NK-celler med 1000 U/mL interleukin (IL) -2 i RPMI1640 medium med 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 1 mM natrium pyruvat, 5% 7,5% natriumbikarbonat lösning och 0.001% β-merkaptoetanol (RPMI1640 komplett medium).
- Ändra mediet från kolvar på dag 4 av denna kultur att ta bort icke-anhängare T och NKT-celler; celler att förbli vidhäftat till kolvar är till stor del NK celler. Tillsätt 20 mL färsk RPMI1640 komplett medium och 1000 U/mL IL-2 att fylla behållarna.
- Kontrollera renhet murina NK cellkulturer på dag 7 av flödescytometri med NK cell-specifika markörer20 använda preparat med mer än 95% av CD3–NK1.1+ befolkning.
4. rening och utvidgning av människans primära NK-celler
- Isolera PBMC genom täthetlutning från buffy rockera av friska frivilliga försökspersoner. Kort, noggrant lager 35 mL av halv-utspädd (HBSS) celler över 15 mL täthetlutning i en 50 mL kanoniska tub. Centrifugera vid 400 × g i 30 min. vid 20 ° C i en svängande hink rotor utan broms.
- Använd kommersiella antikroppsbaserade negativa urval kit för att rena humana primära NK celler enligt tillverkarens protokollet.
- Efter isoleringen, bestämma renheten av NK cell förberedelserna av immunofluorescens analyser. Fläcken NK cell preparat med 2 µg/mL anti-CD3 och 2 µg/mL anti-CD56 antikroppar vid 4 ° C för 20 min. Tvätta cellerna två gånger med PBS NK cellpopulationer bestäms av avsaknad av CD3 och förekomsten av CD56 på cellytan.
- Inkubera cell förberedelserna med antikroppar i 20 min vid 4 ° C, tvätta med PBS och analysera i en flödescytometer. Använda NK cell preparat med mer än 85% renhet för den gen transduktion analyser20.
5. transduktion av murina och mänskliga primära NK celler med lentivirus
- Avbryta mus eller människans primära NK-celler i en 24-well platta på 0,5 × 105/ml medium i närvaro av GFP lentivirus supernatant vid 5, 10 och 20 multiplicity av infektion (MOI) och i närvaro av Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL) eller dextran (8 µg/mL).
- Centrifugera plattorna vid 1000 × g i 60 min.
- Utan dekantering supernatanten, odla cellerna över natten (16-18 h) i en 37 ° C inkubator infunderas med 5,2% CO2.
- Skölj med 10 mL PBS och resuspendera i 2 mL komplett RPMI1640 odlingsmedium i närvaro av IL-2 (300 U/mL).
- Testa mänskligt och musen primära NK cellmedierad cytotoxicitet mot K562 och YAC-1, respektive genom att utföra 51krom (Cr)-release analyser på varierade effektor-till-mål-cell nyckeltal22.
- Kortfattat, ge en miljon mål celler 50 µCi av radiomärkt natrium kromat 51Cr. Under 4 h inkubation, de upptag 51Cr till cellulära proteiner. I slutet av ruvning, tvätta cellerna för att ta bort några personliga etikett.
- Beräkna specifik tumör cell lysis av mängden absoluta, spontan och experimentella utgåvan 51Cr från målceller.
Obs: Vid beräkningen av procentandelen av specifika Lys från pentaplicate experiment gjordes med hjälp av följande ekvation: % specifika lysis = ((51Cr menar experimentell utsättning - 51Cr genomsnittlig spontana release) / (51Cr menar maximal release - 51Cr menar spontana release)) х 100, där ”51Cr genomsnittlig spontana release” är den 51Cr släppt från målceller i avsaknad av NK-celler och ”51Cr genomsnittlig maximal release” är den 51Cr befrias från målceller vid Lys av 2 N saltsyra (HCl).
- Harvest transduced NK-celler på dag 7 genom att knacka på kolvar.
- Aktivera de skördade cellerna med titrerad koncentrationer av plattan-bundna anti-NKG2D (A10) mAb genom beläggning 96 brunnar, högt protein-absorberande polystyrenplattor med 2,5 µg/mL koncentrationen av anti-NKG2D mAb över natten.
- Tvätta vart bra med 100 µL av PBS tre gånger före tillsats av primära NK-celler.
- Samla cellkulturer med flerkanalig pipett mellan 16 och 18 h efter aktivering att kvantifiera cytokiner såsom IFN-γ. Generera standard kurvor med hjälp av rekombinant cytokiner som medföljer enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.
- Testa den NK cellviabilitet använder annexin-V/7-amino-actinomycin D (7-AAD) färgning23 och avgöra procenten av nekrotiska celler bland transformerad NK-celler med hjälp av en flödescytometer.
- För att utföra denna analys, skörd murina och mänskliga NK cells fyra dagar efter transduktion, tvätta två gånger med 10 mL kall PBS vid 500 × g i 5 min varje och inkubera med en Annexin-V (PE) / 7-AAD kit.
- Använda lämpligt flöde flödescytometri programvara för att analysera data. Välj live-cell befolkningen och analysera uttryck för god Jordbrukarsed (FITC kanal) som ett mått på viral transduktion24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dextran inducerar den effektiv genöverföring av lentiviral vektor i primära mänskliga och murina NK-celler
Mänskliga NK celler var isolerade och renade från PBMC (med en renhet av mer än 85%) och inkuberas över natten med rIL-2 300 U/mL. Dessa primära NK-cellerna var sedan sensorik med GFP lentivirus på varierad multiplicities av infektion (MOI; 3, 10 och 20 IE per cell) i 24 brunnar i närvaro av 8 µg/mL Pb, PS eller dextran. Cellerna var centrifugeras vid 1000 × g i 60 min och odlade (i närvaro av virus) över natten vid 37 ° C i en CO2 inkubator. Cellerna var tvättas och resuspended i färsk RPMI1640 komplett medium med rIL-2 300 U/mL i sju dagar. Transduktion effektivitet utvärderades av flödescytometri för god Jordbrukarsed uttryck sju dagar efter transduktion. Resultaten visar att dextran ökar effektiviteten i lentiviral transduktion i mänskliga NK celler och ökar viral titern, som också kan förbättra andelen sensorik NK-celler (figur 1).
Murina NK-celler var isolerade och odlade enligt beskrivningen i tidigare avsnitt. Det ovanstående protokollet användes för att analysera och jämföra transduktion effektivitet Pb, Ps och dextran. Resultaten i figur 2 visar att dextran kan öka effektiviteten i lentiviral vektorer jämfört med Pb eller PS.
Transduktion av NK-celler med dextran påverkar inte deras förmåga att medla effektor funktioner
Sensorik mänskliga och murina NK celler cytotoxiska kapacitet undersöktes av 51Cr-release analyser mot K562 och YAC-1 som målceller. Resultaten presenteras i figur 3a och b avslöjar att transduktion av NK-celler av dextran inte negativt påverkar dödande potential av NK celler jämfört med icke-sensorik NK-celler. Dessutom analyserades cytokin produktion från sensorik primära NK-celler. IFN-γ generation mättes med ELISA. Sensorik mänskliga primära NK celler var samtidig odlade med K562 för 24 h och supernatanterna samlades till åtgärd IFN-γ. Resultaten presenteras i figur 4a avslöjar att dextran har ingen inverkan på förmågan av sensorik NK-celler att producera cytokiner. Som en oberoende validering aktiverades sensorik NK-celler med titrerad koncentrationer av plattan-bundna anti-NKG2D (A10) mAb 18 h. cellkulturer samlades, och IFN-γ generation mättes med ELISA. Resultaten visas i figur 4b visar att transduktion av murina NK-celler med dextran har ingen effekt på deras förmåga att producera cytokiner.
Transduktion av NK-celler med dextran påverkar inte deras cellernas viabilitet
Påverkan av Pb, PS eller dextran på viabilityen av sensorik NK-celler utvärderades med hjälp av en propidium jodid (PI) analys och efterföljande flödesanalyser. Resultaten i figur 5a och b visar att, även om transducing primära mänskliga och mus NK celler med virus kan inducera nekros i ca 20% av NK-celler, tillägg av dextran inte föröka denna nekros jämfört med Pb eller PS.
Statistiska analyser utfördes med en två oparade Students t-test. P -värden ≤ 0,05 ansågs betydande.
Figur 1: Dextran har en verkningsgrad på transduktion mänskliga primära celler, NK.
Primära mänskliga NK celler omformades med MOI i 3, 10 eller 20 IU/cell och var odlade för sju dagar i närvaro av Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL), eller dextran (8 µg/mL). Procentandelar av GFP-positiv NK celler bestämdes genom flödescytometri på dag sju efter transduktion. En av tre oberoende experiment visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Dextran har en verkningsgrad på transduktion i murina NK-celler.
Primära murina NK-celler omformades med en MOI av 30 IU/cell och var odlade för sju dagar i närvaro av Pb (8 µg/mL), PS (8 µg/mL), eller dextran (8 µg/mL). Procentandelar av GFP-uttryckande celler bestämdes genom flödescytometri sju dagar efter transduktion. En av tre oberoende experiment visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Dextran ändrar inte NK cell-medierad cytotoxisk aktivitet transformerade celler.
Primära NK celler omformades med en MOI av 10 IU/cell och odlade för sju dagar. YAC-1 och K562 användes som målceller för att avgöra de cytotoxiska potentialerna av murina (a) och mänskliga (b) NK-celler, respektive. De data som visas är företrädare för två oberoende experiment. De data som visas är medelvärden med SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: Dextran förändrar inte den IFN-γ-produktionen av primära NK-celler.
(a) murina NK-celler var sensorik med en MOI 30 IE/cell och odlade i sju dagar. NK-celler stimuleras med 2,5 µg/mL plattan-bundna anti-NKG2D antikropp för 18 h och IFN-γ kvantifierades i cellkulturer med ELISA. (b) sensorik mänskliga NK celler odlades med K562 celler för 24 h och den IFN-γ-produktionen mättes i cellkulturer. De uppgifter som presenteras är representativa för tre oberoende experiment. De data som visas är medelvärden med SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: Transduktion av NK-celler med dextran förändrar inte deras cellviabilitet.
Lönsamheten för transformerade mänskliga (a) och mus (b) NK-celler kvantifierades efter färgning för Annexin-V (PE) / 7-AAD positiva celler. De data som visas är medelvärden med SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie visar att användning av dextran som en katjoniska polymer agent effektiviserar lentiviral transduktion både murina och människans primära NK-celler. Dessutom har andra katjoner, såsom Pb eller PS, ingen märkbar effekt på leverans av virala vektorer i människans primära NK-celler. Det har tidigare visats att Pb kan öka genen transduktion i mänskliga T celler17. Dessa resultat antyder dock att varken Pb eller PS har en liknande effektivitet på människans primära NK-celler. I denna studie, Pb förbättrat transduktion effekten bara blygsamt i murina NK-celler. Det har visat att hämning av intracellulära antivirala försvarsmekanismer använder BX795, en hämmare av TBK1/IKKɛ och PS som en förstärkare kan öka de lentiviral transduktion effektivitet25. Resultaten visade dock att denna hämmare har ingen effekt på transduktion effekten i murina eller människans primära NK-celler (inga data anges).
Resultaten visar att dextran kan inducera den effektiva transduktion primära mänskliga och mus NK-celler, medan PS och Pb har ingen effekt. Resultaten visar också att dextran inte förändrar funktionerna effektor av NK-celler, såsom anti-tumör cytotoxicitet och produktionen av proinflammatoriska cytokiner. Dessa resultat visar således att lönsamheten för dessa primära NK-celler inte har ändrats genom användning av dextran.
Flera studier analyseras och jämförs transduktion effektivitet retrovirala vektorer med olika katjoniska polymerer, med varierat resultat26,27,28. En tidigare studie jämfördes transduktion effekten av dessa polymerer med lentiviral vektorer; dock detta testades i CD4+ T cells16. I en av dessa studier har visats det att Pb har en bättre kapacitet på transduktion på transformerade B och dendritiska celler jämfört med dextran26. En annan studie har det visat att dextran underlättar en högre transduktion effektivitet än andra smakförstärkare i mänskliga B-celler och T-celler16. Den aktuella studien är först i sitt slag, att vår kunskap, som analyseras och jämförs transduktion kapaciteten av olika polymerer i både mänskliga och murina primära NK-celler.
Dextran-baserade gen transductions kan kräva ett minimum av två rundor av transductions. Dessa resultat visar att en omgång av signaltransduktion är tillräckligt för att nå upp till 40% av positivt sensorik celler, som ökas upp till 100% efter två rundor av transduction (inga data anges). En av de största utmaningarna transducing NK-celler är förmågan hos dessa celler att bevara uttrycket av genen transduced. Aktuella resultat visar att transduktion av primära NK-celler med dextran är stabil och att NK-celler som odlas i närvaro av IL-2 kan behålla vektorn och underhålla transgenens uttryck i fyra veckor (inga data anges). Ytterligare experiment krävs att analysera transduktion effektivitet och granska det samtidiga uttrycket av flera transgener.
Den kliniska effekten av immun cellbaserade cancerbehandlingar valideras av flera institutioner. BIL-sensorik T-celler ge förnyade löfte för sjukdom - och återfall-fri återvinning av cancerpatienter jämfört med konventionell behandling. Som en del av medfödda immunsvar kräver NK-celler inte tidigare sensibilisering att medla deras effektor funktioner, inklusive anti-tumör cytotoxicitet. På grund av deras snabba svar är NK-celler en idealisk effektor lymfocyter delmängd att medla en effektiv cellbaserade cancer immunoterapi. Trots deras positiva attribut i tumör erkännande och eliminering begränsa de tekniska hindren om genmanipulation att leverera transgener största kliniska utilizationen av NK-celler.
Elektroporation mRNA för exogena genuttryck är mycket effektiv och har bättre utfall. MRNA-verktyget är dock begränsad, eftersom de tillåter endast övergående uttrycket av gener av intresse och därmed är inte lämpliga för kliniska tillämpningar. Den retrovirala transduktion av NK-celler är mindre effektiva eftersom det kräver flera rundor av transduktion; Dessutom kan inte retrovirala vektorer transduce i icke-dela celler. Den enda lovande strategin för stabil transgenens leverans är användningen av lentiviral vektorer.
Sammantaget ger denna studie en effektiv metod för att leverera transgener i primära NK-celler, utan att försämra deras effektor-funktioner. Detta protokoll gör NK cell-baserad cancer immunoterapi högeffektiv och gäller för framväxande kliniska prövningar. Framtida experiment behövs för att validera effekten av denna metod i NK cell-baserad cancer immunterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna hävdar utan ekonomiska intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Lucia Sammarco och hennes Lulus lemonadstånd för inspiration, motivation och stöd. Detta arbete var stöds delvis av NIH R01 AI102893 och NCI R01 CA179363 (S.M.); NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (LARSSON); Alex Lemonade Stand stiftelsen (Swärd); HRHM programmet för fonden MACC (S.M.; S.R.; M.S.T); Stiftelsen Nicholas familj (Swärd); Familjen Gardetto (Swärd); de Hyundai Scholars Program (M.S.T.); Hyundai hoppas på hjul (S.R.); MACC fonden (M.S.T. och S.M.); Children's Research Institute, MCW (S.R.); och Kathy Duffey Fogerty Award (M.J.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
| polybrene (Pb) | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| protamine sulfate (PS) | Sigma-Aldrich | p3369 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATALANTA | S11150 | |
| Penicillin | Corning | 30-001-CI | |
| B-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | |
| sodium pyruvate | Corning | MT25000CI | |
| Interferon gamma (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
| Propidium lodding staining solution | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| Isoflurane | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| NK cell negative selection kit | Stem Cell | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| Mice | Jakson | 664 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| T75 flasks | Cornnig | 430641U | |
| antibody-based negative selection kits | Stem Cell | 19055 | |
| 51Chromium (Cr)-release assays | perkin elmer's | NEZ030 | |
| ELISA kits | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| Sodium Butyrate | Sigma | 5887-5G | |
| Linear polyethylenimine | polysciences | 23966-2 | |
| Ficoll | GE Life Science | 17-1440-03 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV |
References
- Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
- Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
- Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
- Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
- Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95 (2014).
- Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94 (2016).
- Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
- Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
- Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
- Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
- Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
- Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
- Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
- Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
- Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
- Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529 (2009).
- Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
- Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
- Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
- Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
- Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
- Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
- Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
- Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
- Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).
