Abstract
Den bløde agar overlay teknik blev oprindeligt udviklet over 70 år siden og har været meget anvendt i flere områder af mikrobiologisk forskning, herunder arbejdet med bakteriofager og bakteriociner, proteinholdige antibakterielle midler. Denne fremgangsmåde er relativt billig, med minimale ressourcekrav. Denne teknik består i spotting supernatant fra en donor stamme (potentielt huser en toksisk forbindelse (r)) på en størknet blød agar overlay, der podes med en bakteriel test stamme (potentielt følsomme overfor den toksiske forbindelse (r)). Vi udnyttede denne teknik til at screene et bibliotek af Pseudomonas syringae-stammer for intraspecifikke drab. Ved at kombinere denne tilgang med præcipitationstrin og målrettede gendeletioner, kan flere toksiske forbindelser, fremstillet ved den samme stamme differentieres. De to antagonistiske midler, der almindeligvis inddrives ved hjælp af denne teknik er bakteriofager og bakteriociner. Disse to midler kan differentieres ved anvendelse afto simple yderligere tests. Udførelse af en seriel fortynding på en supernatant indeholdende bakteriofag vil resultere i individuelle plaques bliver mindre i antal med større fortynding, hvorimod seriefortynding af en supernatant indeholdende bacteriocin vil resultere en clearing zone, der bliver ensartet mere uklar med større fortynding. Derudover vil en bakteriofag producere en klaringszone når spottet på en frisk blød agar overlay podet med den samme stamme, hvorimod en bakteriocin ikke vil producere en klaringszone når den overføres til en frisk blød agar græsplæne, som følge af fortyndingen af bakteriocin.
Introduction
For nylig har der været en betydelig interesse i at uddybe vores forståelse af mikrobiel økologi (især microbiomes af forskellige miljøer), samt nye antibakterielle forbindelser til brug i bekæmpelsen af antibiotika-resistente patogener 1,2. En forbindende tema mellem disse interesser er forståelse antagonistiske samspil mellem bakteriestammer i deres naturlige miljø. Der er mange måder, hvorpå bakterier modvirker konkurrenter 3. Bakteriociner, en forskelligartet gruppe af proteinholdige, antibakterielle forbindelser, har længe været undersøgt for deres rolle i at mediere interbacterial antagonisme, med to af de mest undersøgte arter bliver Pseudomonas aeruginosa 4,5 og Escherichia coli 6, vigtige humane patogener. Foruden bakteriociner, kan inducerede profager også fungere som anticompetitor midler, så en stamme at invadere ind i en niche, der allerede koloniseret 7. Pseudomonas syringae er et plantepatogen kendt for at producere et array af antimikrobielle stoffer, herunder enkelt protein bakteriociner 8, bakteriofaghaleproteinerne-afledte bakteriociner 9 (betegnet tailocins), samt ikke-proteinholdige sekundære metabolitter 10. For nylig har der været interesse for at forstå, hvordan disse antimikrobielle stoffer påvirker økologi af denne organisme, samt hvordan de kan udnyttes til at styre plantesygdom 11.
En almindeligt anvendt fremgangsmåde til at undersøge begge bakteriociner og bakteriofag er soft-agar overlay teknik. Denne fremgangsmåde blev først beskrevet af Gratia i 1936 til støtte i optælling bakteriofag 12,13.
Her beskriver vi anvendelsen af den bløde agar overlay metode, i kombination med målrettet genetisk manipulation og polyethylenglycol (PEG) udfældning, at skelne mellem tre forskellige antimikrobielle midler (en bakteriofag, en høj molekylvægt Bacteriocin, og en lavmolekylær bakteriocin) frembragt af en enkelt bakteriestamme. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at det er relativt enkel og billig, hvilket er grunden til, selv om den er decideret 'low-tech ", er det stadig almindeligt brugt.
Protocol
1. Fremstilling af Supernatant der skal testes for aktivitet
- Der fremstilles en 0,5 mg / ml stamopløsning af mitomycin C ved at opløse den passende mængde i sterilt 0,1 M MgSO4 puffer (eksempelvis 1 mg mitomycin C / 2 ml puffer). Store lager ved 4 ° C i en lys beskyttet beholder (mitomycin C er lysfølsomt).
- Podes en enkelt koloni af P. syringae i 3 ml Kings medium B (KB) bouillon 14. Inkuber natten over under omrystning (200 rpm) ved stuetemperatur (21-25 ° C).
- Den følgende morgen, fortyndes bouillon kulturen 1/100 i 3 ml frisk KB bouillon. Inkuber i 3-4 timer med omrystning ved stuetemperatur. Tilføj mitomycin C (0,5 ug / ml, slutkoncentration). Inkuber kulturen natten over under omrystning ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Mitomycin C forårsager dobbeltstrengede DNA-brud og derved stimulere cellens SOS respons, hvilket fører til produktion af både bakteriofag og bakteriociner. - Pellet 1-2 ml mitomycin C inducerede kulturer ved centrifugering ved 20.000 x g i 5 minutter i en bænk top mikrocentrifuge.
- Fjern og sterilisere kultursupernatanter enten ved at føre supernatanten gennem et 0,22 um porestørrelse filter eller ved behandling af supernatanten med chloroform (100 pi chloroform per 1 ml supernatant).
- Hvis anvendelse af chloroform, vortexes blandingen i 15 sekunder og lad inkubere ved stuetemperatur i 1 time. Efter inkubering centrifugeres blandingen ved 20.000 xg i 5 min.
BEMÆRK: Chloroform effektivt dræber celler ved solubilisering deres membraner. Fordelen ved anvendelse af chloroform i løbet af filtersterilisering er, at det er billigere og lettere at skalere op, hvis forarbejdning mange (> 20) prøver ad gangen. Der kan være en mulighed, at en given celledræbende aktivitet er tabt efter chloroform behandling som følge af partitionering i den organiske fase. - Fjerne den øverste, vandige fase ved anvendelse af en 1 ml pipette til et frisk, sterile 1,5 eller 2,0 mlmikrofugerør. Pas på ikke at overføre nogen af de nedre chloroformlaget (det er bedre at fjerne mindre af den vandige fase for at undgå carry-over).
- Inkubér den overførte supernatant udjævnede i et stinkskab for at tillade den resterende chloroform at fordampe (flere timer). Opbevar supernatanter ved 4 ° C.
- Hvis anvendelse af chloroform, vortexes blandingen i 15 sekunder og lad inkubere ved stuetemperatur i 1 time. Efter inkubering centrifugeres blandingen ved 20.000 xg i 5 min.
2. Separation og koncentration af højmolekylær baktericide forbindelser ved polyethylenglycol (PEG) Udfældning
- Til den sterile supernatant, tilsæt NaCI og PEG 8000 til 1 M og 10% slutkoncentrationer henholdsvis. Bland prøven indtil både NaCI og PEG er fuldstændig opløst. Inkuber prøver i et isbad i 1 time eller natten over ved 4 ° C.
- Centrifuger prøverne ved 16.000 xg i 30 min ved 4 ° C. En pellet bør danne i bunden af centrifugeglasset. Dekanteres og pellet resuspenderes i ønskede lydstyrke (såsom 1/10 eller 1/100 af den oprindelige supernatant volume) buffer (10 mM Tris, 10 mM MgSO4, pH 7,0) ved gentagen pipettering.
- Fjerne resterende PEG ved to sekventielle ekstraktioner med et tilsvarende volumen af chloroform.
- Kombiner chloroform med den resuspenderede pellet og vortex i 10 til 15 sek, derefter centrifugeres blandingen ved 20.000 xg i 5 min. Overfør den øverste, vandige fase til et frisk mikrofugerør. Denne ekstraktion gentages indtil intet hvidt grænseflade mellem den vandige og organiske fase er synlig (normalt 2 ekstraktioner alt). Tillad resterende chloroform at fordampe fra ekstraherede supernatanter i et stinkskab.
3. Udarbejdelse af Overlay og Testing Supernatanter til aktivitet
- Inokulere en enkelt koloni af en P. syringae-stamme, der skal testes for følsomhed i 3 ml KB, inkuberes natten over med omrystning ved stuetemperatur.
- Den følgende morgen, tilbage fortynde kulturen 1/100 i frisk KB. Inkuber 3-4 timer med omrystning ved room tempere.
- Forbered steriliseret vand agar ved autoklavering en suspension 0,35-0,7% (vægt / volumen) agar i ultrarent vand.
BEMÆRK: En bestand af blødt vand agar kan smeltes i en mikrobølgeovn og genbruges flere gange, betyder frisk overlay ikke behøver at være forberedt på hvert forsøg. Hvis vandet agar genbruges, er det afgørende at sikre, at det er helt smeltet efter microwaving. Hvis ikke, vil overlay have en kornet tekstur på størkning, der vil gøre fortolkning vanskeligt. Hvis dette sker, smelte agar i flere minutter længere i mikrobølgeovnen end gjort tidligere. - Opretholde den smeltede blød agar i en 60 ° C vandbad før brug. Anvendelse af en steril serologisk pipette, overførsel 3 ml blød agar til et sterilt kultur rør. Retur kulturen rør til vandbad for at opretholde i en smeltet tilstand.
- At hælde overlay, først tillade det smeltede agar til afkøling (det skal føles varm, men ikke varmt at røre), men tillader ikke at størkne.
- I en steril hætte, pode 100 pitesteren stamme kultur ind i blød agar og vortex at blande. Drej kultur i hånden for 10-15 sek, så hæld på en bund agar (KB agar). Vip pladen i alle retninger for at sikre den bløde agar jævnt dækker bunden agar.
BEMÆRK: Den nederste agar kan være enhver størknede (1,5% agar) medium, som testen stammen vokser kraftigt. For en standard 100 mm petriskål, bruge ~ 20 ml smeltet medium. Bunden agar kan fremstilles flere uger før tid (hvis holdt ved 4 ° C uden tørring) eller kan fremstilles samme dag. Hvis forberedt samme dag som udfører overlay, er det bedst at gøre det før trin 3.4. - Dæk pladen og lad det 20-30 min at størkne. Pas på ikke at forstyrre pladen mens solidifying.
- Når størknet, spot 2-5 pi supernatant (genereret i §§ 1 og 2, ovenfor) på overlay. Tillad pladerne inkuberes natten over ved stuetemperatur. Observere og registrere resultater den følgende morgen.
BEMÆRK: Detkan være nyttigt at udføre og plet fra en seriel fortynding af supernatanten. Dette vil give forskerne at skelne mellem bakteriofager og bacteriocin clearing aktivitet. I dette tilfælde anbefales det at udføre 1: 5 eller 1:10 fortyndinger.
Representative Results
Kombinationen af den bløde agar overlay og PEG fældning kan anvendes til at identificere og karakterisere forskellige antimikrobielle stoffer produceret af den samme stamme. Figur 1 viser to stammer af P. syringae (A og B), der inhiberes af en tredje stamme af den samme art. De to stammer imidlertid inhiberes af forskellige bakteriociner. Udligningen zone på stamme A udviser en skarp kant, mens clearing zone på stammen B er større, og udviser en ikke-skarp grænse. Genetiske manipulationer inden den producerende stamme, der specifikt inaktiverer enten tailocin (tailocin mangelfuld) eller lavmolekylært bacteriocin (bacteriocin mangelfuld) bekræfter, at stammer A og B er følsomme over for forskellige bakteriociner. Figur 2 viser, bakteriofag-medieret drab kan skelnes fra andre ikke-replikative antimikrobielle stoffer ved at sammenligne en fortyndingsserie. Fordi begge bakteriociner ogprofag kan induceres af mitomycin C behandling, kan aktiviteter af disse to midler ligner hinanden (især hvis det aktiverede fag er rigeligt). I tilfælde af bakteriofag-medieret clearing, vil fortynding af supernatanten løse i individuelle plaques (nulstil zoner), mens bakteriocin-medieret clearing ikke vil løse i sådanne plaques.
Figur 1: Fænotypisk skelnen af multiple antimikrobielle stoffer produceret af den samme stamme. Stamme A er følsom for en højmolekylær bakteriocin (tailocin), men ikke et alternativ med lav molekylvægt bakteriocin, som det fremgår af manglende rydning i tailocin deficiente stamme, men ikke bakteriocin deficient stamme. Omvendt stamme B er ufølsom over for tailocin, men er følsom over for lavmolekylære bakteriocin. Den tailocin er effekiently inddrives efter PEG nedbør, mens lavere molekylvægt bakteriociner er ikke. WT = vildtype. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: At skelne mellem ikke-replikative antimikrobielle stoffer og bakteriofager. (A) Fortynding af en høj titer af bakteriofager resultaterne hos de individuelle plaques, der bliver mindre talrige (høj titer top, lav titer nederst). (B) Fortynding af bakteriociner resultater i ensartet mindre clearing, der ikke løser i individuelle plaques. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den bløde agar overlay teknikken beskrevet her har været almindeligt anvendt i mange årtier af forskere interesseret i bakteriofager eller bakteriociner. De vigtigste fordele ved denne tilgang er, at den er enkel, billig og relativt let at fortolke. Ved at kombinere den bløde-agar overlay med PEG nedbør og seriel fortynding, kan antimikrobielle stoffer adskilles i høj vs. lavmolekylære stoffer, og replikative vs. ikke-replikativ midler (dvs. bakteriofager vs. tailocin henholdsvis). Endelig kan inkorporering af målrettet genmanipulation (udgår og komplementering) af formodede bacteriocin eller profag loci fast fastslå identiteten af en given antagonistisk forbindelse. Vi har for nylig brugt denne metode til at beskrive en ny bakteriofag-afledt bakteriocin udbredt blandt Pseudomonas syringae stammer 9.
De vækstmedier og betingelser i denne protokol arbejde godt for Pseudomonas syringae og ville sandsynligvis være tilstrækkeligt for andre gram-negative bakterier, der vokser kraftigt under disse betingelser. forskere ved hjælp af denne metode vil imidlertid ønsker at optimere timingen, dyrkningsmediet, induktionsmetode, og inkubation temperatur i deres system. De kritiske parametre omfatter inducere den producerende kultur, mens i den logaritmiske vækstfase, samt podning af soft-agar overlay med tilstrækkelig logaritmisk kultur for at sikre en ensartet bakteriel fordeling, men ikke overdreven kultur, hvilket skjuler potentielle clearing zoner. Der er mange bakteriociner, der ikke induceret som en del af SOS respons, men snarere induceres gennem peptidbaserede quorum sensing systemer (især grampositive bakteriociner 15), således kan en forsker ønsker at screene flere forskellige induktionsmetoder (såsom modificering næringsindholdet inducere medium, eller giver mulighed for udvidet inkubation af den producerende stamme).
Ved brugdenne teknik, skal den bløde agar overlay grundigt smeltet og holdt ved 55-60 ° C før tilsætningen af seeding stamme. Vi har haft flere eksperimenter, hvor den bløde agar ikke blev grundigt smeltet (selvom visuelt det syntes at være) og resulterede i en overlejring med et kornet udseende. Resultater fra et kornet overlejring kan stadig være generelt fortolkelige, men dette er afhængig af styrken af inhiberingen (svagere inhibering vil være vanskeligere at observere). En endelig, confounding variable skal overvejes ved brug af denne teknik er, at temperaturen af det smeltede agar tillades tilstrækkelig tid til at afkøle før inokulering med seeding stamme, for at undgå at dræbe seeding stamme. For at undgå dette problem, sikrer vi den bløde agar er varm, men ikke varmt, at røre ved. Langs disse linjer, har vi også observeret, at hvis vi giver utilstrækkelig tid til en såning kultur at akklimatisere sig til det smeltede agar, før hælde overlay, vi genvinde generelt dårlig bakteriel gVÆKST, hvilket gør fortolkningen af specifik inhibering vanskeligt eller umuligt at fortolke. Det er derfor, vi tillader 10-15 ekstra sekunder inkubation mellem hvirvelblanding og hælde overlay. Afvejningen mellem opretholde agar i en helt smeltet tilstand (varmere er bedre), men ikke livsfarlige for såning stamme (varmere er ikke bedre) er en, der vil sandsynligvis nødt til at være bestemt af en forsker gennem trial and error.
Hvis der anvendes en PEG-udfældningstrin, vil det være fordelagtigt at indbefatte en negativ kontrol, hvor en steril bouillon medium bearbejdes identisk med kultursupernatanten. Dette vil sikre, at dræbe aktivitet er ikke resultatet af residual PEG eller chloroform i prøven supernatant.
Da begge bakteriofager og bakteriociner tendens til at være meget specifikke, er det ikke ualmindeligt at støde nogen tilsyneladende celledræbende aktivitet med en given kombination af stammer. Dette kan skyldes en række af stamme-specifik resistance mekanismer, det ene er, at testeren stammen enten mangler eller har en ukendt version af receptoren er nødvendig for at målrette med en given bacteriocin eller bakteriofager.
En alternativ metode, har bakteriocin screeningsmetode er beskrevet af Kawai et al. , Men lider ulemper og ikke er blevet udbredt 16. Konkret denne teknik kræver observere bouillon prøver ved tidsintervaller, der kan være belastende, og tillader ikke for forskelsbehandling mellem bakteriofag-afledte og bakteriocin-afledte drab aktiviteter.
De vigtigste begrænsninger ved denne teknik er, at det ikke er velegnet til organismer, som ikke vokser robust (og således vil mangle let skelnelige clearing zoner), eller at harbor profager eller bakteriociner, der ikke robust produceret under laboratorieforhold. Tilpasning af denne teknik til at detektere bakteriociner produceret i miljøprøver ville både udvide anvendelighedenaf denne teknik og lette større indsigt i den rolle, som bakteriociner inden naturlige omgivelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
| Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |
References
- Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics. Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).
- Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. Toward a Predictive Understanding of Earth's Microbiomes to Address 21st Century Challenges. MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).
- Michel-Briand, Y., Baysse, C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa. Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).
- Ghequire, M. G. K., De Mot, R. Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas. FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).
- Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. Colicin Biology. Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).
- Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare. Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).
- Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins. J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).
- Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas. MBio. 6 (4), (2015).
- Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).
- Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. Ecological Genomics of Pseudomonas syringae. Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).
- Panec, M., Katz, D. S. Plaque Assay Protocols. , Available from: Microbelibrary.org at http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3073-plaque-assay-protocols (2013).
- Gratia, A. Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage. Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).
- Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).
- Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces. Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).
