Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bruk av Soft-agar overlegg Technique til skjerm for bakterielt Produserte inhibitorforbindelser

Published: January 14, 2017 doi: 10.3791/55064

Abstract

Den soft-agar overlegg teknikken ble opprinnelig utviklet over 70 år siden og har vært mye brukt i flere områder av mikrobiologisk forskning, herunder arbeid med bakteriofager og bakteriociner, protein antibakterielle midler. Denne tilnærmingen er relativt billig, med minimal ressursbehov. Denne teknikken består av spotting supernatant fra en donor-stamme (potensielt huse en toksisk forbindelse (e)) på en størknet bløt agar overlegg som er podet med en bakterieteststammen (potensielt følsomme for den giftige forbindelse (e)). Vi benyttet denne teknikken for å screene et bibliotek av Pseudo syringae stammer for intraspesifikk drapet. Ved å kombinere denne tilnærming med et utfellingstrinn og målrettede gendelesjoner, kan flere toksiske forbindelser fremstilt ved samme belastning bli differensiert. De to antagonistiske midler som vanligvis utvinnes ved hjelp av denne teknikken er bakteriofager og bakteriociner. Disse to midler kan differensieres ved hjelpto enkle ytterligere tester. Utføre en seriell fortynning på en supernatant inneholder bakteriofag vil resultere i individuelle plakk blir mindre i antall med større fortynning, mens serie fortynning av en supernatant inneholder bakteriosin vil medføre en lysning sone som blir jevnt mer grumset med større fortynning. I tillegg vil en bakteriofag frembringe en tømmesone når prikket inn på en ny myk agar overlegg sådd med den samme belastning, mens et bakteriocin ikke vil produsere en tømmesone når den overføres til en frisk myk agar plen, på grunn av fortynning av bakteriocin.

Introduction

Nylig har det vært betydelig interesse for å utvide vår forståelse av mikrobiell økologi (spesielt microbiomes i ulike miljøer), samt nye antibakterielle forbindelser til bruk i kampen mot antibiotikaresistente patogener 1,2. En sammenhengende tema mellom disse interessene er å forstå antagonistiske interaksjoner mellom bakteriestammer i sitt naturlige miljø. Det er mange måter som bakterier antagoniserer konkurrenter 3. Bakteriociner, en mangfoldig gruppe av protein, antibakterielle forbindelser, har lenge blitt studert for sin rolle som formidler interbacterial antagonisme, med to av de mest studerte artene blir Pseudomonas aeruginosa 4,5 og Escherichia coli 6, viktige menneskelige patogener. I tillegg til bakteriociner, kan induserte prophages også fungere som anticompetitor agenter, slik at en belastning å invadere i en nisje som allerede er kolonisert 7. Pseudo syringae er en plante patogen er kjent for å fremstille en rekke antimikrobielle midler, blant annet enkelt protein bakteriociner 8, bakteriofag hale-avledede bakteriociner 9 (betegnet tailocins), så vel som ikke-proteinholdige sekundære metabolitter 10. Nylig har det vært interesse for å forstå hvordan disse antimikrobielle stoffer påvirker økologien i denne organismen, samt hvordan de kan bli brukt til å kontrollere plantesykdommer 11.

En mye anvendt metode for å studere både bakteriociner og bakteriofag er den myk-agar overlegg teknikk. Denne metoden ble først beskrevet av Gratia i 1936 for å hjelpe til opplisting bakteriofag 12,13.

Her beskriver vi anvendelse av soft-agar overlegg metode, i kombinasjon med målrettet genetisk manipulasjon og polyetylenglykol (PEG) utfelling, for å skille mellom tre forskjellige antimikrobielle midler (en bakteriofag, et høymolekylært bacteriocin, og en lav molekylvekt bakteriocin) produsert av en enkelt bakteriestamme. Fordelen med denne tilnærmingen er at det er relativt enkelt og billig, og det er derfor, til tross for at det er desidert "low-tech", det er fortsatt mye brukt.

Protocol

1. Utarbeidelse av Overstående å bli testet for aktivitet

  1. Fremstille en 0,5 mg / ml stamløsning av mitomycin C ved oppløsning av den passende mengde i sterilt 0,1 M MgSO4 buffer (for eksempel 1 mg mitomycin C / 2 ml buffer). Oppbevares lager ved 4 ° C i en lys beskyttet beholder (mitomycin C er lysfølsom).
  2. Vaksinere en enkelt koloni av P. syringae inn i 3 ml Kongens medium B (KB) kjøttkraft 14. Inkuber over natten med risting (200 rpm) ved romtemperatur (21-25 ° C).
  3. Følgende morgen, fortynne suppen kultur 1/100 inn i 3 ml frisk KB kjøttkraft. Inkuber i 3-4 timer med risting ved romtemperatur. Legg mitomycin C (0,5 ug / ml, sluttkonsentrasjon). Inkuber kulturen over natten med risting ved romtemperatur.
    MERK: Mitomycin C fører til dobbelttrådet DNA pauser, og dermed stimulere cellens SOS reaksjon, som fører til produksjon av både bakteriofag og bakteriociner.
  4. Pellet 1-2 ml mitomycin C indusert kulturer ved sentrifugering ved 20 000 xg i 5 minutter i en benk topp mikrosentrifuge.
  5. Fjern og sterilisere kultursupernatanter, enten ved å føre supernatanten gjennom et 0,22 um porestørrelse filter eller ved behandling av supernatanten med kloroform (100 ul kloroform per 1 ml supernatant).
    1. Ved anvendelse av kloroform, vortex blandingen i 15 sekunder og la inkuber ved værelsestemperatur i 1 time. Etter inkubering, sentrifuger av blandingen ved 20 000 xg i 5 minutter.
      MERK: Kloroform dreper effektivt celler ved å løse sine membraner. Fordelen med å bruke kloroform i løpet av filtersterilisering er at det er billigere og lettere å skalere opp dersom behandlingen mange (> 20) prøver på en gang. Det kan være en mulighet for at en gitt drepende aktivitet går tapt følgende kloroform behandling som følge av oppdeling til den organiske fase.
    2. Fjern det øvre, vandige fasen ved anvendelse av en 1 ml pipette til et friskt, sterilt 1,5 eller 2,0 mlmikrosentrifugerør. Være forsiktig for ikke å overføre noen av de nedre kloroformlaget (det er bedre å fjerne mindre av den vandige fasen for å unngå overheng).
    3. Inkuber overføres supernatanten uten lokk i et avtrekk for å tillate den gjenværende kloroform for å fordampe (flere timer). Oppbevar supernatantene ved 4 ° C.

2. Separering og konsentrering av høy molekylvekt Antibiotiske forbindelser med polyetylenglykol (PEG) Utfelling

  1. Til den sterile supernatant, tilsett NaCl og PEG 8000-1 M og 10% slutt-konsentrasjoner på henholdsvis. Gjentatte ganger invertere utvalget til både NaCl og PEG er helt oppløst. Inkuber prøver i et isbad i 1 time eller over natt ved 4 ° C.
  2. Sentrifuger prøvene ved 16 000 xg i 30 min ved 4 ° C. En pellet bør danne ved bunnen av sentrifugerøret. Dekanter supernatanten og resuspender pelleten i ønsket volum (f.eks 1/10 eller 1/100 av den opprinnelige supernatant vollum) av buffer (10 mM Tris, 10 mM MgSO4, pH 7,0) ved gjentatt pipettering.
  3. Fjerne gjenværende PEG ved to sekvensielle ekstraksjoner med et like stort volum kloroform.
    1. Kombiner kloroform med den resuspenderte pellet og virvle i 10 til 15 sek, sentrifuger deretter blandingen ved 20 000 xg i 5 minutter. Overfør den øvre, vandige fasen til en frisk mikrosentrifugerør. Gjenta dette uttak til noe hvitt grensesnitt mellom den vandige og organiske fasen er synlig (vanligvis 2 utdrag totalt). Tillat rest kloroform å fordampe fra utvunnet supernatanter i en avtrekkshette.

3. Utarbeidelse av Overlay og testing Supernatantene for aktivitets

  1. Inokulere en enkelt koloni av P. syringae en belastning for å bli testet for følsomhet i 3 ml KB, inkuber over natten med risting ved romtemperatur.
  2. Følgende morgen, tilbake fortynne kulturen 1/100 til frisk KB. Inkuber 3-4 timer med risting ved rommet temperare.
  3. Forbered sterilisert vann agar ved autoklavering av en suspensjon 0,35 til 0,7% (w / v) agar i ultrarent vann.
    MERK: Et lager av bløtt vann agar kan smeltes i en mikrobølgeovn og gjenbrukes flere ganger, ikke frisk overlegg ikke trenger å være forberedt for hvert forsøk. Hvis vannet agar brukes på nytt, er det avgjørende å sikre at det er helt smeltet følgende mikrobølgeovnen. Hvis ikke, vil overlegget har en kornete tekstur på størkn som vil gjøre tolkning vanskelig. Hvis dette skjer, smelte agar for lengre i mikrobølgeovn enn tidligere gjort flere minutter.
  4. Opprettholde den smeltede myk agar i et 60 ° C vannbad før bruk. Ved hjelp av en steril serologisk pipette, overføring 3 ml myk agar til en steril dyrkningsrør. Returnere dyrkningsrør til vannbadet for å opprettholde i en smeltet tilstand.
  5. Å helle overlegg, først la smeltet agar avkjøles (det skal føles varmt, men ikke varmt å ta på), men ikke la det stivne.
  6. I en steril hette, inokuler 100 ultesteren belastningen kultur i myk agar og vortex å blande. Roter kultur hånd i 10-15 sek, og hell på en bunnagar (KB agar). Vipp plate i alle retninger for å sikre de myke agar jevnt dekker bunnen agar.
    MERK: bunnagar kan være stivnet (1,5% agar) medium som teststammen vokser kraftig. For en standard 100 mm diameter petriskål, bruker ~ 20 ml smeltet medium. Den nederste agar kan fremstilles flere uker før tiden (hvis opprettholdt ved 4 ° C uten tørking) eller kan fremstilles på samme dag. Hvis forberedt samme dag som utfører overlegg, er det best å gjøre det før trinn 3.4.
  7. Dekk platen og la den 20-30 min for å størkne. Vær forsiktig med å forstyrre platen mens solidifying.
  8. Når stivnet, spot 2-5 mL av supernatant (generert i §§ 1 og 2, ovenfor) på overlegget. Tillat platene inkuberes over natten ved romtemperatur. Observere og rekordresultat i formiddag.
    MERK: Detkan være nyttig for å utføre og øye fra en seriell fortynning av supernatanten. Dette vil tillate forskere å skille mellom bakteriofag og bacteriocin clearing aktivitet. I dette tilfelle anbefales det å utføre på 1: 5 eller 1:10 fortynninger.

Representative Results

Kombinasjonen av den myke agar overlag og PEG-utfelling kan brukes til å identifisere og karakterisere forskjellige antimikrobielle midler som er produsert av den samme stamme. Figur 1 viser to stammer av P. syringae (A og B) som er hemmet av et tredje stamme av den samme art. De to stammene, men inhiberes av forskjellige bakteriociner. Clearing sone på stamme A viser en skarp kant, mens clearing sone på stamme B er større, og viser en ikke-skarp kant. Genetiske manipulasjoner i den produserende stamme som spesifikt inaktiverer enten tailocin (tailocin mangel) eller lav molekylvekt bakteriocin (bakteriocin mangel) bekrefter at stammene A og B er følsomme for forskjellige bakteriociner. Figur 2 viser at bakteriofag-mediert dreping kan skilles fra andre ikke-replikative antimikrobielle midler ved å sammenligne en fortynningsserie. Fordi begge bakteriociner ogprofag kan induseres ved mitomycin C-behandling, kan aktivitetene til disse to midlene ligner hverandre (særlig hvis det aktiverte fagen er rikelig). I tilfellet av bakteriofag-mediert lysning, vil fortynning av supernatanten løse opp i individuelle plakker (tømme soner) mens bakteriocin-mediert lysning ikke løser opp slike plaques.

Figur 1
Figur 1: Fenotypisk skille mellom flere antimikrobielle midler som er produsert av den samme stamme. Stamme A er følsom for en med høy molekylvekt bakteriocin (tailocin), men ikke et alternativ lav molekylvekt bakteriocin, som vist ved mangel på å fjerne i det tailocin mangelfull stamme, men ikke den bakteriocin mangelfull belastning. Omvendt er stamme B ufølsom overfor tailocin, men er følsom for den lave molekylvekt bakteriocin. Den tailocin er efficiently utvinnes etter PEG-utfelling, mens med lavere molekylvekt bakteriociner er ikke. WT = villtype. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Skille mellom ikke-replikative antimikrobielle midler og bakteriofager. (A) Fortynning av en høy titer av bakteriofager resultater i enkelt plakk som blir mindre tallrik (høy titer topp, lav titer nederst). (B) Fortynning av bakteriociner resultater i jevnt mindre rydding som ikke løser inn individuelle plakk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den soft-agar overlegg teknikken beskrevet her har blitt mye brukt i mange tiår av forskere som er interessert i bakteriofager eller bakteriociner. De viktigste fordelene med denne tilnærmingen er at det er enkelt, billig og relativt lett å tolke. Ved å kombinere soft-agar overlegg med PEG utfelling og seriell fortynning, kan antimikrobielle midler separeres i høy sammenlignet med lavmolekylære stoffer, og replikative vs. ikke-replikative midler (dvs. bakteriofag vs. tailocin, henholdsvis). Endelig kan inkorporering av målrettet genetisk manipulasjon (sletting og komplemente) av antatte bakteriocinkomponenten eller profag loci fast etablere identiteten til en gitt antagonistisk sammensatte. Vi har nylig brukt denne metoden for å beskrive en ny bakteriofag-avledet bacteriocin utbredt blant Pseudo syringae stammer 9.

Vekstmedier og betingelser som er angitt i denne protokollen fungerer godt for Pseudo syringae og vil sannsynligvis være tilstrekkelig for andre Gram-negative bakterier som vokser kraftig under disse betingelser. Imidlertid vil forskerne ved hjelp av denne metode vil optimalisere timing, kulturmediet, induksjonsmetode, og inkubering temperatur i deres system. De kritiske parametrene omfatter indusering av den produserende kultur, mens i den logaritmiske vekstfase, i tillegg til poding av soft-agar overlegg med tilstrekkelig logaritmisk fase kultur for å sikre en jevn fordeling bakterie, men ikke overdreven kultur, som vil skjule eventuelle rensesonene. Det er mange bakteriociner som ikke er indusert som en del av SOS respons, men snarere blir indusert gjennom peptid-baserte quorum følersystemer (spesielt grampositive bakteriociner 15), og dermed kan en forsker ønsker å screene flere forskjellige metoder for igangsetting (for eksempel modifiserende næringsinnholdet i-induserende medium, eller slik at for forlenget inkubering av den produserende stamme).

når du brukerdenne teknikken, må det soft-agar legget være grundig smeltes og holdes ved 55-60 ° C før tilsetningen av den seeding belastning. Vi har hatt flere forsøk hvor soft-agar ikke ble grundig smeltet (selv om visuelt det syntes å være), og resulterte i et overlegg med et kornete utseende. Resultater fra et kornete overlegg kan likevel være generelt tolkbare, men dette er avhengig av styrken av inhibering (svakere hemming vil være mer vanskelig å observere). En endelig, som forvirret variabel for å vurdere ved bruk av denne teknikk er at temperaturen av den smeltede agar tillates tilstrekkelig tid til å avkjøles før inokulering med podestamme, slik at man unngår å drepe seeding belastning. For å unngå dette problemet, sikrer vi soft-agar er varmt, men ikke varmt, å berøre. Langs disse linjene, har vi også observert at hvis vi gir utilstrekkelig tid for en seeding kultur for å akklimatisere seg til den smeltede agar, før helle overlegg, gjenopprette vi generelt dårlig bakteriell growth, som gjør tolkingen av spesifikk hemming vanskelig eller umulig å tolke. Dette er grunnen til at vi lar 10-15 ekstra sekunder inkubasjon mellom virvling og helle overlegg. Avveiningen mellom å opprettholde agar i en helt smeltet tilstand (varmere er bedre), men ikke dødelig for seeding stamme (varmere er ikke bedre) er en som sannsynligvis vil trenge å bli bestemt av en forsker gjennom prøving og feiling.

Hvis en PEG utfellingstrinn blir brukt, ville det være fordelaktig å inkludere en negativ kontroll hvor et sterilt medium medium er behandlet identisk til kultursupernatanten. Dette vil sikre at det å drepe-aktivitet er ikke et resultat av gjenværende PEG eller kloroform i prøven supernatanten.

Ettersom begge bakteriofager og bakteriociner tendens til å være meget spesifikk, er det ikke uvanlig å støte på noen åpenbar drepende aktivitet med en gitt kombinasjon av stammer. Dette kan resultere fra en variasjon av stamme-spesifikke gjenmotstandsmekanismer, en er at teststammen enten mangler eller har en ukjent versjon av reseptoren som trengs for målretting av en gitt bakteriosin eller bakteriofag.

En alternativ metode, har bakteriocinet screeningsmetoden er beskrevet av Kawai et al. , Men lider av ulemper og har ikke vært allment vedtatt 16. Konkret krever denne teknikken observere buljong prøver i tidsintervaller som kan være tyngende, og tillater ikke for diskriminering mellom bakteriofag-avledet og bakteriocinløsning-avledet draps aktiviteter.

De viktigste begrensninger i denne teknikk er at det ikke er godt egnet for organismer som ikke vokser robust (og dermed vil mangler lett skillbare rensesonene) eller som havn prophages eller bakteriociner som ikke er robust fremstilt under laboratorieforhold. Tilpassing av denne teknikken til å oppdage bakteriosinene produsert i miljøprøver vil både utvide verktøyetav denne teknikken, og legge til rette for større innsikt i rollen som bakteriociner innenfor naturlige innstillinger.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mitomycin C Santa Cruz Biotechnology sc-3514 Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.
Chloroform Sigma-Aldrich 34854 Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. 
Polyethylene Glycol (PEG) Amresco 0159
Bacteriological grade agar Genesee Scientific 20-274

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics. Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).
  2. Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. Toward a Predictive Understanding of Earth's Microbiomes to Address 21st Century Challenges. MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).
  3. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).
  4. Michel-Briand, Y., Baysse, C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa. Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).
  5. Ghequire, M. G. K., De Mot, R. Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas. FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).
  6. Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. Colicin Biology. Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).
  7. Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare. Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).
  8. Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins. J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).
  9. Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas. MBio. 6 (4), (2015).
  10. Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).
  11. Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. Ecological Genomics of Pseudomonas syringae. Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).
  12. Panec, M., Katz, D. S. Plaque Assay Protocols. , Available from: Microbelibrary.org at http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3073-plaque-assay-protocols (2013).
  13. Gratia, A. Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage. Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).
  14. King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).
  15. Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).
  16. Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces. Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).

Tags

Infeksjon bakterier bakteriofag bakteriosin tailocin antimikrobielle agent bakteriell antagonisme PEG nedbør
Bruk av Soft-agar overlegg Technique til skjerm for bakterielt Produserte inhibitorforbindelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hockett, K. L., Baltrus, D. A. UseMore

Hockett, K. L., Baltrus, D. A. Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds. J. Vis. Exp. (119), e55064, doi:10.3791/55064 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter