Abstract
A eficácia dos tratamentos antibacterianos candidatos deve ser demonstrada em modelos animais de infecção, como parte do processo de descoberta e desenvolvimento, de um modo preferido em modelos que mimetizam a indicação clínica pretendido. Um método para induzir infecções pulmonares robustos em ratos e ratinhos imunocompetentes é descrito que permite a avaliação dos tratamentos em um modelo de pneumonia grave causada por S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, Klebsiella pneumoniae ou A. baumannii. Os animais são anestesiados, e um inoculo de ágar-base é depositado profundamente no pulmão através de intubação intratraqueal não cirúrgico. A infecção resultante é constante e reprodutível, e estável durante pelo menos 48 h e até 96 h para a maioria dos isolados. Estudos com antibacterianos comercializados têm demonstrado boa correlação entre a eficácia in vivo e in vitro susceptibilidade, e concordância entre farmacocinética / farmacodinâmica alvos determinadosneste modelo e alvos clinicamente aceites tem sido observado. Embora não haja um investimento de tempo inicial quando a aprendizagem da técnica, pode ser realizada rápida e eficiente uma vez que a proficiência é alcançada. Benefícios do modelo incluem a eliminação da exigência de neutropenia, o aumento da robustez e reprodutibilidade, capacidade de estudar mais patógenos e isola, maior flexibilidade no desenho do estudo e estabelecimento de uma infecção desafiador em um hospedeiro imunocompetente.
Introduction
Avaliação da eficácia de potenciais candidatos de drogas em modelos animais de infecção é um componente crítico do processo de descoberta de drogas anti-bacteriano. In vivo os estudos de eficácia fornecer dados importantes para toda a extensão dos esforços de descoberta, de elucidar relações estrutura-actividade (SAR) e otimizar série química chumbo através da determinação farmacocinética-farmacodinâmica (PK / PD) características dos compostos e apoiar a selecção da dose para a tomada de decisão desenvolvimento clínico e aprovação regulamentar. Numerosos modelos de infecção de animais estão descritos na literatura para estes fins. Um dos modelos mais comuns e amplamente utilizados é a infecção do mouse coxa neutropenia, que foi lançada pela Águia 1, 2 e mais tarde expandiu-se Vogelman e Craig 3, 4. Este modelo tem sido inestimável para apoiar a determinação dos limites de susceptibilidade bacteriana e para fornecer metas de PK / PD para orientar a dosagem humana. Existem muitos examepios em que a capacidade preditiva do modelo foi provado 4-7. No entanto, um dos inconvenientes do modelo de infecção coxa é a falta de relevância directa para infecções pulmonares. Existe agora um maior ênfase na correspondência do local da infecção em modelos animais para o local da infecção em seres humanos; e, assim, estudar a compostos para o tratamento de pneumonia, que é ideal para utilizar um modelo de infecção pulmonar em animais.
Vários métodos para a indução de infecções pulmonares em animais de laboratório foram descritos e utilizados para estudos de eficácia antibacterianos incluindo a inalação intranasal, a aspiração através da via orofaríngea, exposição ao aerossol, e cirúrgica inoculação intratraqueal 8. Em muitos casos, os animais (ratos) em particular deve primeiro ser tornado neutropenia, a fim de alcançar uma infecção pulmonar robusta. Apesar deste estado gravemente imunocomprometidos, o número de agentes patogénicos bacterianos e as estirpes que produzem infecções viáveis é em roedoreslimitado. Por exemplo, pode ser difícil estabelecer com sucesso Haemophilus influenzae ou Acinetobacter baumannii em modelos pneumonia 9, 10, e patógenos ainda mais virulentos, tais como Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae, podem representar desafios 11-13.
Em 1991, Smith descreveu um modelo de infecção pulmonar em ratos recém-desmamados imunocompetentes em que a infecção foi estabelecida por incutir bactérias directamente para os pulmões por meio de um método não cirúrgico simples intubação intratraqueal 14. Berry et al. posteriormente modificado o método para infectar ratos 15. Usando um inoculo de ágar-base, esta técnica de inoculação induz infecções pulmonares robustas tanto em ratos imunocompetentes e ratinhos com S. pneumoniae, H. influenzae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii. É favorável para uma grande variedade de isolados, incluindo aqueles abrigando vários resistirdeterminantes Ance e aquelas que não produzem uma infecção viável por outras vias de inoculação. Ele também permite que a eficácia deve ser determinada em animais imunocompetentes, uma condição que é mais relevante do que o modelo do rato neutropênica tradicional para populações de pacientes que não estão gravemente imunocomprometidos. A consistência e confiabilidade deste modelo em vários patógenos e isolados torna adequado para estudos de eficácia antibacterianos.
Protocol
S. pneumonie
Todos os procedimentos estão em conformidade com os protocolos aprovados pelo Animal Care e Use Committee da GSK Institucional (IACUC), e atendem ou excedem os padrões da Associação Americana para o Acreditação do Laboratório Animal Care (AAALAC), o Departamento de Saúde e Humanos dos Estados Unidos serviços e todas as leis de protecção dos animais locais e federais.
NOTA: A menos que especificado em contrário, todos os procedimentos devem ser realizados utilizando técnica asséptica.
1. Cultura isolados bacterianos
- Preparar 3 a 6 placas de agar com S. pneumoniae ou H. influenzae, como caldo de cultura em geral, não fornece material suficiente para a inoculação.
- Retirar uma cultura de reserva congelada a partir do armazenamento a -80 ° C, descongelar completamente, e raia até 100 mL por placa em agar de soja tríptica suplementado com sangue de carneiro (S. pneumoniae) ou em agar de chocolate (H. influenzae), utilizando técnicas microbiológicas convencionais. Incubar durante a noite a 37 ° C com ou sem 5% de CO 2.
- Prepare culturas caldo com K. pneumoniae, P. aeruginosa ou A. baumannii.
- Retirar uma cultura de reserva congelada a partir do armazenamento a -80 ° C, descongelar completamente, e alíquota de 100 ul do estoque em 50 ml de infusão de cérebro-coração (BHI). Incubar durante a noite a 37 ° C com agitação suave (aproximadamente 120 rpm).
- [Opcional] Se uma cultura de fase log é desejada, alíquota de 1 mL da cultura durante a noite resultante em 50 mL de caldo BHI fresco. Incuba-se durante 3 h a 37 ° C com agitação suave (aproximadamente 120 rpm).
2. Prepare Saline bacterianas Suspensões
- Para todas as etapas de preparação da suspensão (2,1 a 2,3), utilizar solução salina estéril a uma temperatura entre o ar ambiente e 37 ° C. Colheita crescimento durante a noite de S. pneumoniae ou H. influenzae a partir de placas de agar de colónias raspandoa partir da superfície com uma ansa estéril. Transferir o material colhido em 5 ml de solução salina estéril até uma nebuloso, opaco suspensão obtida é suavemente e vórtice até à homogeneização.
- Centrífuga de 50 mL da K. pneumoniae, P. aeruginosa ou A. baumannii culturas de caldo final pretendido para a inoculação (por exemplo, durante a noite ou log culturas em fase) durante 5 min a 4.500 x g. Remover o sobrenadante com uma pipeta e descarte. Ressuspender o sedimento em, pelo menos, 5 mL de solução salina estéril, e suavemente vortex para obter uma suspensão homogénea.
- Se necessário, diluir a suspensão ainda mais usando soro fisiológico estéril para se obter uma densidade na gama de 8 a 9 log10 unidades formadoras de colónias (CFU) / ml. Remove-se uma alíquota para determinação do CFU / mL. Serialmente diluídas e placa alíquota conforme descrito nas secções 7.5 e 7.6.
3. Prepare o inóculo baseado em Agar
- Prepare uma pequena garrafa (cerca de 50 mL) de nutriente agar AccorDing com as instruções do fabricante ou derreter uma garrafa de ágar nutriente sólida que foi previamente preparado e armazenado. Deixar arrefecer a cerca de 50 ° C.
- Transportar o agar líquido e todas as ferramentas e equipamentos necessários para o processo de infecção para a área do procedimento onde os animais serão infectados. Manter um pequeno banho de água regulado a 42 ° C na área.
- Permitir que o agar para atingir uma temperatura de aproximadamente 50 ° C, e, em seguida, alíquota 9 ml num tubo estéril de tamanho adequado para encaixar-se no banho de água. Deixar este tubo no banho de água até que o ágar se equilibrar a aproximadamente 42 ° C. Assegurar a água está a uma profundidade que vai cobrir a superfície do agar em seu recipiente, mas não tocar a tampa ou tampa.
- Adicionar 1 ml de solução salina a suspensão bacteriana a partir do Passo 2.3 para dentro do tubo contendo 9 mL de agar no banho de água. Tampe o tubo, inverta várias vezes para misturar, e devolvê-lo ao banho de água.
4. Umnesthetize, Intubate e inoculo Animais
NOTA: patogénio específico livres ratos (SPF) imunocompetente macho Sprague-Dawley pesando 100-120 g ou ratinhos macho CD-1 pesando 20-25 g são recomendados. Proporcionar a todos os animais com comida e água ad libitum e abrigá-los socialmente em lascas de madeira ou outra roupa de cama absorvente com ciclos de luz-escuro de 12 h padrão.
- Antes de efectuar todas as experiências, e esterilizar obter um tubo de cânula de metal e polietileno de tamanho apropriado para a espécie animal. Obter estéreis 1 ml seringas e agulhas descartáveis de calibre 25 estéreis.
Cuidado: Sempre descarte dessas seringas e agulhas em um recipiente apropriado.- Para os ratos, de compra ou de fabricar uma cânula de metal que é de aproximadamente 12 cm de comprimento, tem um ID de 0,9-1,0 mm e DO de 1,0-1,2 mm, que é dobrada a um ângulo de aproximadamente 45 ° em uma extremidade. Cortar um comprimento de 11 a 12 polegadas de tubo de polietileno com uma ID de 0,4 mm e 0,8 mm OD. (Referir-se
- Para ratos, comprar um tubo de alimentação de animais # 20. Remover a bola a partir da extremidade do tubo, agarrando-o com um alicate e puxando acentuadamente, e, em seguida, dobrar suavemente a extremidade de um ângulo de aproximadamente 45 °. Corte um comprimento de 11 a 12 polegadas de tubo de polietileno com um ID de 0,28 mm e 0,61 mm OD. Também compra e esterilizar um vidro de 100 mL seringa de micro-injecção e uma agulha de metal micro-injecção de 30 gauge. (Consulte a Figura 1B).
- Coloque a cânula de metal em um vidro, tubo de tampa de rosca e autoclave por métodos padrão para esterilizar. Mergulhe e armazenar comprimentos de corte do tubo de polietileno de álcool objecto copo contendo.
- Para os ratos, de compra ou de fabricar uma cânula de metal que é de aproximadamente 12 cm de comprimento, tem um ID de 0,9-1,0 mm e DO de 1,0-1,2 mm, que é dobrada a um ângulo de aproximadamente 45 ° em uma extremidade. Cortar um comprimento de 11 a 12 polegadas de tubo de polietileno com uma ID de 0,4 mm e 0,8 mm OD. (Referir-se
- Preparar a superfície de trabalho e dispositivo de intubação.
- Coloque um tapete descartável e limpa para a superfície de trabalho, fim para o banho de água. Transferir a cânula de metal, no seu tubo de vidro de armazenagem, a esta superfície. Retire a tampa do tubo de armazenamento e deslize o fim "pega" do Cannula para a extremidade aberta do tubo.
- Utilizando fórceps estéreis, remover um comprimento de tubo de polietileno a partir do recipiente e inseri-la através do interior da cânula metálica estéril, certificando-se que se move livremente. Montar uma agulha descartável estéril de calibre 25 (para ratos) ou o esterilizado de calibre 30 de metal da agulha de uma seringa de micro-injecção de vidro (para ratos) na extremidade livre do tubo de polietileno, deslizando as agulhas vários milímetros para o tubo. (Consulte a Figura 1A para rato e Figura 1B para ratos).
- marcas lugar de guia em ambos os cânula de metal e um tubo de polietileno para indicar profundidade de inserção no animal, seguindo o procedimento descrito abaixo intubação em um único animal eutanasiado. Abrir a cavidade torácica para observação, em seguida, colocar a cânula de metal adequadamente e avançar o tubo de polietileno de forma adequada (como descrito na Seção 4.7). Usando uma caneta de tinta indelével, marque a cânula de metal onde se encontra com a boca do animal e do politubagem de etileno onde se encontra com o topo da cânula de metal para auxiliar a colocação adequada de animais restantes.
- Dentro de um extractor de fumo (ou usando um sistema de eliminação adequado), para anestesiar-se 6 animais de cada vez numa câmara fechada fornecido com ≤5% de isoflurano em 1,5 L / min até que o oxigénio do reflexo de vómito é inibida (aproximadamente 1 min).
NOTA: Antes de realizar quaisquer experiências, estabelecer a dose e tempo de exposição segura para o isoflurano nas condições específicas a serem utilizados (por exemplo, o tamanho / tipo de câmara e tamanho / espécie / estirpe do animal) para evitar a exposição letal inadvertida. - Encha uma estéril descartável seringa de 1 mL (para ratos) com solução salina estéril, colocando a ponta estéril em solução salina e puxando para trás o êmbolo. Encher a seringa de micro-injecção de vidro estéril (para ratos), tal como descrito abaixo. Introduzir a seringa à agulha encaixada sobre o tubo de polietileno, e lavar todo o volume de uma solução salina através do tubo até que o syringE é esvaziado.
- Para encher a seringa de micro-injecção (para ratos), remover completamente o êmbolo e a agulha de metal (encaixada sobre o tubo de polietileno) a partir da seringa e definir tanto de lado.
- Encha uma estéril descartável 1 seringa mL com solução salina estéril (como descrito acima) e anexar uma agulha de calibre 25 descartáveis estéril. Inserir a agulha no topo da seringa de micro-injecção (em que o êmbolo de metal será inserido), e o êmbolo da seringa descartável até que ele enche a seringa de micro-injecção com solução salina.
- Descartar a seringa descartável e agulha que foram usados para encher a seringa de micro-injecção num recipiente apropriado. Re-anexar o metal de agulhas de micro-injecção (encaixada sobre o tubo de polietileno) com a ponta da seringa de micro-injecção e re-inserir o êmbolo de metal, pressionando-se até que todo o volume de solução salina foi descarregado através da seringa e a tubagem.
- Encher a seringa com o inoculo à base de ágar from o recipiente em banho-maria, e agar de descarga através do tubo apenas até que o tubo é preparado (por exemplo, completamente preenchido com o ágar).
- Para os ratos, remover a agulha de calibre 25 (montado no tubo de polietileno) a partir da seringa descartável. Descarte a seringa utilizada num recipiente apropriado. Encha uma nova, estéril descartável seringa de 1 mL com o inóculo de agar à base do recipiente no banho de água, colocando a ponta estéril para o inoculo e puxando para trás o êmbolo. Volte a colocar a agulha (montado no tubo de polietileno) e agar nivelado através do tubo pressionando o êmbolo apenas até que a tubulação é completamente preenchida com agar.
- Para ratinhos, remover o metal de agulhas de micro-injecção (encaixada sobre o tubo de polietileno) e o êmbolo de metal a partir da seringa de micro-injecção e retiradas. Usando uma seringa de 1 ml descartável e estéril agulha de calibre 25 descartável estéril, encher a seringa com a micro-injecção do inoculo de agar à base do recipiente nobanho de água usando o procedimento de enchimento descrito na Seção 4.4. Volte a colocar o metal agulha micro-injecção (montado no tubo de polietileno), insira o êmbolo metal, e agar nivelado através do tubo apenas até que a tubulação é completamente preenchida com agar.
- Retirar um animal da câmara de anestesia. Colocar o animal numa posição supina sobre o tapete descartável com a cabeça para a direita e a cauda para a esquerda como mostrado na Figura 1C.
- Utilizando o dispositivo de intubação (isto é, a cânula de metal equipada com um tubo de polietileno), entubar o animal e inserir a cânula no grande lóbulo do pulmão esquerdo (ver Figura 1D).
- Inserir a extremidade livre da cânula de metal para dentro da boca do animal. Virar a cânula de modo a que a extremidade livre está dobrado para cima e suavemente fazê-la avançar para dentro da traqueia, contornando cuidadosamente as estruturas da laringe com um ligeiro movimento de torção. Confirmar a inserção na traqueia em oposição aoesôfago, deslizando suavemente a cânula ligeiramente para a frente e para trás várias vezes enquanto palpação dos anéis traqueais com o dedo indicador esquerdo, conforme mostrado na Figura 1C.
- Quando a cânula atinge a bifurcação onde a traqueia divide para os brônquios esquerdo e direito, fazer um ligeiro movimento de rotação em direcção ao lado esquerdo do animal para assegurar que a cânula é inserida no brônquio esquerdo. Avançar a cânula de metal até o fim é meio caminho para três quartos para baixo do pulmão esquerdo, utilizando a marca da guia previamente colocado para confirmar que a profundidade adequada foi atingida.
- Com a cânula de metal no lugar, avançar o polietileno tubulação vários mm. Utilizar a marca da guia previamente colocado no tubo para garantir que ele é avançado apenas o suficiente para sair do fim da cânula de metal e não perfurar o pulmão.
- Com ambos cânulas no lugar, use a seringa ligada a incutir 100 mL (para ratos) ou 20 mL (para ratos) da suspe agarnsion profundamente na grande lóbulo do pulmão esquerdo (ver Figura 1D). Retirar várias mm do tubo de polietileno, e em seguida, remover suavemente o dispositivo de intubação intacta. Configurá-lo de volta para o tubo de armazenamento de vidro, e mover o animal em uma gaiola fresco para se recuperar.
- Continue anestesiar, entubação e inoculando os animais restantes.
- Entre os lotes de animais anestesiados, remover a agulha (montado no tubo) da seringa. Para os ratos, descartar a seringa descartável usado em um recipiente adequado e encher uma nova seringa descartável, esterilizada a partir do inoculo no banho de água. Para ratos, encher a seringa micro-injecção mesmo vidro a partir do inóculo no banho de água usando a técnica de preenchimento descrito na Seção 4.4.
- Se o agar começa a engrossar no dispositivo de intubação, lave tudo agar restante através da tubulação. Remover a agulha da seringa (deixando a agulha encaixada sobre o tubo de polietileno). Siga os procedimentos descritosNo ponto 4.4 para lavar quente solução salina estéril através do dispositivo de intubação, repetindo conforme necessário para limpar completamente qualquer bloqueio. Vazio todos salina da seringa e preparar o inóculo agar novamente como descrito na Seção 4.5.
- Calcular o inoculo bacteriano final por animal utilizando o CFU determinada a partir da suspensão salina (ver Secção 2.3), o factor de diluição final da suspensão salina em agar (por exemplo, dez vezes), e o volume instilado nos animais (por exemplo, 100 ul de ratos ou 20 mL para ratos).
5. Avaliar animais para o Potencial Mis-inoculação ou outros eventos adversos
- Observar cuidadosamente todos os animais durante a intubação, a instilação do ágar e recuperação da anestesia para avaliar a potencial mis-inoculação. eutanásia imediatamente (de acordo com as directrizes locais IACUC) qualquer animal que sangra, apresenta respiração anormal (como respiração difícil ou ofegante), não se movenormalmente sobre a gaiola, ou não aparecer de olhos brilhantes e saudáveis após a recuperação da anestesia.
- Se a cessação espontânea da respiração ocorre (normalmente quando o inóculo não é colocado a uma profundidade suficiente e bloqueia as vias aéreas), confirmar a morte pela observação e executar um método secundário da eutanásia (como deslocamento cervical ou toracotomia).
- Minimizar o comprimento de tempo animais são expostos a isoflurano, como anestesia apenas é necessária para vários minutos para realizar o procedimento. Se forem utilizados anestésicos injetáveis, garantir que os animais estão sob observação até que esteja totalmente acordado. Coloque animais, especialmente ratinhos, num ambiente aquecido para recuperação quando usando anestésicos injectáveis.
- Observe os animais, pelo menos, duas vezes por dia durante o período de estudo para os seguintes sinais de doença respiratória: respiração pronunciada, piloereção, atividade reduzida e reduziu a temperatura do corpo. eutanásia imediatamente (de acordo com as directrizes locais IACUC) qualquer animal que está moribundo, experieNCES dificuldade para respirar ou desconforto respiratório, tem uma temperatura corporal visivelmente reduzido mediante manipulação, é incapaz ou não se mover, ou não pode alcançar comida e água.
6. Tratamentos Administrar teste
- Preparar e administrar tratamentos de teste de acordo com o desenho do estudo planejado. Comece a administração de tratamentos em 1 ou 2 infecção h pós (ou atrasar o tratamento ainda mais se a carga bacteriana da linha de base mais elevada é desejada). Os detalhes específicos para a preparação e a administração de tratamentos de teste não pode ser determinado, uma vez que é dependente do objectivo do estudo, bem como as propriedades de cada tratamento individual. (Consulte a Figura 3 como um exemplo.)
- Separe um grupo de infectados, animais não tratados para servir como controles de linha de base. Enumerar a carga bacteriana nos pulmões destes animais no tempo de tratamento é iniciado para os outros grupos, seguindo os procedimentos descritos na Seção 7.
- Para as análises PK / PD, avaliaro perfil farmacocinético do tratamento (s) administrada no sangue e / ou tecidos de animais infectados. Os procedimentos específicos para estudos farmacocinéticos estão fora do escopo deste artigo.
7. Enumerar bactérias viáveis dos pulmões
- Eutanásia um grupo de animais não tratados na altura do tratamento é iniciado para os outros grupos (linha de base) e todas as restantes animais no final do período de estudo (normalmente 24, 48 ou 96 h após a infecção) por exposição por inalação a subir gradualmente os níveis de carbono dióxido de dentro de uma câmara fechada ou um método alternativo, como recomendado pelas diretrizes locais IACUC. Verifique morte por observação, e executar um método secundário da eutanásia (como deslocamento cervical ou toracotomia).
- Colocar os animais em decúbito dorsal em uma esteira descartável e limpa, e molhar completamente a pele sobre o peito com álcool.
- Com uma tesoura estéril, corte através da pele, subjacente a camada muscular e caixa torácicaparalela ao esterno para abrir a cavidade torácica. Gentilmente segure os pulmões com uma pinça estéril e puxe para remover, usando a tesoura para separá-los da traqueia, se necessário. Coloque pulmões em gaze estéril para absorver o excesso de sangue. Se o coração foi também removido, dissecam-lo afastado e descartar.
- Faça pequenos recortes nos pulmões com tesoura estéril para expor seções interiores e usar uma pinça estéril, colocar pulmões (mais quaisquer peças que foram inadvertidamente cortou) no fundo de um saco laboratório liquidificador. Resumidamente rolar um objecto redondo de espessura (tal como uma caneta ou marcador) sobre o exterior do saco para triturar o tecido. Pipete 1 mL de solução salina estéril para dentro do saco, colocar o saco em um misturador de laboratório, e executar o misturador de laboratório a alta velocidade durante 2 min.
- Transferir as amostras homogeneizou dos sacos misturaram-se em tubos ou placas utilizando uma pipeta. Diluir o homogeneizado de dez vezes por aliquotting 1-parte homogeneizado em 9-partes de solução salina (como 100 L homogeneizado em 900 mL saline). Dilui-se a suspensão resultante por meio de dez vezes de novo de uma maneira semelhante. Continuar diluindo cada nova suspensão resultante por um outro fator de dez vezes até pelo menos 6 diluições em série foram preparadas a partir do homogeneizado originais.
- Alíquotas pipeta em triplicado de 20 mL cada de todas as diluições em placas de agar de tripticase de soja suplementado com sangue de carneiro (S. pneumoniae, K. pneumoniae, P. aeruginosa ou A. baumannii) ou em placas de agar de chocolate (H. influenzae). Incubar durante a noite a 37 ° C com ou sem CO 2. (Ver Figura 1E para um exemplo de uma placa resultante.)
- Contar as colónias em cada uma das três repetições na primeira diluição que contém um número "contáveis" (ou seja, não são muitas colônias para razoavelmente Count). Calcular o valor médio das três repetições. Determinar a CFU por pulmões através da multiplicação do valor médio por 50 (a conta para o plaqueamento de 20 mL do total de 1 mLhomogeneizado) e factoring no fator de diluição final do homogeneizado original em que as colónias foram contadas.
Representative Results
As ferramentas necessárias, a orientação do animal, e a profundidade da intubação são mostrados na Figura 1. Também é mostrado um exemplo representativo de colónias que crescem em uma placa de agar após a diluição em série e placas em triplicado de uma amostra de homogenato de pulmão. Um aumento da carga bacteriana de várias log 10 CFU acima dos controlos de linha de base é normalmente observada em pulmões infectados por isolados mais bacterianas, mesmo a 96 h após a infecção, e a variabilidade entre os animais é baixo (Figura 2). Para alguns H. influenzae, pode haver pouco crescimento; No entanto, a infecção não deve começar a auto-resolver dentro de um período de tempo de 48 ou 96 h (Figura 2B). Este modelo de infecção pulmonar pode ser utilizado durante a optimização da série química chumbo para suportar SAR, como mostrado na Figura 3 para os compostos representativos de duas séries diferentes 16, 17. Ele fornece uma consistente, reproduzível conheceuHod para avaliar PK / PD em animais imunocompetentes e foi utilizado para determinar que a área de fármaco livre sob a curva concentração-tempo, em relação à concentração inibidora mínima (fAUC / MIC) correlacionada com a eficácia de um novo polipéptido deformilase (PDF) inibidor contra S. pneumoniae e H. influenzae (Figura 4). Além disso, os alvos / MIC fAUC para estase, a 1 log 10 redução de CFU dos controles de linha de base foram determinados através de 11 S. pneumoniae e 5 isolados de H. influenzae (Tabela 1) 18. Acoplamento deste modelo de infecção com um sistema de entrega de droga para recriar perfis farmacocinéticos humanos em ratos cria uma ferramenta poderosa para avaliar os regimes de dosagem humanos antes de estudos clínicos. Um exemplo disto é resumido na Tabela 2, o que demonstra que uma formulação de libertação prolongada de amoxicilina-clavulanato foi mais eficaz do que os regimes de dosagem para os organismos existentes com Elevated MIC valores 19.
Figura 1: Nonsurgical intratraqueal intubação. As ferramentas são mostrados para a entubação de rato (A) e o rato (B). Uma vez anestesiados, o animal deve ser posicionado como mostrado na C, com a cabeça para a direita e da cauda à esquerda se o indivíduo que executa a técnica é destro. Coloque o dedo indicador esquerdo gentilmente na garganta para ajudar a apalpar os anéis traqueais para a confirmação da colocação de uma cânula correta. O inoculo deve ser colocado profundamente no pulmão esquerdo, como mostrado na vista ventral de um pulmão de rato (D). As colónias que crescem em agar após diluição em série e plaqueamento de uma amostra deve ser semelhante ao mostrado na E. Figura 1D, Direitos de Autor © Gill Smith [Animais de Laboratório, Volume 25 (1991), G. Smith, Amétodo não-cirúrgico simples da instilação intrabronquial para o estabelecimento de infecções respiratórias em ratos, páginas 46 - 49] 14. Reproduzido com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplos representativos de crescimento bacteriano nos pulmões de animais infectados. Média ± desvio CFU dados padrão a partir de n = 5 animais / grupo é mostrado para vários isolados de S. pneumoniae (A), H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) e A. baumannii (E). O primeiro bar de cada par (cinza claro) é a linha de base bactericidafardo rial em 1 ou 2 h após a infecção, enquanto o segundo bar é o controle do crescimento de fim de estudo às 48 h após a infecção (cinza escuro) ou 96 h após a infecção (preto). Nenhum método de censura dados foram aplicadas; Assim, estes resultados incluem os dados de todos os 5 animais por grupo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliar a eficácia de várias séries químicas durante a Otimização do Chumbo. modelos de infecção pulmonar, utilizando as técnicas descritas foram utilizadas para explorar relações estrutura-actividade, como parte do programa de tipo não-bacteriana topoisomerase II. Compostos promissores 7 e 1 foram avaliadas contra quinolonas-suscetível (A) 16 ou resistentes à quinolona(B) 17 isolados de S. pneumoniae, respectivamente. Cada símbolo representa CFU determinada a partir dos pulmões de um rato, com linhas que representam o grupo de média e desvio padrão. Limite inferior de quantificação (LIQ) foi de 1,7 log 10 UFC / pulmões. Os compostos foram pesados (56 ou 112 mg de molécula progenitora livre pura), dissolvido em 9 mL de água estéril, diluiu-se 3 mL em 3 mL de água (1: 1) e administrado por gavagem oral de 1 ml / 125 g de rato duas vezes por dia ( 6 - 7 horas de intervalo), durante 2 dias, a partir de 1 h após a infecção. controlos não tratados (NTC) foram amostrados a 1 h após a infecção para a linha de base ou tratados com solução salina e amostrado no final do estudo (48 h) para os controlos de crescimento. Figura 3A reproduzido a partir Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 21, TJ Miles et al, ciclo-amidas romance como antibacterianos potentes tipo de segmentação bacteriana IIA topoisomerases, Páginas 7483 -. 7488, Copyright (2011) 16, com a permissão de Elsevier.Figura 3B reproduzido a partir Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 26, TJ Miles et al, tricíclicos novel (por exemplo GSK945237) como inibidores potentes do tipo bacteriana IIA topoisomerases, Páginas 2464 -. 2469, Copyright (2016) 17, com a permissão de Elsevier. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: PK / PD Caracterização de um inibidor de PDF Novel. Modelos Emax foram criadas usando doses variando dados de eficácia em camundongos imunocompetentes infectados no pulmão com isolados de S. pneumoniae (A) ou H. influenzae (B) para determinar PK alvos / PD para um novo inibidor PDF 18. círculosrepresentam a carga bacteriana média 4-5 ratinhos / grupo tratados com diferentes doses de composto. As análises foram realizadas para correlacionar com eficácia sem droga 24 h AUC (círculos abertos) ou AUC / MIC (círculos a cheio). Reproduzido com permissão, de Copyright © Sociedade Americana de Microbiologia, [Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia, o volume 60, 2016, páginas 180 - 189] 18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| estase | 1-log 10 redução | ||||||
| Organismo | microfone (ug / ml) | R 2 para linha fiT (%) | fAUC | fAUC / MIC | fAUC | fAUC / MIC | Max assassinato (log 10 redução) |
| S. pneumoniae | |||||||
| 10127 | 0,25 | 99,9 | 2.0 | 8.1 | 3.6 | 14,4 | 2.8 |
| 1316009S | 0,25 | 96,1 | 6.5 | 26,0 | 15.1 | 60,3 | 1.8 |
| ATCC10813 | 0,5 | 100 | 8.4 | 16,9 | 22.2 | 44,5 | 1.2 |
| 1307007S | 1 95,8 | 16,1 | 16,1 | 20.1 | 20.1 | 2.7 | |
| ATCC6303 | 1 | 99,8 | 19.8 | 19.8 | 24,8 | 24,8 | 2.8 |
| 1629 | 2 | 100 | 15,8 | 7.9 | 21.2 | 10.6 | 2.4 |
| 298443 | 2 | 99,9 | 26,5 | 13.2 | 31,0 | 15,5 | 2.3 |
| 336808 | 2 | 86 | 8.2 | 4.2 | 19,0 | 9.5 | 2.6 |
| 338860 | 2 | 99,5 | 2.9 | 1,5 | 6,7 | 3.4 | 2.8 |
| & #160; 340449 | 2 | 94,6 | 8 | 4.0 | 14,9 | 7,4 | 2.1 |
| L11259 | 2 | 100 | 7.1 | 3,5 | 9 | 4,5 | 2.0 |
| Média ± SD | NA uma | N / D | 11,0 ± 7,5 | 11,0 ± 7,9 | 17,0 ± 8,2 | 19,5 ± 17,8 | 2,3 ± 0,5 |
| Mediana | N / D | N / D | 8.2 | 8.1 | 19,0 | 14,4 | 2.4 |
| H. influenzae | |||||||
| 1998-100-126H | 1 | 99,7 | 7.3 | 7.3 | 13,4 | 13,4 | 2.9 |
| 503-008H | 1 | 99,8 | 7.1 | 7.1 | 13,9 | 13,9 | 2.7 |
| 08003H | 2 | 99,9 | 14,5 | 7.2 | 16,7 | 8.3 | 2.7 |
| H128 | 2 | 96,6 | 15,3 | 7.6 | 26,0 | 13,0 | 2.7 |
| 19001H | 4 | 91,9 | 14,8 | 3.7 | 37,3 | 9.3 | 3.0 |
| Média ± SD | N / D | N / D | 11,8 ± 4,2 | 6,6 ± 1,6 | 21,5 ± 10,2 | 11,6 ± 2,6 | 2,8 ± 0,1 |
| Mediana | N / D | N / D | 14,5 | 7.2 | 16,7 | 13,0 | 2.7 |
| a NA, não aplicável. | |||||||
Tabela 1: PK / PD Metas para um inibidor PDF Novel contra S. pneumoniae e H. influenzae isolados. AUC livre de drogas e de AUC / metas MIC para estase e uma 1-log 10 redução no UFC da linha de base foram determinados para 11 S. pneumoniae e 5 H. influenzae em camundongos imunocompetentes infectados no pulmão e tratados com o composto 18. o datum foi utilizado para ajudar a doses humanas selecionadas para desenvolvimento clínico. Este quadro foi adaptado e reproduzido com permissão, de Copyright © Sociedade Americana de Microbiologia, [Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia, o volume 60, 2016, páginas 180 - 189] 18.
| Grupo Tratamento A | A média de log 10 S. pneumoniae (CFU / pulmão) b ± SD para a estirpe (AMX / CA MIC): | |||||||
| 05010S (2 ug / ml) | 16001S c (4 ug / ml) | 16001S (4 ug / ml) | 30005S (4 ug / ml) | 20009S (4 ug / ml) | 05003S (8 ug / ml) | 404053 (8 ug / ml) | 47003S (8 ug / ml) | |
| Ao controle | 7,3 ± 0,4 | 7,0 ± 0,8 | 5,7 ± 1,2 | 7,1 ± 0,7 | 7,1 ± 0,4 | 6,4 ± 0,6 | 6,8 ± 0,4 | 6,0 ± 0,3 |
| AMX / CA | ||||||||
| 2.000 / 125 mg bid (proporção 16: 1) | ≤ 1,7 ** | 2,8 ± 1,2 ** | 2,2 ± 0,8 ** | 2,3 ± 0,9 ** | 2,5 ± 0,9 ** | 2,0 ± 0,9 ** | 3,8 ± 1,4 ** | 1,8 ± 0,2 ** |
| 1000/125 mg três vezes por dia (proporção 8: 1) | NT | NT | 2,8 ± 0,5 ** | 2,7 ± 1,3 ** | 3,3 ± 0,9 ** | 4,9 ± 0,5 ** | 6,6 ± 1,3 | 4,7 ± 0,7 ** |
| NT | NT | 3,0 ± 1,3 * | 2,1 ± 0,7 ** | 3,2 ± 0,4 ** | 5,2 ± 0,9 * | 6,4 ± 0,6 | 4,9 ± 0,4 ** | |
| 875/125 mg bid (proporção 7: 1) | NT | NT | 4,5 ± 1,2 * | 5,6 ± 1,3 * | 5,2 ± 0,7 ** | 6,3 ± 0,7 | 6,4 ± 0,7 | 5,5 ± 0,4 |
| 500/125 mg, td (proporção 4: 1) | 3,1 ± 1,3 ** | 4,5 ± 0,9 ** | NT | NT | NT | NT | NT | NT |
| Azitromicina, 1.000 / 500 mg od | NT | NT | NT | 5,8 ± 2,0 | 7,1 ± 0,9 | 3,1 ± 1,0 ** | 6,6 ± 0,4 | 67; 0,6 |
| Levofloxacina, 500 mg od | NT | NT | 4,2 ± 0,8 * | 5,7 ± 0,8 * | 4,9 ± 0,8 ** | 3,0 ± 1,3 ** | 3,5 ± 0,2 ** | 3,9 ± 0,8 ** |
| Grupo de Tratamento d | A média de log 10 H. influenzae (CFU / pulmão) ± SD para a estirpe: | |||||||
| H128 (β-lactamase positiva) | divã (β-lactamase negativa, resistente à ampicilina) | |||||||
| Ao controle | 6,4 ± 0,6 | 6,7 ± 0,6 | ||||||
| AMX / CA | ||||||||
| 2.000 / 125 mg bid (proporção 16: 1) | 2,0 ± 0,7 ** | 3,1 ± 0,9 ** | ||||||
| 1000/125 mg três vezes por dia (proporção 8: 1) | 2,1 ± 1,0 ** | 3,6 ± 1,1 ** | ||||||
| 875/125 mg, td (proporção 7: 1) | 2,8 ± 1,3 ** | 3,8 ± 1,3 ** | ||||||
| 875/125 mg bid (proporção 7: 1) | 2,0 ± 0,8 ** | 5,1 ± 1,1 ** | ||||||
| Azitromicina, 1.000 / 500 mg od | 3,2 ± 1,7 * | 5,8 ± 1,1 | ||||||
| Levofloxacina, 500 mg od | ≤ 1,7 ** | ≤ 1,7 ** | ||||||
| AMX / CA, amoxicilina-clavulanato; oferta, duas vezes por dia; tid., três vezes ao dia; OD, uma vez por dia. | ||||||||
| b O limite de detecção foi de <1,7; *, Significativamente diferente do controlo (P ≤ 0,05); **, Significativamente diferente do controlo (P ≤ 0,01); NT, Não testado. | ||||||||
| c Strain 16001S foi testado em duas experiências separadas. | ||||||||
| d-amoxicilina clavulanato de 500/125 mg (4: 1), três vezes por dia não foi testado contra as estirpes de H. influenzae. | ||||||||
Tabela 2: Eficácia de perfis de exposição Recreated plasma humano para diferentes Amoxicilina / Clavulanato regimes de dosagem. Os dados gerados em ratos imunocompetentes infectados no pulmão com isolados de S. pneumoniae ou H. influenzae usando este modelo demonstrou que uma formulação melhorada de amoxicilina-clavulanato (2, 000/125 mg duas vezes por dia) foi mais eficaz do que os regimes de dosagem padrão contra isolados com elevada sensibilidade in vitro 19. Este quadro foi adaptado e reproduzido com permissão, de Copyright © Sociedade Americana de Microbiologia, [Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia, Volume 49, 2005, páginas 908 - 915] 19.
Discussion
Para o sucesso ideal em reproduzir este modelo de infecção, as seguintes sugestões adicionais devem ser considerados. Virulência de novos isolados pode ser melhorada por passagem de 2 - 3 vezes in vivo antes da utilização num estudo. Stocks bacterianas congeladas devem sempre ser preparado a partir de uma primária in vivo fonte -derived com o menor número de passagens quanto possível do original, e recongelar ou reutilização de estoque descongelado é desencorajado. Usando isolados clínicos recentes recuperadas a partir de pacientes com pneumonia e / ou preparação de culturas em fase log de crescimento também pode ajudar a melhorar o estabelecimento da infecção. Uma diluição de cinco vezes no agar (por exemplo, 2 ml de suspensão salina adicionado a 8 ml de agar) pode ser usado em vez de dez vezes para aumentar o inoculo bacteriano, e o volume de inoculo pode ser ajustada com base no tamanho do animal (por exemplo, 200 uL / animal é geralmente inoculado em ratos 250 g). Antes da adição da suspensão bacteriana em soro fisiológico aágar (isto é, no Passo 2.3), a densidade bacteriana pode ser prevista ou estimada por inspecção visual, padrões MacFarland ou medições de densidade óptica. É útil para se familiarizar com as características de crescimento in vitro para cada isolado antes da realização de experimentos in vivo. Consistência no crescimento e manuseamento permite a estimativa mais precisa da densidade bacteriana para qualquer dado isolado. métodos microbiológicos padrão que diferem daqueles descritos, tais como meios de comunicação e homogeneizadores de tecido alternativa, podem ser utilizados como apropriados para a preparação de inóculos e enumeração de bactérias a partir de tecidos infectados.
É altamente recomendável para preparar ou derreter o agar do dia antes da experiência, e armazená-la durante a noite num banho de água separada definida para 50 ° C. Isto vai simplificar o processo e ajudar a proteger contra o agar ser demasiado quente no momento da infecção. A temperatura de 41-42 ° C constitui um bom equilíbrio entre a manutenning o agar em estado líquido, sem ser demasiado quente para a sobrevivência bacteriana de curto prazo. Como uma alternativa possível à de agar nutriente, ágar nobre tem sido utilizada com sucesso em algumas experiências. Um tubo de inoculo de ágar é geralmente suficiente para um experimento inteiro (e é recomendado), mas vários tubos podem ser preparados para infectar um grande número de animais (por exemplo, mais de 60) ou quando o processo de infectar demora mais do que 30 - 45 min Se múltiplos tubos de inóculo são necessários, adicionar a suspensão bacteriana solução salina a cada tubo de agar tal como é necessário. Isto reduz o risco de que a sobrevivência e / ou a forma física bacteriana irá ser afectada pela exposição prolongada a uma temperatura elevada antes da inoculação. Deve notar-se que o uso de vários tubos de inoculo pode também requerer procedimentos de randomização animais adicionais. Sempre que possível, infectar todos os animais a partir da mesma preparação de inoculo. Recomenda-se a adaptar o tamanho de experimentos para o nível atual de proficiência com o technique.
Um cientista especialista pode intubação e inocular um animal em menos de 30 s, e inocular até 5 - 6 animais por lote (isto é, com uma seringa cheia de inoculo de ágar). Para aqueles que aprender a técnica, a velocidade é importante como o agar vai começar a solidificar; No entanto, a colocação precisa do inoculo é mais importante. Comece com 1 ou 2 animais por lote, e aumentar à medida que a técnica torna-se mais familiar. Os animais continuam a respirar durante a intubação; Assim, a janela de tempo para a inoculação depende da rapidez com que o animal recupera de isoflurano, o que deve ser de aproximadamente 2-3 min. Os animais que despertam durante o processo pode ser re-anestesiados e tentado uma segunda vez, mas isto não é recomendado para o fazer repetidamente. inoculação bem sucedida na primeira tentativa, é esperado em quase 100% dos animais uma vez proficiência é alcançada. Note-se que é mais fácil de aprender a técnica utilizando ratos em primeiro lugar; ratinhos são mais delicados e muito menorls são mais propensas ao bloqueio com agar solidificado se não for manipulado rapidamente. seringas pré-aquecimento, tubos e salinas, bem como manter o dispositivo de intubação em uma superfície quente (não quente), como uma almofada de aquecimento em baixa definição, podem ajudar a prevenir a solidificação do agar. Quando a aprendizagem da técnica, também é útil para a prática de colocação adequada do inoculo utilizando um corante de cor escura (tais como azul de metileno concentrado) em vez da suspensão bacteriana em ágar. Realizar o processo tal como descrito, mas sacrificar o animal imediatamente após a inoculação do corante (não permitindo que o animal recuperar da anestesia e eutanásia). Dissecar a determinar onde o corante foi colocado, e ajustar em conformidade técnica.
O endpoint primário neste modelo é CFU dos pulmões infectados. A sobrevivência não é um bom indicador da carga bacteriana e não é um desfecho recomendado. Para os estudos de eficácia, o N sugerida é de 5 - 6 animais por grupo como este é predicted para detectar diferenças de log ≥1 10 CFU entre grupos com pelo menos 90% de energia. Os animais podem ser infectados em grupos de tal forma que permanecem em conjunto companheiros de gaiola, ou um verdadeiro processo de randomização pode ser seguido. Note que se os grupos são designados por gaiola, os grupos deve ser infectado numa sequência aleatória com os controlos de crescimento de fim de estudo última infectadas (para confirmar que a sobrevivência bacteriana / aptidão não foi afectada pelo comprimento de tempo de exposição a uma temperatura elevada no banho de água). Nenhum método de censura dados deve ser necessário, e nenhum é recomendada, com excepção da remoção imediata de qualquer animal que tenha sido obviamente mis-inoculados no início do estudo (antes do início de quaisquer tratamentos). Os animais que são sacrificados antes do final do estudo deve ser amostrada e resultados incluídos no conjunto de dados, a menos que uma razão válida para exclusão prospectivamente foi identificado (isto é, um evento não relacionado com o tratamento ou infecção). carryover droga pode affect algumas amostras e é uma consideração importante em todos os modelos de infecção in vivo. Se um composto é dada frequência, perto da hora da eutanásia ou tem uma semi-vida longa, pode estar presente no homogenato de tecido a uma concentração suficientemente elevada para continuar a matar bactérias ex vivo durante o processo de enumeração de bactérias (diluição e plaqueamento de as amostras ou sobre as placas de agar durante a incubação durante a noite). Para evitar isso, carvão activado e / ou um aditivo que degrada a molécula activa, sem prejudicar as células bacterianas podem ser adicionados à amostra antes da homogeneização. Outros métodos incluem a centrifugação das amostras para remover a maioria do composto activo (o qual deve permanecer no sobrenadante) e empregando diluição diferente e plaqueamento regimes suficientemente para diluir o composto activo a uma concentração não inibidora.
Como evidenciado pelos exemplos mostrados na Figura 2, este modelo com sucesso induces infecções pulmonares em roedores com uma ampla gama de organismos incluindo aqueles que não crescem bem em outros modelos (por exemplo, H. influenzae). Estas infecções são consistente e reprodutível, reduzindo a probabilidade de que as experiências terá de ser repetido devido à falha de modelo e / ou pobre desempenho com um dado isolado. Embora os animais são imunocompetentes, eles são incapazes de resolver rapidamente a infecção, se em tudo. Isto permite uma maior flexibilidade na duração do estudo, tal como muitos isolados manter uma infecção viáveis através de pelo menos 96 horas sem a necessidade de injecções repetidas para manter a neutropenia. A vantagem potencial de estudar a eficácia antibacteriana em animais imunocompetentes foi observado anteriormente 20, 21, e há evidências de que, para alguns compostos (por exemplo, oxazolidinonas), os dados a partir de roedores não neutropénicos pode prever com maior precisão alvos de exposição humanos em comparação com aqueles neutropénicos rendeu 5. O utilitário multi-propósito de tEle modelo é demonstrado nas Figuras 3 e 4 e as Tabelas 1 e 2. Estes estudos são parte de uma grande coleção de dados publicados e não publicados que foi gerado com este modelo para apoiar os esforços de otimização de chumbo 16, 17, 22-24, para comparação e confirmação da dosagem humana propostos esquemas 19, 25-29 e para a caracterização de PK / PD 18, 30-32 .enquanto este modelo é inicialmente mais complexo de realizar em comparação com o método de inalação intranasal, existem muitas vantagens descritas acima. Com prática e uso rotineiro, as técnicas devem tornar-se simples de executar.
Pode notar-se, em alguns estudos que a carga bacteriana na linha de base era menor do que a normalmente orientada em outros modelos de infecção pulmonar. Isto é devido em grande parte à diluição necessária em agar e o volume desafio pequeno, particularmente em ratos. No entanto, também deve ser notadoque o crescimento bacteriano foi observado em todos os casos, mesmo quando a carga inicial era relativamente baixa. A carga bacteriana de base alvo é 6 a 6,5 log 10 CFU / pulmões (6,8 a 7,3 log 10 UFC / g de tecido em ratinhos baseados em pesos médios do pulmão) que corresponde a densidades estimadas em pacientes humanos com pneumonia grave 33. Uma carga de linha de base superior pode ser alcançado por concentração adicional do inoculo bacteriano ou atrasar o início da administração do composto para permitir o crescimento bacteriano adicional; No entanto, o aumento da carga de desafio em excesso pode levar a doença grave e anormalmente aguda (ou seja, morte em menos de 24 h), que é refractário a todos os tratamentos antibacterianos independentemente de susceptibilidade. Embora o inoculo é inicialmente colocado preferencialmente no pulmão esquerdo do animal, geralmente a infecção se espalha por ambos os pulmões. doença progressiva do pulmão, a disseminação das bactérias a outros órgãos, e eventual morbilidade é muitas vezes observed com S. pneumoniae, K. pneumoniae e P. aeruginosa. De interesse, infecções com H. influenzae e A. baumannii são geralmente mais contido e raramente levar à morte no inóculos bacterianos prescrito.
Os resultados de eficácia obtidos com este modelo tem demonstrado boa correlação com in vitro perfis de susceptibilidade, bem como metas PK / PD definidos. Reduções na carga bacteriana são rotineiramente observada para isolados consideradas susceptíveis ao agente a ser testado, enquanto que as consideradas resistentes exibem nenhuma mudança ou crescimento bacteriano acima da linha de base 16, 17, 19, 24-29. Estudos em ratos avaliando dois quinolonas e um macrólido de utilizar este modelo de 32 mostraram que o alvo de PK / PD necessário para um 1-log 10 redução em S. pneumoniae em comparação com os valores basais correlacionada com o alvo determinada em ratinhos neutropénicos e, mais importante ainda, com alvos clínicos para pneum bacteriana adquirida na comunidadeonia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, um mecanismo novo antibiótico, foi testada contra vários S. pneumoniae e necessário um alvo PK / PD semelhante para um 1-log 10 redução neste modelo de infecção pulmonar 31 que o exigido para um 1-log 10 redução no modelo da coxa neutropénicos 36 quando a penetração de pulmão foi tida em conta (dados em arquivo). Do mesmo modo, os objectivos de PK / PD para determinados em ratinhos GSK2251052 contra P. aeruginosa foram consistentes para estase, 1- e 2-log em CFU 10 reduções entre este modelo de pulmão 30 e o modelo de infecção coxa neutropénicos quando a penetração pulmonar foi considerada 37, 38 . Correlação com um modelo de infecção pulmonar neutropênica usando inoculação intranasal era pobre; no entanto, GSK2251052 não produzir mais do que uma resposta estática nesse estudo 38. Isto pode ser atribuível ao inoculo bacteriano superior, que foi de 8 log 10 UFC / murganho, em comparação com 6 log
Existem várias limitações deste modelo de pneumonia imunocompetentes. Em primeiro lugar, não é bem adequado para avaliar o surgimento de resistência espontânea porque o inoculo bacteriano alta geralmente exigido para tais estudos resulta em uma infecção muito grave. Na sequência de tentativas para conseguir cargas bacterianas de 7 ou 8 log 10 CFU no início do estudo, a morbidade rápida tem sido observado (ou seja, animais tornando-se moribunda em menos de 24 h), apesar de lavagem completa dos inóculos para remover toxinas pré-existentes (dados em arquivo). istopode ser possível superar esse problema usando roedores maiores. Ratos, ratazanas especialmente mais pesados (> 250 g), parecem tolerar melhor inóculos maiores, em comparação com os ratos e pode ser adequado para estes tipos de estudos. Uma segunda limitação é que a utilização de uma infecção de agar como potenciador pode excluir a utilização do modelo para a avaliação de certos hospedeiro: agente patogénico. Acredita-se que o agar fornece um ponto focal protegida até que a infecção está totalmente estabelecida no interior do pulmão. É possível entregar o inóculo em solução salina em vez de agar para ajudar a superar este problema; No entanto, deve notar-se que isto apenas irá produzir infecção com alguns isolados. Em terceiro lugar, há uma curva de aprendizagem necessária para se tornar proficientes na técnica. O procedimento pode ser delicada, especialmente em ratinhos. É fácil colocar erroneamente a cânula de metal para o esôfago e força excessiva poderá causar perfuração, quer do esófago ou da traqueia. colocação cuidadosa do inoculo é igualmenterequerido ou animais podem ou não se recuperar ou não ser adequadamente infectadas. No entanto, com paciência e perseverança, pode tornar-se altamente proficiente e executar a técnica rápida, suave e precisa.
Ao eliminar a necessidade de neutropenia, aumentando a robustez e reprodutibilidade, permitindo que os investigadores a estudar mais patógenos e isolados, melhorando a flexibilidade do design experimental e proporcionando uma infecção difícil de caracterizar farmacodinâmica para pneumonia, este modelo infecção pulmonar imunocompetentes agrega valor substancial para a descoberta de antibióticos comunidade. O aumento da utilização deste modelo por investigadores adicionais ajudará a fornecer a avaliação comparativa necessária para que adquiram uma aceitação mais ampla e continuar a fornecer informações de suporte para a interpretação apropriada.
Disclosures
Os autores são todos funcionários da GlaxoSmithKline Pharmaceuticals e acções próprias de estoque pagos dentro da empresa.
Acknowledgments
JH deseja reconhecer e agradecer mentor, amigo e ex-gerente Valerie Berry para o primeiro nos ensinando este modelo; e Gary Woodnutt, que nos ensinou os fundamentos do e inspirou o nosso compromisso com o campo de PK / PD antibacteriano. Todos os autores gostariam de agradecer David Payne por seu apoio e valorização de nossa ciência. Gostaríamos de reconhecer a nossa ex-nos colegas vivo microbiologia que contribuíram para o corpo de dados gerados através destes métodos, especialmente Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni página e Nerissa Simon. Finalmente, os nossos agradecimentos vão para os nossos in vitro colegas de microbiologia para a sua assistência, especialmente para fornecer todos os MICs nós pedido (Lynn McCloskey, Josh Oeste e Sharon Min); e para a nossa equipe de microbiologia clínica que oferece consultoria especializada e suporte (Linda Miller, Nicole Scangarella-Omã e Deborah Butler).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
| Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
| BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
| BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
| Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
| 0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
| Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
| 30 mL free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100 mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
| Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
| 90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
| 1 mL TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| Animal feeding needle - straight 20 x 3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
| Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand - Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
| 75 TN 5.0 µL syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
| Pyrex tube, culture 25x150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
| 70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
| Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
| Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
| Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
| Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |
References
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