Abstract
Werkzaamheid van kandidaat antibacteriële behandelingen moeten worden aangetoond in diermodellen van infectie als onderdeel van de ontdekking en ontwikkelingsproces, bij voorkeur in modellen waarin de beoogde klinische indicatie nabootsen. Een werkwijze voor het induceren robuuste longinfecties bij immunocompetente ratten en muizen wordt beschreven die het mogelijk maakt de beoordeling van behandelingen in een model van ernstige pneumonie veroorzaakt door S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae of A. baumannii. Dieren worden verdoofd, en een-agar gebaseerde entstof is diep gestort in de longen via niet-chirurgische intratracheale intubatie. De resulterende infectie consistent, reproduceerbaar en stabiel gedurende tenminste 48 uur en maximaal 96 uur voor de meeste isolaten. Studies met de markt antibacteriële middelen hebben aangetoond goede correlatie tussen in vivo en in vitro gevoeligheid en overeenstemming tussen de farmacokinetische / farmacodynamische doelen bepaaldin dit model en klinisch geaccepteerde doelen waargenomen. Hoewel er een initiële tijdsinvestering bij het leren van de techniek, kan het snel en efficiënt worden uitgevoerd zodra vaardigheid is bereikt. Voordelen van het model onder meer afschaffing van de neutropenische eis, verhoogde robuustheid en reproduceerbaarheid, het vermogen om meer ziekteverwekkers en isoleert, verbeterde flexibiliteit in de studie van het ontwerp en de oprichting van een uitdagende infectie bij een immunocompetente gastheer te bestuderen.
Introduction
Evalueren van de werkzaamheid van potentiële geneesmiddelen in diermodellen van infectie is een kritische component van de antibacteriële geneesmiddelen ontdekkingsproces. In vivo studies werkzaamheid belangrijke gegevens voor de besluitvorming over de spanwijdte van ontdekking inspanningen, van het ophelderen van de structuur-activiteit relaties (SAR) en het optimaliseren van lead chemische serie door middel van het bepalen van farmacokinetische-farmacodynamische (PK / PD) van de kenmerken van verbindingen en ondersteunende selectie dosis voor klinische ontwikkeling en reglementaire goedkeuring. Talrijke infectie dierlijke modellen zijn beschreven in de literatuur voor dit doel. Een van de meest voorkomende en meest gebruikte is het neutropene muis dijbeen infectie, die is ontwikkeld door Eagle 1, 2 en later door Vogelman en Craig 3, 4. Dit model is van onschatbare waarde voor de ondersteuning van de bepaling van bacteriële gevoeligheidsbreekpunten en voor het verstrekken van PK / PD targets voor de menselijke leidraad voor de dosering geweest. Er zijn vele examenselen waar de voorspellende vermogen van dit model is bewezen 4-7. Een van de nadelen van de dij infectiemodel is er geen direct belang voor longinfecties. Er is nu een grotere nadruk op die overeenkomen met de plaats van infectie in diermodellen om de plaats van infectie bij de mens; en dus op verbindingen voor de behandeling van longontsteking te bestuderen, is het ideaal om een longinfectie model bij dieren gebruiken.
Verschillende werkwijzen voor het induceren longinfecties bij proefdieren zijn beschreven en gebruikt voor antibacteriële werkzaamheid studies waaronder intranasale inhalatie, afzuiging via de orofaryngeale route, aërosol en chirurgische intratracheale inoculatie 8. In veel gevallen, de dieren (vooral muizen), worden neutropenische gemaakt om een robuuste longinfectie bereiken. Desondanks Ernstig immuungecompromitteerde, het aantal bacteriële pathogenen en stammen die levensvatbare virussen te produceren in knaagdierenbeperkt. Zo kan het moeilijk zijn om Haemophilus influenzae en Acinetobacter baumannii succesvol vaststellen pneumonie modellen 9, 10, en zelfs meer virulente pathogenen zoals Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa en Klebsiella pneumoniae, kunnen problemen opleveren 11-13.
In 1991, Smith beschreef een longinfectie model in immunocompetente gespeende ratten waarbij besmetting werd vastgesteld door de bevolking is bacteriën direct in de longen via een eenvoudige chirurgische intratracheale intubatie methode 14. Berry et al. wijziging van de werkwijze voor het infecteren muizen 15. Met een-agar gebaseerde inoculum Dit effect zorgt inoculatie sterke longinfecties bij zowel immunocompetente ratten en muizen met S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa en A. baumannii. Het gemakkelijk kan een groot aantal isolaten, inclusief onderdak diverse weerstaankomstig determinanten en welke niet een levensvatbare infectie produceren via andere routes inenting. Het laat ook de werkzaamheid te bepalen in immunocompetente dieren, een aandoening die meer relevant dan de traditionele neutropenie muismodel voor patiëntenpopulaties die niet ernstig verzwakt immuunsysteem. De consistentie en de betrouwbaarheid van dit model over meerdere ziekteverwekkers en isolaten maakt het zeer geschikt voor antibacteriële werkzaamheid studies.
Protocol
S. pneumonie
Alle procedures zijn in overeenstemming met protocollen die door de GSK Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurd, en voldoen aan de normen van de Amerikaanse Vereniging voor de Accreditatie van Laboratory Animal Care (AAALAC), het Amerikaanse ministerie van Volksgezondheid en Human diensten en alle lokale en federale dierenwelzijn wetten.
OPMERKING: Tenzij anders vermeld, moeten alle procedures worden uitgevoerd met behulp van aseptische techniek.
1. Cultuur Bacteriële isolaten
- Bereid 3-6 agarplaten met S. pneumoniae en H. influenzae, zoals kweek in het algemeen niet genoeg materiaal voor inoculatie.
- Verwijder een bevroren voorraadkweek van opslag bij -80 ° C, ontdooien volledig en strook tot 100 ul per plaat op tryptische soja-agar aangevuld met schapenbloed (S. pneumoniae) of op chocolade agar (H. influenzae) onder toepassing van standaard microbiologische technieken. Incubeer overnacht bij 37 ° C met of zonder 5% CO2.
- Bereid bouillonkweken met K. pneumoniae, P. aeruginosa of A. baumannii.
- Verwijder een bevroren voorraad cultuur uit de opslag bij -80 ° C, ontdooien volledig en hoeveelheid van 100 pi van de voorraad in 50 ml hersen-hart infusie (BHI) bouillon. Incubeer overnacht bij 37 ° C onder zacht schudden (ongeveer 120 rpm).
- [Optioneel] Als een log-fase cultuur gewenst is, aliquot 1 ml van de resulterende overnacht cultuur in 50 ml vers BHI bouillon. Incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C onder zacht schudden (ongeveer 120 rpm).
2. Bereid Saline Bacteriële Schorsingen
- Voor suspensie bereidingsstappen (2,1-2,3), gebruik steriele zoutoplossing bij een temperatuur tussen lucht en 37 ° C. Harvest groei gedurende de nacht van S. pneumoniae en H. influenzae uit de agarplaten door schrapen koloniesvan het oppervlak met een steriele lus. Transfer het geoogste materiaal in 5 ml steriele zoutoplossing tot een bewolkte, wordt ondoorzichtig verkregen suspensie en zachtjes vortex tot homogeen.
- Centrifugeer 50 ml van K. pneumoniae, P. aeruginosa of A. baumannii definitieve bouillonkweken bestemd voor inoculatie (bijvoorbeeld 's nachts of log fase kweken) gedurende 5 min bij 4500 x g. Verwijder supernatant met een pipet en de teruggooi. Resuspendeer de pellet in ten minste 5 ml steriele zoutoplossing, en voorzichtig vortex om een homogene suspensie te verkrijgen.
- Indien nodig verdunnen suspensie verder met steriele zoutoplossing tot een dichtheid in het traject van 8-9 10 log kolonievormende eenheden (CFU) / ml te verkrijgen. Verwijder een monster voor het bepalen van CFU / ml. Serieel verdunnen en het bord van de hoeveelheid, zoals beschreven in de paragrafen 7.5 en 7.6.
3. Bereid de Agar-gebaseerde Inoculum
- Bereid een klein flesje (ongeveer 50 ml) van de nutriënt agar according de instructies van de fabrikant of smelt een fles vaste nutriënt agar eerder voorbereide en opgeslagen. Laat het afkoelen tot ongeveer 50 ° C.
- Vervoer de vloeibare agar en alle benodigde gereedschappen en apparatuur voor de infectie proces om de procedure gebied waar de dieren zullen worden besmet. Handhaven van een klein waterbad ingesteld op 42 ° C in het gebied.
- Laat de agar een temperatuur van ongeveer 50 ° C, en vervolgens aliquot 9 mL bereiken in een steriele buis geschikte afmetingen om te passen in het waterbad. Laat deze buis in het waterbad totdat de agar in evenwicht tot ongeveer 42 ° C. Verzekeren het water op een diepte die het oppervlak van de agar in de verpakking dekt maar de dop of het deksel niet aan.
- Voeg 1 ml van de bacteriesuspensie zoutoplossing van stap 2.3 in de buis met 9 ml agar in het waterbad. Cap de buis, omkeren een paar keer om te mixen, en terug te sturen naar het waterbad.
4.nesthetize, Intubate en Inoculeer Dieren
OPMERKING: Specifieke pathogeenvrije (SPF) immuuncompetente mannelijke Sprague-Dawley ratten die 100-120 g of mannelijke CD-1 muizen met een gewicht 20-25 g te gebruiken. Zorg voor alle dieren met voedsel en water ad libitum en huisvesten ze sociaal op houtsnippers of ander absorberend beddengoed met standaard 12 uur licht-donker cycli.
- Voorafgaand aan het uitvoeren van enige experimenten, verkrijgen en steriliseren van een metalen canule en polyethyleen buis van de juiste maat voor de diersoort. Verkrijgen steriele 1 ml wegwerpspuiten en steriele 25-gauge naalden.
Let op: Lever deze spuiten en naalden in een naaldencontainer Altijd.- Voor ratten, aankoop of vervaardiging van een metalen canule die ongeveer 12 cm lang, heeft een binnendiameter van 0,9-1,0 mm en OD van 1,0-1,2 mm, en is gebogen om een ongeveer 45 ° hoek ene uiteinde. Snij een 11- tot 12-inch lengte van polyethyleen buis met een binnendiameter van 0,4 mm en 0,8 mm OD. (Verwijzen naar
- Voor muizen, de aanschaf van een # 20 dier sondevoeding. Haal de bal uit het einde van de buis door vast te pakken met een tang en scherp te trekken, en dan zachtjes buig het einde om een benaderende hoek van 45 °. Snij een 11- tot 12-inch lengte van polyethyleen buis met een binnendiameter van 0,28 mm en buitendiameter 0,61 mm. Ook inkoop en steriliseren een glazen 100 ul micro-injectiespuit en een 30-gauge metal micro-injectienaald. (Zie Figuur 1B.)
- Plaats de metalen canule in een glas, schroefdop buis autoclaaf volgens standaardmethoden te steriliseren. Geniet en op te slaan gesneden lengtes van de polyethyleen buis in een overdekte bekerglas met alcohol.
- Voor ratten, aankoop of vervaardiging van een metalen canule die ongeveer 12 cm lang, heeft een binnendiameter van 0,9-1,0 mm en OD van 1,0-1,2 mm, en is gebogen om een ongeveer 45 ° hoek ene uiteinde. Snij een 11- tot 12-inch lengte van polyethyleen buis met een binnendiameter van 0,4 mm en 0,8 mm OD. (Verwijzen naar
- Bereid het werkoppervlak en intubatie apparaat.
- Leg een schone wegwerp mat op het werkvlak, dicht bij het water bad. Breng de metalen canule, in zijn glazen opslag buis, om dit oppervlak. Verwijder de dop van de opslag buis en schuif de "handle" einde van de cannula naar het open uiteinde van de buis.
- Met behulp van een steriel pincet, verwijder dan één lengte van polyethyleen buis uit de beker en steek deze door de binnenkant van de steriele metalen canule, zorg ervoor dat het vrij kan bewegen. Breng een steriele 25-gauge naald (bij ratten) of gesteriliseerde 30-gauge naald van een metaal glas micro-injectiespuit (bij muizen) op het vrije uiteinde van de polyethyleen buis door er met de naald enkele mm in de buis. (Zie Figuur 1A en Figuur 1B rat muizen).
- Geleidingsschelpen markeringen op zowel de metalen canule en polyethyleen slang aan inbrengdiepte in de dieren heeft aangetoond door de intubatie onderstaande procedure op één dier gedood. Open de borstholte voor observatie, plaats dan de metalen canule correct en vooraf de polyethyleen buis op de juiste wijze (zoals beschreven in paragraaf 4.7). Met behulp van een onuitwisbare stift, markeren de metalen canule wanneer het voldoet aan de monding van het dier en de polyethyleen buis waar het de bovenkant van de metalen canule juiste plaatsing helpen bij overgebleven dieren.
- Binnen een zuurkast (of met behulp van een geschikt opvangsysteem;), verdoven tot 6 dieren in een tijd in een afgesloten ruimte met ≤5% isofluraan geleverd in 1,5 l / min zuurstof tot de gag reflex wordt geremd (ongeveer 1 min).
NB: Voorafgaand aan het uitvoeren van enige experimenten, stellen de veilige dosis en de belichtingstijd voor isofluraan onder de specifieke omstandigheden wordt gebruikt (bv grootte / type kamer en grootte / soorten / stam van dieren) om onbedoelde dodelijke blootstelling te voorkomen. - Vul een steriele 1 ml spuit (voor ratten) met een steriele zoutoplossing door het plaatsen van de steriele tip in de zoutoplossing en terug te trekken op de zuiger. Vul het steriele glazen micro-injectiespuit (muizen), zoals hieronder beschreven. Bevestig de spuit aan de naald gemonteerd op de polyethyleen buis, en spoel het gehele volume van een zoutoplossing door de slang totdat de syringe geleegd.
- Om de micro-injectiespuit (bij muizen) te vullen, volledig te verwijderen van de metalen zuiger en naald (gemonteerd op de polyethyleen buis) uit de spuit en zet beide opzij.
- Vul een steriele 1 ml spuit met een steriele zoutoplossing (zoals hierboven beschreven) en bevestig een steriele 25-gauge naald. Steek de naald in de top van de micro-injectiespuit (wanneer de metalen plunjer genomen) en de zuiger van de wegwerpspuit tot in de micro-injectiespuit met zoutoplossing gevuld.
- Gooi de wegwerpspuit en naald die werden gebruikt om de micro-injectiespuit te vullen in een naaldhouder. Bevestig het metalen micro-injectienaald (aangebracht op de polyethyleen buis) aan het uiteinde van de micro-injectiespuit en plaats de metalen plunjer indrukken totdat het gehele volume zoutoplossing is doorgespoeld spuit en slangen.
- Vul de spuit met de agar-gebaseerde inoculum from de container in het waterbad, en spoel agar door de slang gewoon totdat de buis gevuld is (bv geheel gevuld met de agar).
- Voor ratten, verwijder de 25-gauge naald (gemonteerd op de polyethyleen buis) uit de wegwerpspuit. Gooi de gebruikte spuit in een naaldencontainer. Vul een nieuwe, steriele 1 ml spuit met de agar-basis inoculum van het geneesmiddel in het waterbad door het plaatsen van de steriele punt in het inoculum en het terugtrekken van de zuiger. Re-attach naald (gemonteerd op de polyethyleen buis) en flush agar door de slang door het indrukken van de zuiger enkel tot buis volledig gevuld is met agar.
- Voor muizen, verwijder de metalen micro-injectienaald (gemonteerd op de polyethyleen buis) en metalen plunjer van de micro-injectiespuit en zet apart. Met behulp van een steriele 1 ml spuit en een steriele disposable 25-gauge naald, vul de micro-injectiespuit met de agar-gebaseerde entstof uit de container in dewaterbad met behulp van het vullen in paragraaf 4.4 beschreven. Bevestig het metalen micro-injectienaald (gemonteerd op de polyethyleen buis), plaatst u de metalen plunjer, en spoel agar door de slang enkel tot buis volledig gevuld is met agar.
- Verwijder een dier uit de narcose kamer. Plaats het dier in liggende positie op het wegwerpbare mat met het hoofd naar rechts en staart naar links zoals getoond in figuur 1C.
- Met behulp van de intubatie apparaat (dwz de metalen canule voorzien van polyethyleen buis), intuberen het dier en steek de canule in de grote kwab van de linker long (zie figuur 1D).
- Plaats het vrije uiteinde van de metalen canule in de mond van het dier. Draai de canule, zodat het vrije uiteinde omhoog helt en voorzichtig vooruit het in de luchtpijp, zorgvuldig omzeilen van de laryngeale structuren met een licht draaiende beweging. Bevestigen inbrengen in de trachea in tegenstelling tot deslokdarm weer te schuiven de canule iets naar voren en terug meerdere malen tijdens palpatie van de tracheale ringen met de linker wijsvinger zie figuur 1C.
- Wanneer de canule de splitsing waar de trachea splitst in de linker en rechter bronchi bereikt, maken een licht draaiende beweging naar links van het dier dat de canule in de linker bronchus ingebracht. Schuif de metalen canule tot het einde is half tot driekwart aan de linkerkant van de longen, met behulp van de eerder geplaatste merkteken te bevestigen dat de juiste diepte is bereikt.
- Met de metalen canule op zijn plaats, vooraf de polyethyleen buis enkele mm. De eerder aangebracht merkteken op de slang aan dat ze uitsluitend ver genoeg om het einde van de metalen canule verlaten en de longen niet doorboren gevorderd.
- Met beide canules op zijn plaats, gebruik dan het bijgevoegde spuit om 100 ul (voor ratten) of 20 ul (voor muizen) van de agar Suspe inboezemennsion diep in de grote kwab van de linker long (zie figuur 1D). Trekken enkele mm van de polyethyleen buis, en dan verwijder voorzichtig de intacte intubatie apparaat. Zet het terug in de glazen opslag buis, en zet het dier in een frisse kooi te herstellen.
- Doorgaan verlamming, intuberen en het enten van de resterende dieren.
- Tussen partijen verdoofde dieren, verwijder de naald (gemonteerd op de slang) uit de spuit. Voor ratten, gooi de gebruikte disposable spuit in een naaldencontainer en vul een nieuwe, steriele disposable spuit uit de entstof in het waterbad. Voor muizen, vullen hetzelfde glas micro-injectiespuit van het inoculum in het waterbad met de fill techniek in paragraaf 4.4 beschreven.
- Als de agar begint te dikken in de intubatie apparaat, spoelen alle resterende agar door de buis. Verwijder de naald van de spuit (het verlaten van de naald gemonteerd op de polyethyleen buis). Volg de beschreven proceduresin paragraaf 4.4 om warm, steriele zoutoplossing te spoelen door de intubatie apparaat, als nodig is om helemaal duidelijk eventuele verstopping te herhalen. Leeg alle zout uit de spuit en de voorbereiding van de agar entstof weer zoals beschreven in paragraaf 4.5.
- Bereken de uiteindelijke bacterieel inoculum per dier met de CFU bepaald uit de zoute suspensie (zie paragraaf 2.3), de uiteindelijke verdunningsfactor van de zoute suspensie in agar (bv tienvoudige) en het volume instillatie in de dieren (bijvoorbeeld 100 ul voor ratten of 20 ul muizen).
5. Beoordeel Dieren voor potentiële Mis-enting of andere ongewenste voorvallen
- Neem zorgvuldig alle dieren tijdens intubatie, instillatie van de agar en herstel van anesthesie te beoordelen voor potentiële mis-inenting. Onmiddellijk euthanaseren (volgens de lokale IACUC richtlijnen), een dier dat bloedt, vertoont abnormale ademhaling (zoals ademhalingsmoeilijkheden of hijgen), niet beweegtnormaal gesproken over de kooi, of niet verschijnt heldere ogen en gezonde na herstel van de anesthesie.
- Als spontane ademstilstand optreedt (meestal wanneer de entstof niet diep genoeg wordt geplaatst en blokkeert de luchtwegen), bevestig de dood door observatie en het uitvoeren van een secundaire methode van euthanasie (zoals cervicale dislocatie of thoracotomie).
- Minimaliseren de tijd dieren worden blootgesteld aan isofluraan anesthesie louter als enkele minuten om de procedure uit te voeren. Als injecteerbare anesthetica worden gebruikt, zorgen voor de dieren zijn onder observatie tot helemaal wakker. Plaats dieren, vooral muizen, in een verwarmde omgeving voor het herstel bij het gebruik van injecteerbare anesthetica.
- Observeer dieren ten minste tweemaal per dag gedurende de studieperiode voor de volgende tekenen van ademhalingsziekte: uitgesproken ademhaling, pilo-erectie, verminderde activiteit en verlaagde lichaamstemperatuur. Onmiddellijk euthanaseren (volgens de lokale IACUC richtlijnen) alle dieren die op sterven na dood is, experiences moeizame ademhaling of ademnood, heeft een aanzienlijk verlaagde lichaamstemperatuur bij handling, is in staat of bereid om te verhuizen, of kunnen voedsel en water niet bereiken.
6. Dien Test Behandelingen
- Voor te bereiden en te beheren testen behandelingen op basis van de geplande studie design. Begin de toediening van behandelingen in 1 of 2 uur na infectie (of uit te stellen behandeling verder als een hogere uitgangswaarde bacteriële last is gewenst). Specifieke details voor de bereiding en toediening van de test behandelingen kunnen niet worden gegeven omdat het afhankelijk is van het doel van het onderzoek en de eigenschappen van elke individuele behandeling. (Zie Figuur 3 als voorbeeld.)
- Braaklegging een groep van geïnfecteerde, onbehandelde dieren als basislijn controles dienen. Inventariseer de bacteriële last in de longen van deze dieren op het moment dat de behandeling wordt gestart voor de andere groepen, volgens de in artikel 7 procedures.
- Voor PK / PD analyses, beoordeelthet farmacokinetisch profiel van de toegepaste behandeling (en) in het bloed en / of weefsels van geïnfecteerde dieren. Specifieke procedures voor farmacokinetische studies vallen buiten het bestek van dit artikel.
7. Inventariseer levende bacteriën uit de longen
- Euthanize één van onbehandelde dieren bij het starten van de behandeling van de andere groepen (baseline) en alle resterende dieren aan het einde van de onderzoeksperiode (gewoonlijk 24, 48 of 96 uur na infectie) door inademing geleidelijk stijgende koolstof dioxide in een gesloten kamer of een andere methode zoals aanbevolen door IACUC lokale richtlijnen. Controleer of dood door observatie, en het uitvoeren van een secundaire methode van euthanasie (zoals cervicale dislocatie of thoracotomie).
- Leg de dieren in een liggende positie op een schone wegwerp mat, en grondig nat van de vacht op de borst met alcohol.
- Met behulp van een steriele schaar, dwars door de huid, de onderliggende spierlaag en ribbenkastevenwijdig aan het borstbeen naar de borstholte geopend. Voorzichtig grijpen de longen met een steriel pincet en trek te verwijderen, met behulp van de schaar om hen uit de luchtpijp te scheiden indien nodig. Plaats de longen op een steriel gaasje om overtollig bloed te absorberen. Als het hart is ook verwijderd, ontleden het weg en gooi.
- Maak kleine knipt in de longen met steriele schaar inwendige gedeelten bloot en steriel pincet longen (plus eventuele stukken die onbedoeld werd afgeknipt) in de bodem van een lab blender zak plaatsen. Kort gooit dikke rond voorwerp (zoals een pen of marker) over de buitenzijde van de zak om het weefsel puree. Pipetteer 1 ml steriele zoutoplossing in de zak, plaatst u de zak in een lab blender, en voer het lab blender met hoge snelheid gedurende 2 minuten.
- Breng de monsters gehomogeniseerd uit de gemengde zakken in buisjes of platen met een pipet. Verdun de homogenaat tienvoudig door aliquotting 1-part homogenaat in 9-parts zoutoplossing (zoals 100 ul homogenaat in 900 pi saline). Verdun de verkregen suspensie tien keer weer op een soortgelijke wijze. Verder verdunnen van elk nieuw verkregen suspensie door een tienvoudige factor tot ten minste 6 seriële verdunningen werden bereid uit de oorspronkelijke homogenaat.
- Pipetteer drievoudige aliquots van 20 pi elk van verdunningen op trypticase soja-agarplaten gesupplementeerd met schapenbloed (S. pneumoniae, K. pneumoniae, P. aeruginosa of A. baumannii) of op chocolade-agarplaten (H. influenzae). Incubeer overnacht bij 37 ° C met of zonder CO 2. (Zie Figuur 1E een voorbeeld van een resulterende plaat.)
- Tel de kolonies in elk van de triplo de eerste verdunning een "telbare" nummer (dat wil zeggen niet te veel kolonies redelijk tellen) bevat. Bereken de gemiddelde waarde van de drie herhalingen. Bepaal de CFU per longen door de gemiddelde waarde van 50 (vermenigvuldigen vertegenwoordigen plating 20 pi van het totaal 1 mLhomogenaat) en rekeninghoudend met de uiteindelijke verdunningsfactor van de oorspronkelijke homogenaat waarop de kolonies werden geteld.
Representative Results
Het gereedschap, oriëntatie van het dier, en de diepte van intubatie worden in Figuur 1. Ook getoond is een representatief voorbeeld van de kolonies groeien op een agarplaat na seriële verdunning en drievoud beplating van een long homogenaat monster. Een toename in bacteriële last van verscheidene log10 CFU boven basislijn controle wordt typisch waargenomen in geïnfecteerde longen meeste bacteriële isolaten, zelfs bij 96 uur na infectie en variabiliteit tussen dieren gering (figuur 2). Voor sommige H. influenzae, kan er weinig groei; mag echter de infectie niet beginnen zichzelf oplossen in een 48 of 96 uur tijdsperiode (Figuur 2B). Dit model kan longinfectie bij de optimalisering van lood chemische reeksen worden gebruikt voor SAR ondersteunen, zie figuur 3 voor representatieve verbindingen met twee verschillende reeksen 16, 17. Het biedt een consistente, reproduceerbare ontmoettehod voor het beoordelen van PK / PD bij immuuncompetente dieren werd gebruikt die vrij geneesmiddel oppervlak onder de concentratie-tijd curve op de minimum remmende concentratie (fAUC / MIC) gecorreleerd met de werkzaamheid van een nieuw polypeptide deformylase (PDF) bepalen remmer tegen S. pneumoniae en H. influenzae (Figuur 4). Bovendien, de fAUC / MIC doelen voor stasis en een 1-log 10 vermindering in CFU van basislijn controles werden bepaald in 11 S. pneumoniae en H. influenzae 5 isolaten (tabel 1) 18. Koppelen van deze infectie model met een geneesmiddelafgiftesysteem voor humane farmacokinetische profielen opnieuw bij ratten leidt tot een krachtig instrument voor het evalueren van menselijke doseringsschema vóór klinische studies. Een voorbeeld hiervan is samengevat in Tabel 2, waaruit blijkt dat een verlengde afgifte formulering van amoxicilline-clavulaanzuur effectiever dan bestaande doseringsschema voor organismen eleva wasted MIC waarden 19.
Figuur 1: Niet-chirurgische Intratracheaal intubatie. Gereedschap getoond intubating de rat (A) en de muis (B). Eenmaal verdoofd, dient het dier te worden zoals aangegeven in C, met het hoofd naar rechts en staart naar links indien de persoon van de techniek rechtshandig. Plaats de linker wijsvinger zachtjes op de keel te helpen betasten de tracheale ringen voor de bevestiging van de juiste canule plaatsing. Het inoculum moet diep in de linker long worden gebracht, zoals in de ventrale weergave van een longcellen (D). Kolonies groeien op agar na seriële verdunning en beplating van een monster moet soortgelijk aan die getoond in E weergegeven. Figuur 1D, Copyright © Gill Smith [Laboratory Animals, Volume 25 (1991), G. Smith, Aeenvoudige niet-chirurgische methode van intrabronchiale instillatie voor de vestiging van luchtweginfecties in de rat, pagina's 46-49] 14. Overgenomen met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve Voorbeelden van bacteriegroei in de longen van geïnfecteerde dieren. Gemiddelde ± standaardafwijking CFU data van N = 5 dieren / groep weergegeven voor verschillende isolaten van S. pneumoniae (A), H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) en A. baumannii (E). De eerste bar van elk paar (lichtgrijs) is de basislijn bacte-rial lasten op 1 of 2 uur na infectie, terwijl de tweede bar is het einde van de studie groei controle bij 48 uur na infectie (donkergrijs) of 96 uur na infectie (zwart). Geen gegevens censureren methoden werden toegepast; dus deze resultaten de gegevens van alle 5 dieren per groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het evalueren van de werkzaamheid van verschillende chemische Series tijdens Lead Optimization. Longinfectie modellen met de beschreven technieken werden toegepast om de structuur-activiteitsrelaties staand kader van abacterial Type IIA topoisomerase programma. Veelbelovende verbindingen 7 en 1 werden geëvalueerd tegen chinolon-gevoelig (A) 16 of chinolon-resistente(B) 17 isolaten van S. pneumoniae, respectievelijk. Elk symbool staat CFU bepaald uit de longen van een rat met lijnen die de groep gemiddelde en de standaardafwijking. Ondergrens van kwantificering (LLQ) was 1,7 log 10 CFU / longen. Verbindingen werden gewogen (56 of 112 mg zuiver vrij oudermolecuul), opgelost in 9 ml steriel water verdund 3 ml tot 3 ml water (1: 1) en toegediend door orale gavage van 1 ml / 125 g rat tweemaal daags ( 6-7 uur apart) gedurende 2 dagen, beginnend op 1 uur na infectie. Niet behandelde controles (NTC) werden bemonsterd op 1 uur na infectie basislijn of behandeld met een zoutoplossing en wordt op het einde van de studie (48 h) groei controles. Figuur 3A overgenomen uit Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 21, TJ Miles et al, Novel cyclohexyl-amiden als krachtige antibacteriële middelen gericht bacteriële soort IIA topoisomerases, Pages 7483 -. 7488, Copyright (2011) 16, met toestemming van Elsevier.Figuur 3B overgenomen uit Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 26, TJ Miles et al, Novel tricyclische antidepressiva (bijv GSK945237) als krachtige remmers van bacteriële soort IIA topoisomerases, Pages 2464 -. 2469, Copyright (2016) 17, met toestemming van Elsevier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: PK / PD karakterisering van een nieuw PDF Inhibitor. Emax modellen werden gemaakt met doses variërend werkzaamheidsgegevens in immunocompetente muizen geïnfecteerd in de long met isolaten van S. pneumoniae (A) of H. influenzae (B) PK / PD targets voor een nieuw PDF-remmer 18. Circlesgeven het gemiddelde aantal bacteriën 4-5 muizen / groep behandeld met verschillende doses van verbinding. Analyses werden uitgevoerd om de werkzaamheid met vrije-drug 24 uur AUC (open cirkels) of AUC / MIC (gevulde cirkels) correleren. Overgenomen met toestemming, Copyright © American Society for Microbiology, [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, volume 60, 2016, pagina's 180-189] 18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| stasis | 1-log 10 reductie | ||||||
| Organisme | MIC (ug / ml) | R 2 voor lijn fit (%) | fAUC | fAUC / MIC | fAUC | fAUC / MIC | Max doden (log 10 reductie) |
| S. pneumoniae | |||||||
| 10127 | 0.25 | 99.9 | 2.0 | 8.1 | 3.6 | 14.4 | 2.8 |
| 1316009S | 0.25 | 96.1 | 6.5 | 26.0 | 15.1 | 60.3 | 1.8 |
| ATCC10813 | 0.5 | 100 | 8.4 | 16.9 | 22.2 | 44.5 | 1.2 |
| 1307007S | 1 95.8 | 16.1 | 16.1 | 20.1 | 20.1 | 2.7 | |
| ATCC6303 | 1 | 99.8 | 19.8 | 19.8 | 24.8 | 24.8 | 2.8 |
| 1629 | 2 | 100 | 15.8 | 7.9 | 21.2 | 10.6 | 2.4 |
| 298.443 | 2 | 99.9 | 26.5 | 13.2 | 31,0 | 15.5 | 2.3 |
| 336.808 | 2 | 86 | 8.2 | 4.2 | 19.0 | 9.5 | 2.6 |
| 338.860 | 2 | 99.5 | 2.9 | 1.5 | 6.7 | 3.4 | 2.8 |
| & #160; 340.449 | 2 | 94.6 | 8.0 | 4.0 | 14.9 | 7.4 | 2.1 |
| L11259 | 2 | 100 | 7.1 | 3.5 | 9.0 | 4.5 | 2.0 |
| Gemiddelde ± SD | NA een | NA | 11,0 ± 7,5 | 11,0 ± 7,9 | 17,0 ± 8,2 | 19,5 ± 17,8 | 2,3 ± 0,5 |
| Mediaan | NA | NA | 8.2 | 8.1 | 19.0 | 14.4 | 2.4 |
| H. influenzae | |||||||
| 1998-100-126H | 1 | 99.7 | 7.3 | 7.3 | 13.4 | 13.4 | 2.9 |
| 503-008H | 1 | 99.8 | 7.1 | 7.1 | 13.9 | 13.9 | 2.7 |
| 08003H | 2 | 99.9 | 14.5 | 7.2 | 16.7 | 8.3 | 2.7 |
| H128 | 2 | 96.6 | 15.3 | 7.6 | 26.0 | 13.0 | 2.7 |
| 19001H | 4 | 91.9 | 14.8 | 3.7 | 37.3 | 9.3 | 3.0 |
| Gemiddelde ± SD | NA | NA | 11,8 ± 4,2 | 6.6 ± 1.6 | 21.5 ± 10.2 | 11,6 ± 2,6 | 2,8 ± 0,1 |
| Mediaan | NA | NA | 14.5 | 7.2 | 16.7 | 13.0 | 2.7 |
| een NA, niet van toepassing. | |||||||
Tabel 1: PK / PD Targets voor een Novel PDF Inhibitor tegen S. pneumoniae en H. influenzae isolaten. Free-drug AUC en de AUC / MIC doelen voor stasis en 1-log 10 vermindering van de CFU van de uitgangswaarde werden bepaald voor 11 S. pneumoniae en 5 H. influenzae in immunocompetente muizen geïnfecteerd in de longen en behandeld met verbinding 18. de DATeen werd gebruikt om Select Human doses voor klinische ontwikkeling te helpen. Deze tabel is aangepast en herdrukt met toestemming, Copyright © American Society for Microbiology, [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, volume 60, 2016, pagina's 180-189] 18.
| Behandeling Group een | Bedoel log 10 S. pneumoniae (CFU / long) b ± SD voor stam (AMX / CA MIC): | |||||||
| 05010S (2 ug / ml) | 16001S c (4 ug / ml) | 16001S (4 ug / ml) | 30005S (4 ug / ml) | 20009S (4 ug / ml) | 05003S (8 ug / ml) | 404.053 (8 ug / ml) | 47003S (8 ug / ml) | |
| Controle | 7.3 ± 0.4 | 7,0 ± 0,8 | 5.7 ± 1.2 | 7,1 ± 0,7 | 7,1 ± 0,4 | 6,4 ± 0,6 | 6,8 ± 0,4 | 6,0 ± 0,3 |
| AMX / CA | ||||||||
| 2000/125 mg tweemaal daags (verhouding 16: 1) | ≤ 1,7 ** | 2,8 ± 1,2 ** | 2,2 ± 0,8 ** | 2,3 ± 0,9 ** | 2,5 ± 0,9 ** | 2,0 ± 0,9 ** | 3.8 ± 1.4 ** | 1,8 ± 0,2 ** |
| 1000/125 mg tid (verhouding 8: 1) | NT | NT | 2,8 ± 0,5 ** | 2.7 ± 1.3 ** | 3,3 ± 0,9 ** | 4,9 ± 0,5 ** | 6.6 ± 1.3 | 4,7 ± 0,7 ** |
| NT | NT | 3,0 ± 1,3 * | 2,1 ± 0,7 ** | 3,2 ± 0,4 ** | 5,2 ± 0,9 * | 6,4 ± 0,6 | 4,9 ± 0,4 ** | |
| 875/125 mg tweemaal daags (verhouding 7: 1) | NT | NT | 4,5 ± 1,2 * | 5.6 ± 1.3 * | 5,2 ± 0,7 ** | 6,3 ± 0,7 | 6,4 ± 0,7 | 5,5 ± 0,4 |
| 500/125 mg tid (verhouding 4: 1) | 3.1 ± 1.3 ** | 4,5 ± 0,9 ** | NT | NT | NT | NT | NT | NT |
| Azitromycine, 1000/500 mg od | NT | NT | NT | 5.8 ± 2.0 | 7,1 ± 0,9 | 3.1 ± 1.0 ** | 6,6 ± 0,4 | 6.07; 0.6 |
| Levofloxacin, 500 mg od | NT | NT | 4,2 ± 0,8 * | 5,7 ± 0,8 * | 4,9 ± 0,8 ** | 3,0 ± 1,3 ** | 3,5 ± 0,2 ** | 3,9 ± 0,8 ** |
| Behandeling Group d | De gemiddelde log 10 H. influenzae (CFU / long) ± SD voor de stam: | |||||||
| H128 (β-lactamase positieve) | Chesterfield (β-lactamase negatieve, ampicilline resistente) | |||||||
| Controle | 6,4 ± 0,6 | 6,7 ± 0,6 | ||||||
| AMX / CA | ||||||||
| 2000/125 mg tweemaal daags (verhouding 16: 1) | 2,0 ± 0,7 ** | 3,1 ± 0,9 ** | ||||||
| 1000/125 mg tid (verhouding 8: 1) | 2.1 ± 1.0 ** | 3,6 ± 1,1 ** | ||||||
| 875/125 mg tid (verhouding 7: 1) | 2.8 ± 1.3 ** | 3.8 ± 1.3 ** | ||||||
| 875/125 mg tweemaal daags (verhouding 7: 1) | 2,0 ± 0,8 ** | 5.1 ± 1.1 ** | ||||||
| Azitromycine, 1000/500 mg od | 3,2 ± 1,7 * | 5.8 ± 1.1 | ||||||
| Levofloxacin, 500 mg od | ≤ 1,7 ** | ≤ 1,7 ** | ||||||
| een AMX / CA, amoxicilline-clavulaanzuur; bod, twee keer per dag; tid., drie keer per dag; od eenmaal daags. | ||||||||
| b De detectiegrens was <1,7; * Significant verschillend van de controle (p ≤ 0,05); **, Significant verschillend van de controle (p ≤ 0,01); NT, niet getest. | ||||||||
| c Stam 16001S werd getest in twee afzonderlijke experimenten. | ||||||||
| d Amoxicilline-clavulaanzuur 500/125 mg (4: 1) driemaal daags werd niet getest tegen H. influenzae stammen. | ||||||||
Tabel 2: Werkzaamheid van herschapen Human Plasma Exposure Profielen voor verschillende amoxicilline / clavulaanzuur doseringsschema. Gegevens die bij immuuncompetente ratten besmet in de long met isolaten van S. pneumoniae en H. influenzae het gebruik van dit model toonde aan dat een verbeterde formulering van amoxicilline-clavulaanzuur (2, 000/125 mg tweemaal daags) was effectiever dan standaard doseringsschema tegen isolaten met verhoogde in vitro gevoeligheid 19. Deze tabel is aangepast en herdrukt met toestemming, Copyright © American Society for Microbiology, [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, volume 49, 2005, pagina's 908-915] 19.
Discussion
Voor optimale succes bij het reproduceren van deze infectie model, moet de volgende aanvullende suggesties worden beschouwd. Virulentie van nieuwe isolaten kan worden verbeterd door passeren van 2-3 maal in vivo voorafgaand aan gebruik in een studie. Bevroren bacteriële voorraden moeten altijd worden bereid uit een primaire in vivo afgeleide bron met zo weinig passages mogelijk van het origineel, en opnieuw bevriezen of hergebruik van ontdooide voorraad wordt ontmoedigd. Behulp recente klinische isolaten uit patiënten met pneumonie en / of bereiden culturen in log-fase groei kan ook bijdragen tot het stellen van de infectie te verbeteren. Een vijfvoudige verdunning in de agar (bv 2 ml zoutoplossing suspensie toegevoegd aan 8 ml agar) kan worden gebruikt in plaats van tien keer het bacterieel inoculum verhogen en het inoculum volume kan aangepast worden op basis van de grootte van het dier (bv 200 gl / dier gewoonlijk geïnoculeerd in 250 g ratten). Voorafgaand aan het toevoegen van de zoutoplossing in de bacteriesuspensieagar (dwz bij stap 2,3), de bacteriële dichtheid worden voorspeld of geschat door visuele inspectie, MacFarland normen of optische dichtheidsmetingen. Het is nuttig om bekend de in vitro groeikenmerken worden voor elk isolaat alvorens zij in vivo experimenten. Consistente groei en behandeling maakt de nauwkeurige schatting van de bacteriële dichtheid voor elk isolaat. Standaard microbiologische werkwijzen die verschillen van die beschreven, zoals alternatieve media en weefsel homogenisatoren, kan worden gebruikt als geschikt voor de bereiding van inocula en opsomming van bacteriën geïnfecteerd weefsel.
Het wordt sterk aanbevolen om voor te bereiden of smelt de agar de dag voor het experiment en op te slaan 's nachts in een aparte waterbad ingesteld op 50 ° C. Dit zal het proces vereenvoudigen en te beschermen tegen de agar te warm op het moment van infectie. Een temperatuur van 41-42 ° C bereikt een goede balans tussen maintaining de agar in vloeibare toestand zonder dat het te warm voor de korte termijn overleving van bacteriën. Als een mogelijk alternatief voor nutriënt agar is noble agar succes gebruikt in sommige experimenten. Een tube agar inoculum is meestal voldoende voor een gehele experiment (en aanbevolen), maar meerdere buizen kan worden voorbereid voor het infecteren van een groot aantal dieren (bijvoorbeeld meer dan 60) of wanneer het infecterende duurt langer dan 30-45 min als meerdere inoculum buizen vereist, voeg de bacteriesuspensie zoutoplossing aan elke buis agar zoals nodig. Dit vermindert het risico dat bacteriële overleving en / of draagkracht wordt beïnvloed door langdurige blootstelling aan een verhoogde temperatuur voorafgaand aan inoculatie. Opgemerkt wordt dat het gebruik van meerdere inoculum buizen mogen vragen extra dier randomisatie procedures. Waar mogelijk, infecteren alle dieren van dezelfde inoculum preparaat. Het wordt aanbevolen om de grootte van experimenten aan te passen aan het huidige niveau van vaardigheid met de technique.
Een ervaren wetenschapper kan intuberen en beënt een dier in minder dan 30 s en beënt tot 5-6 dieren per batch (dwz met een spuit vol agar inoculum). Voor die de techniek leert, snelheid belangrijk als de agar begint te stollen; echter nauwkeurige plaatsing van het inoculum is belangrijker. Begin met 1 of 2 dieren per partij, en toenemen als de techniek steeds meer vertrouwd. De dieren blijven ademen tijdens intubatie; derhalve het tijdvenster voor inoculatie afhankelijk van de snelheid waarmee het dier herstelt van isofluraan, waarvan ongeveer 2 moet - 3 min. Dieren die wakker tijdens het proces kan opnieuw verdoofd en probeerde een tweede keer, maar het is niet aan te raden om dit herhaaldelijk doen. Succesvolle inoculatie bij de eerste poging wordt verwacht in bijna 100% van de dieren na vaardigheid bereikt. Merk op dat het gemakkelijker is om de techniek leert aan de hand ratten eerst; muizen zijn gevoeliger en de kleinere tels zijn meer vatbaar voor verstopping met gestolde agar als ze niet snel gemanipuleerd. Voorverwarmen spuiten, slangen en zoutoplossing en het houden van de intubatie apparaat op een warm (niet heet) oppervlak, zoals een verwarmingselement op lage stand, kan helpen stollen van de agar te voorkomen. Wanneer de techniek leert, is het ook nuttig om juiste plaatsing van het inoculum oefenen met een donker gekleurde kleurstof (zoals geconcentreerde methyleenblauw) in plaats van de bacteriesuspensie in agar. Voer de procedure zoals beschreven, maar laten inslapen van het dier onmiddellijk na enting van de kleurstof (niet toe te staan het dier om te herstellen tussen de verdoving en euthanasie). Ontleden om te bepalen waar de kleurstof is geplaatst, en de techniek aan te passen.
Het primaire eindpunt in dit model is CFU van geïnfecteerde longen. Survival is geen goede indicator van bacteriële last en is geen aanbevolen eindpunt. Voor de werkzaamheid studies, de voorgestelde N 5-6 dieren per groep als deze is predicted detecteren ≥1 log10 CFU verschillen tussen groepen met ten minste 90% vermogen. Dieren kunnen besmet zijn groepen die kooi mates elkaar blijven, of een echte randomisatie proces kan worden gevolgd. Merk op dat als groepen worden toegewezen kooi moet de groepen geïnfecteerd in een willekeurige volgorde met het einde van de studie groei controles geïnfecteerd laatste (om bacteriële overleving bevestigen / fitness werd niet beïnvloed door de tijd blootgesteld aan een verhoogde temperatuur in het waterbad). Geen gegevens censoring methoden nodig moeten zijn, en geen aanbevolen behalve onmiddellijke verwijdering van alle dieren die duidelijk verkeerd geënt aan het begin van de studie (vóór de start van elke behandeling) is. Dieren die voorafgaand geëuthanaseerd het einde van de studie moet worden bemonsterd en resulteert in het stellen tenzij geldige reden voor uitsluiting prospectief geïdentificeerd data (dwz een geval los van de infectie of behandeling). Drug overdracht kan affect enkele voorbeelden en is een belangrijke overweging in alle in vivo infectie modellen. Wanneer een verbinding wordt gegeven vaak dicht bij de tijd van euthanasie of een lange halfwaardetijd, kan het aanwezig zijn in het weefsel homogenaat worden op een voldoende hoge concentratie blijven doden van bacteriën ex vivo tijdens de bacteriële inventariseren (verdunning en plating de monsters of op agarplaten tijdens de nachtelijke incubatie). Dit, actieve kool en / of een additief dat het werkzame molecuul degradeert zonder nadelige gevolgen voor de bacteriële cellen kan worden toegevoegd aan het monster voorafgaand aan homogenisatie te voorkomen. Andere werkwijzen omvatten centrifugeren van de monsters om de meerderheid van de actieve verbinding (die in het supernatant moet blijven) te verwijderen en gebruik verschillende verdunning en uitplaten regelingen voldoende verdunnen de actieve verbinding aan een niet-remmende concentratie.
Zoals blijkt uit de in figuur 2 voorbeelden dit model succesvol induces longinfecties bij knaagdieren met een breed scala van organismen, met inbegrip van degenen die niet goed groeien in andere modellen (zoals H. influenzae). Deze infecties zijn consistent en reproduceerbaar, waardoor de kans dat proeven moeten worden herhaald door model falen en / of slechte prestaties met een gegeven isolaat. Hoewel de dieren immunocompetente, niet in staat zijn de infectie oplossen snel, of helemaal niet. Dit zorgt voor een grotere flexibiliteit in studie lengte, zoveel isolaten handhaven van een levensvatbare infectie door ten minste 96 uur zonder de noodzaak van herhaalde injecties neutropenie handhaven. Het potentiële voordeel van studeren antibacteriële werkzaamheid bij immuuncompetente dieren werd eerder opgemerkt 20, 21, en er zijn aanwijzingen dat voor sommige verbindingen (bijv oxazolidinonen), gegevens van niet-neutropenische knaagdieren kan nauwkeuriger voorspellen menselijke blootstelling doelen vergeleken met die rendered neutropenie 5. De multi-purpose nut van tHij model wordt gedemonstreerd in figuren 3 en 4 en Tabellen 1 en 2. Deze studies maken deel uit van een grote collectie niet gepubliceerde gegevens die zijn gegenereerd met dit model voorsprong optimalisatie inspanningen 16, 17 ondersteunen, 22-24, ter vergelijking en bevestiging van mens beoogde doseringsschema 19, 25-29 en PK / PD karakterisatie 18, 30-32 .Terwijl dit model aanvankelijk moeilijker te voeren ten opzichte van de intranasale inhalatie methode, zijn er vele voordelen zoals hierboven beschreven. Met de praktijk en routinematig gebruik, moet de technieken eenvoudig om te presteren.
Het kan worden opgemerkt in een aantal studies die de bacteriële belasting bij baseline was lager dan die doorgaans gericht op andere longinfectie modellen. Dit is grotendeels te danken aan de gewenste verdunning in agar en de kleine uitdaging volume, vooral bij muizen. Er moet echter ook worden opgemerktdat bacteriegroei werd waargenomen in alle gevallen, zelfs wanneer de initiële belasting relatief laag. Het minimumniveau vastgesteld hoeveelheid bacteriën 6-6,5 log10 CFU / longen (6,8-7,3 log10 CFU / g weefsel in muizen gebaseerd op gemiddelde gewichten longen) dat overeenkomt met dichtheden geschat menselijke patiënten met ernstige pneumonie 33. Een hogere basislijn last kan gebeuren door concentreren van het bacteriële inoculum of vertragen van het begin van verbinding toediening aanvullende bacteriegroei te kunnen beoordelen; echter uitgebreid uitdaging belasting te veel kan leiden tot abnormaal ernstige en acute ziekten (bijvoorbeeld overlijden in minder dan 24 uur) die ongevoelig is voor alle antibacteriële behandelingen ongeacht gevoeligheid. Hoewel het inoculum aanvankelijk bij voorkeur in de linkerlong van het dier wordt geplaatst, de infectie verspreidt veelal gedurende beide longen. Progressieve longziekte, verspreiding van de bacteriën naar andere organen, en uiteindelijk morbiditeit vaak OBSERVed met S. pneumoniae, K. pneumoniae en P. aeruginosa. Van belang, infecties met H. influenzae en A. baumannii zijn meestal meer bevatte en zelden leiden tot de dood bij de voorgeschreven bacteriële inocula.
Werkzaamheid resultaten van dit model zijn goed gecorreleerd met in vitro gevoeligheid profielen evenals omschreven PK / PD targets. Verlagingen van bacteriële belasting routinematig waargenomen isolaten geacht gevoelig voor het middel dat wordt getest, terwijl die resistent beschouwd vertonen geen verandering of bacteriegroei boven de basislijn 16, 17, 19, 24-29. Onderzoeken bij ratten evalueren twee chinolonen en macrolide gebruik van dit model 32 is gebleken dat de PK / PD doel nodig om een 1-log 10 vermindering van S. pneumoniae vergeleken met de uitgangswaarde gecorreleerd met de doelgroep vastgesteld neutropenische muizen en, nog belangrijker, met klinische doelstellingen voor de gemeenschap verworven bacteriële pneumonia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, een nieuw mechanisme antibioticum, werd getest tegen meerdere S. pneumoniae en vereist een vergelijkbare PK / PD doelwit voor een 1-log 10 vermindering van deze longinfectie model 31 als dat nodig is voor een 1-log 10 vermindering van de neutropenische dij model 36 wanneer de longen binnendringen in aanmerking werd genomen (gegevens over bestand). Ook de PK / PD doelstellingen bepaald bij muizen voor GSK2251052 tegen P. aeruginosa waren consistent voor stasis, 1- en 2-log 10 vermindering van de CFU tussen deze long model 30 en de dij neutropenische infectie model toen de longen binnendringen werd beschouwd als 37, 38 . Correlatie met een neutropene longinfectie model met behulp van intranasale enting was slecht; echter GSK2251052 niet meer dan een statische reactie in deze studie 38 produceren. Dit kan worden toegeschreven aan de hogere bacterieel inoculum, die 8 log10 CFU / muis was zijn ten opzichte van 6 log
Er zijn een aantal beperkingen van deze immuuncompetente longontsteking model. Ten eerste is het niet goed geschikt voor het evalueren ontstaan van spontane resistentie omdat de hoge bacterieel inoculum algemeen voor dergelijke studies leidt ook ernstige infectie vereist. Na pogingen bacteriële belasting van 7 of 8 log10 CFU bij aanvang, snelle morbiditeit waargenomen (dwz dieren steeds stervend in minder dan 24 uur) ondanks grondig wassen van de inocula op bestaande toxinen (gegevens bestand) wordt weggenomen. Hetkan mogelijk zijn om dit probleem op te lossen door grotere knaagdieren. Ratten, met name zwaardere ratten (> 250 g), de voorkeur te tolereren hogere inocula vergelijking met muizen en kan geschikt zijn voor dit type studies. Een tweede beperking is dat het gebruik van agar als infectie-enhancer kan uitsluiten het model voor evaluatie van bepaalde gastheer: pathogeen interacties. Er wordt aangenomen dat de agar verschaft een beschermde brandpunt tot infectie volledig binnen de longen wordt vastgesteld. Het is mogelijk om het inoculum in een zoutoplossing in plaats van agar om dit probleem te overwinnen leveren; echter, moet worden opgemerkt dat dit alleen produceert infectie met sommige isolaten. Ten derde is er een steile leercurve nodig om bekwamen in de techniek te worden. De procedure kan gevoelig zijn, vooral bij muizen. Het is gemakkelijk om per ongeluk plaats de metalen canule in de slokdarm, en excessieve kracht kan leiden tot lek van hetzij de slokdarm en de luchtpijp. Zorgvuldige plaatsing van het inoculum ookvereist of dieren mogen ofwel niet herstellen of niet adequaat worden besmet. Echter, met geduld en doorzettingsvermogen, kan men zeer bedreven worden en snel uit te voeren van de techniek, soepel en nauwkeurig.
Door het verwijderen van de eis van neutropenie, het verhogen van de robuustheid en reproduceerbaarheid, waardoor onderzoekers om meer ziekteverwekkers en isolaten te bestuderen, het verbeteren van de flexibiliteit van de experimentele opzet en het verstrekken van een uitdagende infectie farmacodynamische karakteriseren voor longontsteking, deze immuuncompetente longinfectie model voegt wezenlijke waarde aan de antibiotica ontdekking gemeenschap. Toenemend gebruik van dit model met extra onderzoekers zullen helpen zorgen voor de nodige benchmarking voor het naar meer brede acceptatie te krijgen en blijven verstrekken ondersteunende informatie over de juiste interpretatie.
Disclosures
De auteurs zijn alle betaalde werknemers van GlaxoSmithKline Pharmaceuticals en eigen aandelen van de voorraad binnen het bedrijf.
Acknowledgments
JH wenst te erkennen en dank mentor, vriend en voormalig manager Valerie Berry voor de eerste ons dit model onderwijs; en Gary Woodnutt, die ons de fundamenten van onderwees en inspireerde onze inzet op het gebied van antibacteriële PK / PD. Alle auteurs willen David Payne bedanken voor zijn steun en waardering voor onze wetenschap. Wij willen graag onze vroegere in vivo microbiologie collega's die hebben bijgedragen aan het lichaam van de gegevens die met behulp van deze methoden, met name Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni pagina en Nerissa Simon erkennen. Tot slot, onze dank gaat uit naar onze in-vitro-microbiologie collega's voor hun steun, met name voor het verstrekken van alle MIC's verzoeken wij (Lynn McCloskey, Josh West en Sharon Min); en voor onze klinische microbiologie team die deskundig advies en ondersteuning (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman en Deborah Butler) biedt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
| Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
| BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
| BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
| Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
| 0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
| Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
| 30 mL free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100 mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
| Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
| 90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
| 1 mL TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| Animal feeding needle - straight 20 x 3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
| Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand - Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
| 75 TN 5.0 µL syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
| Pyrex tube, culture 25x150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
| 70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
| Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
| Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
| Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
| Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |
References
- Eagle, H., Fleischman, R., Levy, M. Continuous' vs. 'discontinuous' therapy with penicillin: the effect of the interval between injections on therapeutic efficacy. N Engl J Med. 248 (12), 481-488 (1953).
- Eagle, H., Fleischman, R., Musselman, A. D. The bactericidal action of penicillin in vivo: the participation of the host, and the slow recovery of the surviving organisms. Ann Intern Med. 33 (3), 544-571 (1950).
- Vogelman, B., et al. Correlation of antimicrobial pharmacokinetic parameters with therapeutic efficacy in an animal model. J Infect Dis. 158 (4), 831-847 (1988).
- Craig, W. A. Pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters: rationale for antibacterial dosing of mice and men. Clin Infect Dis. 26 (1), 1-12 (1998).
- Ambrose, P. G., et al. Pharmacokinetics-pharmacodynamics of antimicrobial therapy: it's not just for mice anymore. Clin Infect Dis. 44 (1), 79-86 (2007).
- Ambrose, P. G., Bhavnani, S. M., Owens, R. C. Clinical pharmacodynamics of quinolones. Infect Dis Clin North Am. 17 (3), 529-543 (2003).
- Andes, D. Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of antimicrobials in the therapy of respiratory tract infections. Curr Opin Inf Dis. 14 (2), 165-172 (2001).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).
- Antibiotics in laboratory medicine, 5th edition. Chapter 15: Evaluation of antimicrobials in experimental animal infections. Lorian, V. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2005).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiol Rev. 37 (2), 130-155 (2013).
- Nuermberger, E. Murine models of pneumococcal pneumonia and their applicability to the study of tissue-directed antimicrobials. Pharmacotherapy. 25 (12 Pt 2), 134S-139S (2005).
- Mehrad, B., Standiford, T. J. Use of animal models in the study of inflammatory mediators of pneumonia. ILAR J. 40 (4), 167-174 (1999).
- De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Smith, G. A simple non-surgical method of intrabronchial instillation for the establishment of respiratory infections in the rat. Lab Anim. 25 (1), 46-49 (1991).
- Berry, V., Ferreira-Cornwell, M. C., Singley, C., Woodnutt, G. Development of experimental murine infections caused by H. influenzae and H. parainfluenzae. Clin Microbiol Infect. 7 (S1), 322 (2001).
- Miles, T. J., et al. Novel cyclohexyl-amides as potent antibacterials targeting bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 21 (24), 7483-7488 (2011).
- Miles, T. J., et al. Novel tricyclics (e.g. GSK945237) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 26 (10), 2464-2469 (2016).
- Hoover, J., et al. Pharmacokinetics/pharmacodynamics of peptide deformylase inhibitor GSK1322322 against Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Staphylococcus aureus in rodent models of infection. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), 180-189 (2016).
- Berry, V., Hoover, J., Singley, C., Woodnutt, G. Comparative bacteriological efficacy of pharmacokinetically enhanced amoxicillin-clavulanate against Streptococcus pneumoniae with elevated amoxicillin MICs and Haemophilus influenzae. Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 908-915 (2005).
- Czock, D., Markert, C., Hartman, B., Keller, F. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of antimicrobial drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5 (5), 475-487 (2009).
- Drusano, G. L., Fregeau, C., Liu, W., Brown, D. L., Louie, A. Impact of burden on granulocyte clearance of bacteria in a mouse thigh infection model. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4368-4372 (2010).
- Miles, T. J., et al. Novel hydroxyl tricyclics (e.g. GSK966587) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 23 (19), 5437-5441 (2013).
- Hunt, E. Pleuromutilin antibiotics. Drugs Future. 25 (11), 1163-1168 (2000).
- Jin, Q., et al. Novel LpxC inhibitors with broad-spectrum gram-negative activity. Proceedings of the 44th National Organic Chemistry Symposium.. College Park, MD, , Abstract T-31 (2015).
- Singley, C., Page, R., Hoover, J., Elefante, P., DeMarsh, P. Efficacy of a LRS inhibitor GSK2251052 against Enterobacteriaceae isolates using a computer-controlled infusion system to recreate human PK profiles in rats. Clin Microbiol Infect. 17 (S4), S429-S430 (2011).
- Berry, V., et al. Comparative in vivo activity of gemifloxacin in a rat model of respiratory tract infection. J Antimicrob Chemother. 45 (S1), 79-85 (2000).
- Tsuji, M., et al. S-649266, a Novel Siderophore Cephalosporin: Efficacy against Klebsiella pneumoniae producing NDM-1 or KPC in rat lung infection model with recreated humanized exposure profile of 2 gram dose with 1 hour and 3 hours infusion. Open Forum Infect Dis. 1 (S1), S106-S107 (2014).
- Tsuji, M., et al. Use of Iron Depleted Mueller Hinton Broth (IDMHB) for microdilution testing of S-649266, a novel siderophore cephalosporin. 26th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Amsterdam, Netherlands, , Abstract P0808 (2016).
- Singley, C., Hoover, J., DeMarsh, P. J., Elefante, P., Zalacain, M. Efficacy of PDF Inhibitor GSK1322322 Against Abscess Infections Caused by MRSA Using a Computer-Controlled Infusion System to Recreate Human PK Profiles in Rats. Proceedings of the 60th Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Boston, MA, , Abstract F1-2114 (2010).
- Hoover, J., Mininger, C., Rittenhouse, S. GSK2251052, a novel LeuRS inhibitor, is effective against multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa in a mouse pneumonia model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract B-1308 (2012).
- Hoover, J., Mininger, C., Novick, S., Rittenhouse, S. Efficacy of GSK2140944 against Streptococcus pneumoniae in a non-neutropenic mouse lung infection model. Proceedings of the 53rd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Denver, CO, , Abstract A-014 (2013).
- Hoover, J. L., et al. Selection of a lung infection model to predict efficacy in community-acquired pneumonia (CAP) caused by S. pneumoniae (SP). Proceedings of the 47th Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, Illinois, , Abstract A-17 (2007).
- Drusano, G. L., et al. Saturability of granulocyte kill of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of pneumonia. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2693-2695 (2011).
- Peric, M., Browne, F. A., Jacobs, M. R., Applebaum, P. C. Activity of nine oral agents against gram-positive and gram-negative bacteria encountered in community-acquired infections: use of pharmacokinetic/pharmacodynamic breakpoints in the comparative assessment of beta-lactam and macrolide antimicrobial agents. Clin Ther. 25 (1), 169-177 (2003).
- Calbo, E., Garau, J. Application of pharmacokinetics and pharmacodynamics to antimicrobial therapy of community-acquired respiratory tract infections. Respiration. 72 (6), 561-571 (2005).
- Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2140944 against Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 54th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Washington, DC, , Abstract A-680 (2014).
- Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1270 (2012).
- Andes, D. R., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli using data from a neutropenic murine-pneumonia infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1271 (2012).
