Abstract
L'efficacia di candidati trattamenti antibatterici deve essere dimostrato in modelli animali di infezione, come parte del processo di scoperta e lo sviluppo, preferibilmente in modelli che imitano l'indicazione clinica prevista. Un metodo per indurre infezioni polmonari robusti in ratti e topi immunocompetenti è descritto che permette la valutazione dei trattamenti in un modello di gravi polmonite da S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae o A. baumannii. Gli animali sono anestetizzati, e un inoculo di agar-based si deposita in profondità nei polmoni tramite intubazione endotracheale non chirurgica. L'infezione risultante è coerente, riproducibile e stabile per almeno 48 ore e fino a 96 ore per la maggior parte degli isolati. Studi con antibatterici commercializzati hanno dimostrato una buona correlazione tra l'efficacia in vivo e in sensibilità in vitro, e la concordanza tra farmacocinetica / farmacodinamica obiettivi determinatoin questo modello e gli obiettivi clinicamente accettate è stato osservato. Sebbene non vi sia un investimento di tempo iniziale quando l'apprendimento della tecnica, può essere eseguita rapidamente ed efficientemente una volta raggiunta competenza. I vantaggi del modello comprendono eliminazione del requisito di neutropenia, maggiore robustezza e riproducibilità, capacità di studiare più agenti patogeni e isolati, una maggiore flessibilità nel disegno dello studio e la creazione di una infezione difficile in un host immunocompetenti.
Introduction
Valutare l'efficacia di potenziali farmaci candidati in modelli animali di infezione è una componente fondamentale del processo di scoperta di nuovi farmaci antibatterici. In vivo studi di efficacia forniscono dati importanti per il processo decisionale in tutto l'arco di attività di scoperta, da chiarire le relazioni struttura-attività (SAR) e l'ottimizzazione serie chimica piombo attraverso la determinazione di farmacocinetica-farmacodinamica (PK / PD) caratteristiche di composti e sostenere la selezione della dose per sviluppo clinico e l'approvazione regolamentare. Numerosi modelli di infezione animale sono descritti in letteratura per questi scopi. Uno dei modelli più comuni e diffusi è il neutropenico infezione del mouse coscia, che è stato lanciato da Aquila 1, 2 e successivamente ampliato da Vogelman e Craig 3, 4. Questo modello è stato prezioso per supportare la determinazione dei punti di interruzione di sensibilità batterica e per fornire obiettivi PK / PD per il dosaggio umana. Ci sono molti esamiples dove la capacità predittiva di questo modello è stato dimostrato 4-7. Tuttavia, uno degli svantaggi del modello di infezione coscia è la mancanza di rilevanza diretta per le infezioni polmonari. Vi è ora una maggiore enfasi sulla corrispondenza del sito di infezione in modelli animali al sito di infezione negli esseri umani; e quindi, per studiare composti per il trattamento di polmonite, è ideale per utilizzare un modello di infezione polmonare in animali.
Diversi metodi per indurre infezioni polmonari in animali da laboratorio sono stati descritti ed utilizzati per studi di efficacia antibatteriche compresa intranasale inalazione, l'aspirazione per via orofaringea, l'esposizione dell'aerosol e chirurgica inoculazione intratracheale 8. In molti casi, gli animali (in particolare topi) devono prima essere resi neutropenia per ottenere una infezione polmonare robusta. Nonostante questo stato gravemente immunocompromessi, il numero di batteri patogeni e ceppi che producono infezioni vitali nei roditori èlimitato. Ad esempio, può essere difficile stabilire con successo Haemophilus influenzae o Acinetobacter baumannii in modelli polmonite 9, 10, e anche più virulenti patogeni, come ad esempio lo Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae, può rappresentare sfide 11-13.
Nel 1991, Smith ha descritto un modello di infezione polmonare nei ratti appena svezzati immunocompetenti in cui l'infezione è stata fondata da instillare batteri direttamente nei polmoni tramite un semplice metodo di intubazione endotracheale non chirurgico 14. Berry et al. successivamente modificato il metodo per infettare i topi 15. Usando un inoculo di agar-based, questa tecnica di inoculazione induce infezioni polmonari robusti in ratti e topi immunocompetenti con S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii. Si è suscettibile di una vasta gamma di isolati, comprese quelle ospitare diversi resistdeterminanti ANCE e quelli che non producono una infezione praticabile attraverso altre vie di inoculazione. Consente inoltre l'efficacia da determinarsi animali immunocompetenti, una condizione che è più rilevante rispetto al modello tradizionale del mouse neutropenico per popolazioni di pazienti che non sono gravemente immunocompromessi. La consistenza e l'affidabilità di questo modello su più agenti patogeni e isolati rende particolarmente adatto per studi di efficacia antibatterica.
Protocol
S. pneumonie
Tutte le procedure sono in accordo con i protocolli approvati dalla cura degli animali e Usa Comitato GSK istituzionale (IACUC), e soddisfano o superano gli standard della Associazione americana per l'accreditamento di laboratorio Animal Care (AAALAC), il Dipartimento di Salute e Human Stati Uniti Servizi e tutte le leggi locali e federali benessere degli animali.
NOTA: Se non diversamente specificato, tutte le procedure devono essere eseguite utilizzando una tecnica asettica.
1. coltura batterica Isolati
- Preparare 3 a 6 piastre di agar con S. pneumoniae o H. influenzae, come brodo di coltura in genere non fornisce abbastanza materiale per l'inoculazione.
- Rimuovere un magazzino cultura congelata dalla conservazione a -80 ° C, scongelare completamente, e strisciare fino a 100 microlitri per piastra su agar di soia trittico arricchito con sangue di pecora (S. pneumoniae) o su agar cioccolato (H. influenzae) mediante tecniche microbiologiche standard di. Incubare per una notte a 37 ° C con o senza 5% CO 2.
- Preparare culture brodo con K. pneumoniae, P. aeruginosa o A. baumannii.
- Rimuovere un magazzino cultura congelata dalla conservazione a -80 ° C, scongelare completamente, e un'aliquota di 100 ml di brodo in 50 mL cervello-Heart Infusion (BHI) brodo. Incubare per una notte a 37 ° C agitando delicatamente (circa 120 rpm).
- [Facoltativo] Se una cultura fase di log si desidera, aliquota 1 ml dalla coltura durante la notte risultante in 50 ml di brodo BHI fresco. Incubare per 3 ore a 37 ° C agitando delicatamente (circa 120 rpm).
2. Preparare Saline batteriche Sospensioni
- Per tutte le fasi di preparazione della sospensione (da 2.1 a 2.3), utilizzare soluzione fisiologica sterile ad una temperatura tra aria ambiente e 37 ° C. Harvest crescita durante la notte di S. pneumoniae o H. influenzae dalle piastre di agar da colonie raschiandodalla superficie con un'ansa sterile. Trasferire il materiale raccolto in 5 ml di soluzione fisiologica sterile fino a nuvoloso, la sospensione opaca si ottiene e delicatamente vortex fino omogenea.
- Centrifuga 50 ml di K. pneumoniae, P. aeruginosa o A. baumannii culture brodo finale destinati per l'inoculazione (ad esempio durante la notte o accedere culture di fase) per 5 min a 4500 x g. Rimuovere il surnatante con una pipetta e degli scarti. Risospendere il pellet in almeno 5 ml di soluzione salina sterile e delicatamente vortex per ottenere una sospensione omogenea.
- Se necessario, diluire la sospensione ulteriormente utilizzando soluzione salina sterile per ottenere una densità nell'intervallo da 8 a 9 log 10 unità formanti colonie (CFU) / mL. Rimuovere una aliquota per la determinazione di CFU / mL. In serie diluito e la piastra l'aliquota, come descritto nelle sezioni 7.5 e 7.6.
3. Preparare l'inoculo Agar-based
- Preparare una piccola bottiglia (circa 50 ml) di agar nutriente according alle istruzioni del produttore o fondere una bottiglia di agar nutritivo solido precedentemente preparato e memorizzato. Lasciare raffreddare a circa 50 ° C.
- Trasportare l'agar liquido e tutti gli strumenti necessari e le attrezzature per il processo di infezione per la zona procedura in cui saranno infettati gli animali. Mantenere una piccola vasca d'acqua impostato a 42 ° C nella zona.
- Consentire l'agar per raggiungere una temperatura di circa 50 ° C, e poi un'aliquota 9 mL in una provetta sterile opportunamente dimensionato per adattarsi al bagno d'acqua. Lasciare questo tubo in bagnomaria fino a quando l'agar equilibra a circa 42 ° C. Assicurarsi che l'acqua è ad una profondità che coprirà la superficie del agar nel suo contenitore ma non toccare il tappo o coperchio.
- Aggiungere 1 ml di sospensione batterica fisiologica dal punto 2.3 nella provetta contenente 9 agar mL nel bagno d'acqua. Tappare la provetta, capovolgere più volte per mescolare, e restituirlo al bagnomaria.
4. Anesthetize, Intubare e inoculare Animali
Si consigliano 25 g - patogeno specifico liberi ratti (SPF) immunocompetenti maschi Sprague-Dawley del peso di 100 - 120 g o topi maschi CD-1 del peso di 20: NOTA. Fornire tutti gli animali con cibo e acqua ad libitum e ospitarli socialmente su trucioli di legno o altra biancheria da letto assorbente con cicli di luce-buio 12 h standard.
- Prima di condurre qualsiasi esperimento, ottenere e sterilizzare una cannula di metallo e polietilene tubi della dimensione appropriata per le specie animali. Ottenere sterili 1 ml siringhe monouso e aghi 25-calibro monouso sterili.
Attenzione: Smaltire sempre queste siringhe e aghi in un apposito contenitore.- Per ratti, acquisto o fabbricare una cannula metallica che è di circa 12 cm di lunghezza, ha un ID 0,9 - 1,0 mm OD di 1,0 - 1,2 mm, ed è piegata a un angolo di circa 45 ° ad una estremità. Tagliare una lunghezza 11- a 12 pollici di tubo in polietilene con un ID di 0,4 mm e 0,8 mm OD. (Fare riferimento alla
- Per i topi, l'acquisto di un tubo # 20 l'alimentazione degli animali. Rimuovere la sfera dall'estremità del tubo afferrandolo con le pinze e tirando bruscamente, e poi flettere leggermente l'estremità ad un angolo di circa 45 °. Tagliare una lunghezza 11- a 12 pollici di tubo in polietilene con un ID di 0,28 mm e 0,61 mm OD. Anche l'acquisto e sterilizzare un bicchiere di 100 ml di micro-iniezione siringa e un ago di metallo micro-iniezione da 30 gauge. (Fare riferimento alla Figura 1B).
- Posizionare la cannula metallica in un bicchiere, tubo con tappo a vite e autoclave con metodi standard per sterilizzare. Immergere e negozio di tagliare lunghezze dei tubi di polietilene in una coperta bicchiere contenente alcool.
- Per ratti, acquisto o fabbricare una cannula metallica che è di circa 12 cm di lunghezza, ha un ID 0,9 - 1,0 mm OD di 1,0 - 1,2 mm, ed è piegata a un angolo di circa 45 ° ad una estremità. Tagliare una lunghezza 11- a 12 pollici di tubo in polietilene con un ID di 0,4 mm e 0,8 mm OD. (Fare riferimento alla
- Preparare il piano di lavoro e dispositivo di intubazione.
- Collocare un tappetino monouso pulito sulla superficie di lavoro, in prossimità del bagno d'acqua. Trasferire la cannula metallica, nel suo tubo memoria di vetro, a questa superficie. Togliere il tappo dal tubo di stoccaggio e far scorrere la fine "manico" del Cannula all'estremità aperta del tubo.
- Utilizzando pinze sterili, rimuovere un tratto di tubo di polietilene dal bicchiere e inserirla attraverso l'interno della cannula metallica sterile, facendo attenzione che muove liberamente. Inserire un ago sterile monouso calibro 25 (per i ratti) o sterilizzato 30 gauge metallo ago di una siringa di vetro micro-iniezione (per topi) sull'estremità libera del tubo di polietilene facendo scorrere l'ago alcuni mm nel tubo. (Fare riferimento alla Figura 1A per ratto e Figura 1B per topi).
- segni posto guida sia sulla cannula metallica e tubo di polietilene per indicare la profondità di inserimento nell'animale seguendo la procedura descritta di seguito intubazione su un singolo animale eutanasia. Aprire la cavità toracica per l'osservazione, quindi inserire la cannula metallica correttamente e far avanzare il tubo in polietilene in modo appropriato (come descritto nella Sezione 4.7). L'utilizzo di un pennarello indelebile, marcare la cannula metallica dove si incontra la bocca dell'animale e il politubo etilene dove incontra all'inizio della cannula metallica per facilitare il corretto posizionamento in animali restanti.
- All'interno di una cappa aspirante (o utilizzando un sistema di evacuazione fumi appropriato), anestetizzare fino a 6 animali alla volta in una camera chiusa fornito con ≤5% isoflurano in 1,5 L / min di ossigeno fino il riflesso gag è inibita (circa 1 min).
NOTA: Prima di svolgere alcun esperimento, stabilire la dose e il tempo di esposizione sicura per isoflurano alle condizioni specifiche in uso (ad esempio formato / tipo di camera e la dimensione / specie / ceppo di animale) per evitare l'esposizione involontaria letali. - Riempire una siringa monouso sterile 1 ml (per i ratti) con soluzione salina sterile posizionando la punta sterile nella soluzione salina e tirando indietro lo stantuffo. Riempire la siringa di vetro micro-iniezione sterile (per topi) come descritto di seguito. Attaccare la siringa all'ago montato sul tubo di polietilene, e lavare l'intero volume di soluzione fisiologica attraverso il tubo fino alla Syringe si svuota.
- Per riempire la siringa micro-iniezione (per topi), rimuovere completamente lo stantuffo di metallo e l'ago (montato sul tubo di polietilene) dalla siringa e impostare sia da parte.
- Riempire una siringa monouso sterile 1 ml con soluzione fisiologica sterile (come descritto sopra) e inserire un ago calibro 25 sterile monouso. Inserire l'ago nella parte superiore della siringa micro-iniezione (dove verrà inserito lo stantuffo di metallo), e premere lo stantuffo della siringa monouso fino a riempire la siringa micro-iniezione con soluzione salina.
- Gettare la siringa monouso e aghi che sono stati utilizzati per riempire la siringa di micro-iniezione in un apposito contenitore. Ricollegare il metallo ago micro-iniezione (montato sul tubo di polietilene) alla punta della siringa micro-iniezione e reinserire il pistone metallico, premendo finché l'intero volume di soluzione salina è stato lavato attraverso la siringa e il tubo.
- Riempire la siringa con l'inoculo agar a base di from il recipiente in bagnomaria e agar filo attraverso il tubo fino a che la tubazione è innescato (es completamente riempito con l'agar).
- Per ratti, rimuovere l'ago calibro 25 (montato sul tubo di polietilene) dalla siringa monouso. Gettare la siringa usata in un apposito contenitore. Riempire una nuova monouso 1 siringa sterile mL con l'inoculo agar-based dal contenitore nel bagnomaria posizionando la punta sterile nel inoculo e tirando indietro lo stantuffo. Re-attach ago (montato sul tubo di polietilene) e agar filo attraverso il tubo premendo lo stantuffo appena fino tubo è completamente riempito con agar.
- Per i topi, rimuovere il metallo ago micro-iniezione (montato sul tubo di polietilene) e lo stantuffo di metallo dalla siringa micro-iniezione e mettere da parte. Usando una monouso 1 siringa sterile ml e ago calibro 25 sterile monouso, riempire la siringa micro-iniezione con l'inoculo agar-based dal contenitore nelbagnomaria utilizzando la procedura di riempimento descritto nella Sezione 4.4. Ricollegare il metallo ago micro-iniezione (montato sul tubo di polietilene), inserire lo stantuffo di metallo, e agar filo attraverso il tubo appena fino tubo è completamente riempito con agar.
- Rimuovere un animale dalla camera di anestetico. Posto l'animale in posizione supina sul tappeto monouso con la testa a destra e la coda a sinistra, come mostrato nella Figura 1C.
- Utilizzando il dispositivo di intubazione (cioè la cannula metallica dotata di tubo in polietilene), intubate l'animale e inserire la cannula nel grande lobo del polmone sinistro (Figura 1D).
- Inserire l'estremità libera della cannula metallica nella bocca dell'animale. Ruotare la cannula in modo che l'estremità libera è angolato verso l'alto e leggermente avanzare nella trachea, bypassando attentamente le strutture laringee con un leggero movimento rotatorio. Conferma inserimento nella trachea in contrapposizione allaesofago scorrendo la cannula leggermente in avanti e indietro diverse volte mentre palpazione anelli tracheali con l'indice della mano sinistra, come mostrato nella Figura 1C.
- Quando la cannula raggiunge la biforcazione dove la trachea si divide in bronchi sinistra e destra, fare un leggero movimento rotatorio verso sinistra dell'animale per garantire che la cannula viene inserita nel bronco partita. Far avanzare la cannula metallica fino alla fine è a metà strada per tre quarti lungo il polmone sinistro, utilizzando il marchio guida precedentemente posizionato per confermare che la profondità appropriata è stata raggiunta.
- Con la cannula di metallo in luogo, avanzare il polietilene tubo diverse mm. Utilizzare il marchio guida precedentemente posizionato sulla tubazione per assicurare che avanza solo quanto basta per uscire dalla fine della cannula metallica e non perforare il polmone.
- Con entrambe le cannule in atto, usare la siringa collegata al infondere 100 ml (per i ratti) o 20 ml (per i topi) della sospe agarnsion profondità nel grande lobo del polmone sinistro (Figura 1D). Ritirare diversi millimetri del tubo in polietilene, e quindi rimuovere delicatamente il dispositivo di intubazione intatto. Impostare di nuovo nel tubo di stoccaggio di vetro, e spostare l'animale in una gabbia fresca per recuperare.
- Continuare l'anestesia, intubazione e inoculando gli animali restanti.
- Tra lotti di animali anestetizzati, rimuovere l'ago (montato sul tubo) dalla siringa. Per ratti, scartare la siringa monouso usata in un apposito contenitore e riempire una nuova, siringa sterile monouso da inoculo nel bagno d'acqua. Per i topi, riempire lo stesso bicchiere micro-iniezione siringa dal inoculo nel bagnomaria usando la tecnica di riempimento descritto al punto 4.4.
- Se l'agar comincia ad addensarsi nel dispositivo intubazione, lavare tutto agar rimanente attraverso il tubo. Rimuovere l'ago dalla siringa (lasciando l'ago montato sul tubo di polietilene). Seguire le procedure descrittenella sezione 4.4 per irrigare caldo, soluzione fisiologica sterile attraverso il dispositivo intubazione, ripetendo se necessario per cancellare completamente qualsiasi blocco. Vuoto tutto salina dalla siringa e prepararsi di nuovo l'inoculo agar come descritto nella Sezione 4.5.
- Calcolare l'inoculo batterico finale per animale usando l'CFU determinata dalla sospensione salina (vedere Sezione 2.3), il fattore di diluizione finale della sospensione salina nel agar (ad esempio dieci volte), e il volume instillato negli animali (ad esempio 100 microlitri per ratti o 20 ml per i topi).
5. Valutare animali per Potenziale Mis-inoculazione o altri eventi avversi
- Osservare con attenzione tutti gli animali durante l'intubazione, l'instillazione di agar e il recupero dall'anestesia per valutare il potenziale per mis-inoculazione. eutanasia Immediatamente (secondo le linee guida IACUC locali) qualsiasi animale che sanguina, presenta anomalie della respirazione (come respiro affannoso o senza fiato), non si muovenormalmente circa la gabbia, o non appare dagli occhi brillanti e sani su recupero dall'anestesia.
- In caso di interruzione spontanea della respirazione (di solito quando l'inoculo non è posizionato abbastanza in profondità e blocca le vie respiratorie), confermare la morte per l'osservazione e eseguire un metodo secondario di eutanasia (come dislocazione cervicale o toracotomia).
- Minimizzare la lunghezza di animali temporali sono esposti al isoflurano, come anestesia è necessaria solo per alcuni minuti per eseguire la procedura. Se vengono utilizzati anestetici iniettabili, assicurare gli animali sono sotto osservazione fino a quando completamente sveglio. Posizionare animali, soprattutto topi, in un ambiente riscaldato per il recupero utilizzando anestetici iniettabili.
- Osservare gli animali, almeno due volte al giorno durante il periodo di studio per i seguenti segni di malattie respiratorie: respirazione pronunciato, piloerezione, ridotta attività e la temperatura corporea ridotta. Immediatamente eutanasia (secondo le linee guida IACUC locali) qualsiasi animale che è moribondo, experieNCEs respiro affannoso o difficoltà respiratoria, ha una temperatura corporea notevolmente ridotto sulla manipolazione, non è in grado o non vuole muoversi, o non può raggiungere il cibo e l'acqua.
6. Trattamenti Amministrare prova
- Preparare e somministrare i trattamenti di prova secondo il disegno dello studio previsto. Iniziare la somministrazione dei trattamenti a 1 o 2 ore dopo l'infezione (o ritardare l'ulteriore trattamento se una carica batterica di base superiore è desiderata). I dettagli specifici per la preparazione e la somministrazione di trattamenti prova non può essere somministrato come è dipendente l'obiettivo dello studio e le proprietà di ogni singolo trattamento. (Fare riferimento alla Figura 3 come esempio.)
- Mettere da parte un gruppo di infetti, animali non trattati per servire come controlli di base. Enumerare la carica batterica nei polmoni di questi animali per il trattamento tempo viene avviata per gli altri gruppi, seguendo le procedure descritte nella sezione 7.
- Per le analisi PK / PD, valutareil profilo farmacocinetico del trattamento somministrato (s) nel sangue e / o tessuti di animali infetti. Procedure specifiche per studi di farmacocinetica sono al di fuori del campo di applicazione del presente articolo.
7. enumerare batteri vitali dai polmoni
- Euthanize un gruppo di animali non trattati al momento di avviare il trattamento per gli altri gruppi (basale) e tutti i rimanenti animali alla fine del periodo di studio (di solito 24, 48 o 96 ore dopo l'infezione) di esposizione per inalazione a risalita gradualmente livelli di carbonio anidride all'interno di una camera chiusa oppure un metodo alternativo come raccomandato dalle linee guida IACUC locali. Verificare morte per l'osservazione, ed eseguire un metodo secondario dell'eutanasia (come dislocazione cervicale o toracotomia).
- Posizionare gli animali in posizione supina su una stuoia monouso pulito, e completamente bagnare il pelo sul petto con alcool.
- Utilizzando forbici sterili, tagliare attraverso la pelle, sottostante strato muscolare e cassa toracicaparallela allo sterno per aprire la cavità toracica. cogliere delicatamente i polmoni con pinza sterile e tirare per rimuovere, utilizzando le forbici per separarli dalla trachea, se necessario. Posizionare polmoni su garza sterile per assorbire il sangue in eccesso. Se il cuore è anche stato rimosso, sezionare via e scartare.
- Fare piccoli tagli nei polmoni con forbici sterili per esporre le sezioni interne ed utilizzare pinza sterile per posizionare polmoni (più eventuali pezzi che sono stati inavvertitamente snipped off) nel fondo di una borsa laboratorio frullatore. Brevemente tirare un oggetto rotondo spessore (come una penna o pennarello) sulla parte esterna del sacchetto per schiacciare il tessuto. Pipettare 1 ml di soluzione fisiologica sterile nel sacchetto, posizionare il sacchetto in un frullatore da laboratorio, ed eseguire il frullatore laboratorio ad alta velocità per 2 min.
- Trasferire i campioni omogenati dalle borse miste in tubi o lastre con una pipetta. Diluire l'omogeneizzato dieci volte da aliquotting 1-parte omogeneizzato in 9-parts salina (ad esempio 100 ml omogeneizzato in 900 microlitri Saline). Diluire la sospensione risultante per dieci volte di nuovo in modo simile. Continuare diluendo ogni nuova sospensione risultante da un altro fattore di dieci volte fino a quando almeno 6 diluizioni seriali sono stati preparati dal omogeneizzato originale.
- Aliquote pipetta in triplicato da 20 ml ciascuno da tutte le diluizioni su piastre TSA integrato con sangue di pecora (S. pneumoniae, K. pneumoniae, P. aeruginosa o A. baumannii) o su piastre di agar cioccolato (H. influenzae). Incubare per una notte a 37 ° C, con o senza CO 2. (Vedi Figura 1E per un esempio di una piastra risultante.)
- Contare le colonie in ciascuna delle tre repliche alla prima diluizione che contiene un numero "numerabile" (cioè non troppe colonie da contare ragionevolmente). Calcolare il valore medio delle tre repliche. Determinare la CFU per polmoni moltiplicando il valore medio del 50 (per tenere conto di placcatura 20 ml del totale 1 mlomogenato) e factoring nel fattore di diluizione finale dall'omogeneizzato originale alla quale sono state contate le colonie.
Representative Results
Gli strumenti necessari, orientamento dell'animale, e la profondità di intubazione sono mostrati in Figura 1. Anche mostrato è un esempio rappresentativo di colonie che crescono su una piastra di agar dopo la diluizione seriale e la placcatura triplice copia di un campione omogenato polmone. Un aumento della carica batterica di vari log 10 CFU sopra controlli di base è tipicamente osservata nei polmoni infetti per isolati batterici più, anche dopo l'infezione, 96 h, e la variabilità tra animali è basso (figura 2). Per alcuni H. influenzae, ci può essere poca crescita; tuttavia, l'infezione non dovrebbe cominciare ad auto-determinazione entro un periodo di tempo 48 o 96 ore (Figura 2B). Questo modello di infezione polmonare può essere utilizzato durante l'ottimizzazione di serie chimica piombo per sostenere SAR, come mostrato in figura 3 per i composti rappresentativi di due diverse serie 16, 17. Esso fornisce un costante, riproducibile incontratohod per valutare PK / PD negli animali immunocompetenti ed è stato utilizzato per determinare quella zona libera di droga sotto la curva concentrazione-tempo sopra la concentrazione minima inibente (fAUC / MIC) correlata con l'efficacia di un polipeptide deformylase romanzo (PDF) inibitore contro S. pneumoniae e H. influenzae (Figura 4). Inoltre, gli obiettivi / MIC fAUC per stasi e un 1-log 10 CFU riduzione dai controlli di base sono stati determinati attraverso 11 S. pneumoniae e 5 isolati H. influenzae (Tabella 1) 18. Accoppiamento questo modello di infezione con un sistema di somministrazione di farmaci per ricreare profili farmacocinetici umani in ratti crea un potente strumento per valutare regimi di dosaggio umani prima degli studi clinici. Un esempio di questo è riassunto nella tabella 2, il che dimostra che una formulazione a rilascio prolungato di amoxicillina-acido clavulanico è stato più efficace regimi di dosaggio esistenti per gli organismi con ElevaTed MIC Valori 19.
Figura 1: non chirurgico intratracheale intubazione. Gli strumenti sono indicati per intubazione ratto (A) e il mouse (B). Una volta anestetizzato, l'animale deve essere posizionato come mostrato in C, con la testa a destra e la coda a sinistra se la persona che esegue la tecnica è destrorso. Mettere il dito indice sinistro delicatamente sulla gola per aiutare a palpare gli anelli tracheali per la conferma del posizionamento della cannula corretta. L'inoculo deve essere collocato in profondità nel polmone sinistro, come mostrato nella vista ventrale di un polmone di ratto (D). Le colonie che crescono su agar dopo diluizione seriale e placcatura di un campione dovrebbe apparire simile a quello mostrato in E. Figura 1D, Copyright © Gill Smith [animali da laboratorio, Volume 25 (1991), G. Smith, Ametodo non chirurgico semplice di instillazione endobronchiale per la costituzione delle infezioni respiratorie nel ratto, pagine 46 - 49] 14. Ristampato con il permesso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: esempi rappresentativi di batterica crescita nei polmoni di animali infetti. Media ± deviazione dati CFU standard da N = 5 animali / gruppo viene mostrato per diversi isolati di S. pneumoniae (A), H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) e A. baumannii (E). La prima barra di ogni coppia (grigio chiaro) è la linea di base bacteonere rial a infezioni post 1 o 2 ore, mentre il secondo bar è il controllo della crescita di fine studio a 48 ore dopo l'infezione (grigio scuro) o infezione dopo 96 h (nero). sono stati applicati No Metodi Censura dati; in tal modo, questi risultati includono i dati provenienti da tutti i 5 animali per gruppo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: valutare l'efficacia delle varie serie chimica durante l'ottimizzazione di piombo. modelli di infezione polmonare, utilizzando le tecniche descritte sono stati utilizzati per esplorare le relazioni struttura-attività come parte di tipo abacterial programma IIA topoisomerasi. Promettenti composti 7 e 1 sono stati valutati contro i chinoloni-sensibili (A) 16 o resistenti ai chinoloni(B) 17 isolati di S. pneumoniae, rispettivamente. Ciascun simbolo rappresenta CFU determinato dai polmoni di un ratto con linee che rappresentano il gruppo media e deviazione standard. Limite inferiore di quantificazione (LLQ) era 1,7 log 10 CFU / polmoni. I composti sono stati pesati (56 o 112 mg di pura molecola genitore gratuito), sciolto in 9 ml di acqua sterile, diluita 3 ml in 3 ml di acqua (1: 1) e gestito da sonda gastrica di 1 ml / 125 g di ratto due volte al giorno ( 6 - 7 h a parte) per 2 giorni, a partire da dopo l'infezione 1 h. controlli non trattato (NTC) sono stati campionati dopo l'infezione 1 h per basale o trattate con soluzione salina e campionati alla fine dello studio (48 h) per i controlli di crescita. Figura 3A ristampato da Bioorganici & Medicinal Chemistry Letters, Volume 21, TJ Miles et al, Novel cicloesil-amidi come antibatterici potenti di targeting di tipo batterico IIA topoisomerasi, Pages 7483 -. 7488, Copyright (2011) 16, con il permesso di Elsevier.Figura 3B ristampato da Bioorganici & Medicinal Chemistry Letters, Volume 26, TJ Miles et al, triciclici Novel (ad es GSK945237) inibitori come potenti di tipo batterico IIA topoisomerasi, Pagine 2464 -. 2469, Copyright (2016) 17, con il permesso di Elsevier. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: PK / PD Caratterizzazione di un inibitore PDF Novel. Modelli Emax sono stati creati utilizzando dosi che vanno dati di efficacia nei topi immunocompetenti infettati nel polmone con isolati di S. pneumoniae (A) o H. influenzae (B) per determinare gli obiettivi PK / PD per un inibitore PDF novel 18. Circlesrappresentare la carica batterica media 4-5 topi / gruppo trattato con dosi variabili di composto. Le analisi sono state eseguite per correlare l'efficacia con libera dalla droga 24 ore AUC (circoli aperti) o AUC / MIC (cerchi pieni). Ristampato con il permesso, Copyright © American Society for Microbiology, [agenti antimicrobici e Chemioterapia, il volume 60, 2016, pagine 180 - 189] 18. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Stasi | 1-log 10 riduzione | ||||||
| Organismo | MIC (mg / ml) | R 2 per linea fit (%) | fAUC | fAUC / MIC | fAUC | fAUC / MIC | Max uccisione (log 10 riduzione) |
| S. pneumoniae | |||||||
| 10127 | 0.25 | 99,9 | 2.0 | 8.1 | 3.6 | 14.4 | 2.8 |
| 1316009S | 0.25 | 96.1 | 6.5 | 26.0 | 15.1 | 60.3 | 1.8 |
| ATCC10813 | 0.5 | 100 | 8.4 | 16.9 | 22.2 | 44.5 | 1.2 |
| 1307007S | 1 95,8 | 16.1 | 16.1 | 20.1 | 20.1 | 2.7 | |
| ATCC6303 | 1 | 99,8 | 19.8 | 19.8 | 24.8 | 24.8 | 2.8 |
| 1629 | 2 | 100 | 15.8 | 7.9 | 21.2 | 10.6 | 2.4 |
| 298.443 | 2 | 99,9 | 26,5 | 13.2 | 31,0 | 15.5 | 2.3 |
| 336.808 | 2 | 86 | 8.2 | 4.2 | 19,0 | 9.5 | 2.6 |
| 338.860 | 2 | 99.5 | 2.9 | 1.5 | 6.7 | 3.4 | 2.8 |
| & #160; 340449 | 2 | 94,6 | 8.0 | 4.0 | 14.9 | 7.4 | 2.1 |
| L11259 | 2 | 100 | 7.1 | 3.5 | 9.0 | 4.5 | 2.0 |
| Media ± DS | NA un | N / A | 11.0 ± 7.5 | 11.0 ± 7.9 | 17.0 ± 8.2 | 19.5 ± 17.8 | 2.3 ± 0.5 |
| Mediano | N / A | N / A | 8.2 | 8.1 | 19,0 | 14.4 | 2.4 |
| H. influenzae | |||||||
| 1998-100-126H | 1 | 99,7 | 7.3 | 7.3 | 13.4 | 13.4 | 2.9 |
| 503-008H | 1 | 99,8 | 7.1 | 7.1 | 13.9 | 13.9 | 2.7 |
| 08003H | 2 | 99,9 | 14.5 | 7.2 | 16,7 | 8.3 | 2.7 |
| H128 | 2 | 96.6 | 15.3 | 7.6 | 26.0 | 13,0 | 2.7 |
| 19001H | 4 | 91,9 | 14.8 | 3.7 | 37.3 | 9.3 | 3.0 |
| Media ± DS | N / A | N / A | 11.8 ± 4.2 | 6.6 ± 1.6 | 21.5 ± 10.2 | 11.6 ± 2.6 | 2.8 ± 0.1 |
| Mediano | N / A | N / A | 14.5 | 7.2 | 16,7 | 13,0 | 2.7 |
| un NA, non applicabile. | |||||||
Tabella 1: PK / PD Obiettivi per un inibitore PDF romanzo contro S. pneumoniae e H. influenzae Isolati. AUC libera dalla droga e AUC / MIC obiettivi di stasi e un 1-log 10 CFU riduzione dal basale sono stati determinati per 11 S. pneumoniae e 5 H. influenzae in topi immunocompetenti infettati nel polmone e trattati con il composto 18. il DATuna è stata utilizzata per aiutare a selezionare le dosi umane per lo sviluppo clinico. Questa tabella è stata adattata e ristampato con il permesso, Copyright © American Society for Microbiology, [agenti antimicrobici e Chemioterapia, il volume 60, 2016, pagine 180 - 189] 18.
| Gruppo di trattamento a | Significano log 10 S. pneumoniae (CFU / polmone) b ± SD per ceppo (AMX / CA MIC): | |||||||
| 05010S (2 mg / ml) | 16001S c (4 mg / ml) | 16001S (4 mg / ml) | 30005S (4 mg / ml) | 20009S (4 mg / ml) | 05003S (8 mg / ml) | 404.053 (8 mg / ml) | 47003S (8 mg / ml) | |
| Controllo | 7.3 ± 0.4 | 7,0 ± 0,8 | 5.7 ± 1.2 | 7.1 ± 0.7 | 7.1 ± 0.4 | 6.4 ± 0.6 | 6.8 ± 0.4 | 6.0 ± 0.3 |
| AMX / CA | ||||||||
| 2.000 / 125 mg bid (rapporto 16: 1) | ≤ 1,7 ** | 2.8 ± 1.2 ** | 2.2 ± 0.8 ** | 2.3 ± 0.9 ** | 2,5 ± 0,9 ** | 2.0 ± 0.9 ** | 3.8 ± 1.4 ** | 1.8 ± 0.2 ** |
| 1.000 / 125 mg tre volte al giorno (rapporto 8: 1) | NT | NT | 2.8 ± 0.5 ** | 2.7 ± 1.3 ** | 3.3 ± 0.9 ** | 4.9 ± 0.5 ** | 6.6 ± 1.3 | 4.7 ± 0.7 ** |
| NT | NT | 3.0 ± 1.3 * | 2.1 ± 0.7 ** | 3.2 ± 0.4 ** | 5.2 ± 0.9 * | 6.4 ± 0.6 | 4.9 ± 0.4 ** | |
| 875/125 mg bid (rapporto 7: 1) | NT | NT | 4,5 ± 1,2 * | 5.6 ± 1.3 * | 5.2 ± 0.7 ** | 6.3 ± 0.7 | 6.4 ± 0.7 | 5.5 ± 0.4 |
| 500/125 mg tre volte al giorno (rapporto 4: 1) | 3.1 ± 1.3 ** | 4,5 ± 0,9 ** | NT | NT | NT | NT | NT | NT |
| Azitromicina, 1.000 / 500 mg od | NT | NT | NT | 5.8 ± 2.0 | 7.1 ± 0.9 | 3.1 ± 1.0 ** | 6.6 ± 0.4 | 6.07; 0.6 |
| Levofloxacina, 500 mg od | NT | NT | 4.2 ± 0.8 * | 5.7 ± 0.8 * | 4.9 ± 0.8 ** | 3.0 ± 1.3 ** | 3.5 ± 0.2 ** | 3.9 ± 0.8 ** |
| Gruppo di trattamento d | Media log 10 H. influenzae (CFU / polmone) ± SD per ceppo: | |||||||
| H128 (β-lattamasi positivi) | Chesterfield (β-lattamasi negativo, resistente ampicillina) | |||||||
| Controllo | 6.4 ± 0.6 | 6,7 ± 0,6 | ||||||
| AMX / CA | ||||||||
| 2.000 / 125 mg bid (rapporto 16: 1) | 2.0 ± 0.7 ** | 3.1 ± 0.9 ** | ||||||
| 1.000 / 125 mg tre volte al giorno (rapporto 8: 1) | 2.1 ± 1.0 ** | 3.6 ± 1.1 ** | ||||||
| 875/125 mg TID (rapporto 7: 1) | 2.8 ± 1.3 ** | 3.8 ± 1.3 ** | ||||||
| 875/125 mg bid (rapporto 7: 1) | 2.0 ± 0.8 ** | 5.1 ± 1.1 ** | ||||||
| Azitromicina, 1.000 / 500 mg od | 3.2 ± 1.7 * | 5.8 ± 1.1 | ||||||
| Levofloxacina, 500 mg od | ≤ 1,7 ** | ≤ 1,7 ** | ||||||
| un AMX / CA, amoxicillina-acido clavulanico; offerta, due volte al giorno; tid., tre volte al giorno; od una volta al giorno. | ||||||||
| B Il limite di rilevazione è stato <1,7; *, Significativamente differenti dal controllo (P ≤ 0,05); **, Significativamente differenti dal controllo (P ≤ 0,01); NT, non testato. | ||||||||
| c Strain 16001S è stato testato in due esperimenti separati. | ||||||||
| d amoxicillina-acido clavulanico 500/125 mg (4: 1) tre volte al giorno non è stato testato contro i ceppi di H. influenzae. | ||||||||
Tabella 2: Efficacia di Recreated plasma umano profili di esposizione per i diversi Amoxicillina / Clavulanate regimi di dosaggio. I dati generati nei ratti infetti immunocompetenti nel polmone con isolati di S. pneumoniae o H. influenzae che utilizzano questo modello hanno dimostrato che una migliore formulazione di amoxicillina-acido clavulanico (2, 000/125 mg due volte al giorno) è stato più efficace di regimi di dosaggio standard, nei confronti di isolati con elevata sensibilità in vitro 19. Questa tabella è stata adattata e ristampato con il permesso, Copyright © American Society for Microbiology, [agenti antimicrobici e Chemioterapia, il volume 49, 2005 pagine 908 - 915] 19.
Discussion
Per il successo ottimale nel riprodurre questo modello di infezione, i seguenti suggerimenti supplementari dovrebbero essere prese in considerazione. Virulenza dei nuovi isolati può essere migliorata passaging 2 - 3 volte in vivo prima utilizzazione in uno studio. Ceppi batterici congelati devono sempre essere preparati da un primario in vivo fonte -derived con il minor numero di passaggi possibile rispetto all'originale, e ricongelamento o riutilizzo del magazzino scongelati è scoraggiato. Utilizzando isolati clinici recenti recuperati da pazienti affetti da polmonite, e / o la preparazione di culture in crescita fase di registro può anche contribuire a migliorare istituzione dell'infezione. Una diluizione di cinque volte in agar (ad esempio 2 ml di sospensione salina aggiunto 8 mL agar) può essere usato al posto di dieci volte per aumentare l'inoculo batterico, e il volume inoculo può essere regolata in base alle dimensioni dell'animale (es 200 ml / animale di solito è inoculati in 250 g ratti). Prima dell'aggiunta della sospensione batterica salina nelagar (cioè al punto 2.3), la densità batterica può essere prevista o stimata mediante ispezione visiva, gli standard MacFarland o misure di densità ottica. E 'utile per acquisire familiarità con le caratteristiche di crescita in vitro per ogni isolato prima di condurre esperimenti in vivo. Consistenza della crescita e movimentazione consente la stima più accurata della densità batterica per un dato isolato. metodi microbiologici standard diversi da quelli descritti, ad esempio media e omogeneizzatori tessuto alternativa, possono essere utilizzati come appropriato per la preparazione di inoculi e la conta dei batteri da tessuti infetti.
Si consiglia vivamente di preparare o sciogliere l'agar il giorno prima dell'esperimento e riporlo durante la notte in un bagno d'acqua separata impostato a 50 ° C. Ciò semplifica il processo e contribuire guardia contro l'agar essere troppo caldo al momento dell'infezione. Una temperatura di 41-42 ° C raggiunge un buon equilibrio tra manutenzione suning l'agar allo stato liquido, senza essere troppo caldo per la sopravvivenza dei batteri a breve termine. Come possibile alternativa agar nutritivo, nobile agar è stato usato con successo in alcuni esperimenti. Un tubo di agar inoculo è solitamente sufficiente per un intero esperimento (ed è raccomandato), ma più provette può essere preparato per infettare un gran numero di animali (ad esempio più di 60), o quando il processo infettare richiede più di 30 - 45 min Se più tubi inoculo sono necessari, aggiungere la sospensione batterica salina per ciascun tubo di agar in quanto è necessario. Questo riduce il rischio che la sopravvivenza e / o idoneità batterica saranno influenzati dalla prolungata esposizione ad una temperatura elevata prima dell'inoculo. Va notato che utilizzano tubi inoculo multipli possono anche richiedere ulteriori procedure animale randomizzazione. Per quanto possibile, di infettare tutti gli animali della stessa preparazione inoculo. Si consiglia di adattare la dimensione di esperimenti per l'attuale livello di competenza con la TEchnique.
Uno scienziato esperto può intubazione e inoculare un animale in meno di 30 s e inoculare fino a 5 - 6 animali per partita (ossia con una siringa piena di inoculo agar). Per coloro apprendimento della tecnica, la velocità è importante come agar inizierà a solidificare; Tuttavia, il posizionamento accurato del inoculo è più importante. Iniziare con 1 o 2 animali per partita, e aumentare la tecnica diventa più familiare. Gli animali continuano a respirare durante l'intubazione; pertanto, la finestra temporale per l'inoculazione dipende da quanto velocemente l'animale recupera da isoflurano, che dovrebbe essere di circa 2 - 3 min. Gli animali che risvegliano durante il processo possono essere ri-anestetizzati e hanno tentato una seconda volta, ma non è raccomandato di farlo più volte. inoculazione di successo al primo tentativo è previsto in quasi il 100% degli animali una volta che si ottiene competenza. Si noti che è più facile imparare la tecnica utilizzando ratti prima; topi sono più delicate e minore troppoLS sono più inclini a blocco con agar solidificato se non manipolato in fretta. siringhe pre-riscaldamento, tubi e saline così come mantenere il dispositivo di intubazione su una superficie calda (non bollente), come ad esempio una piastra elettrica sulla regolazione bassa, possono aiutare a prevenire la solidificazione del agar. Quando imparare la tecnica, è anche utile per praticare il corretto posizionamento del inoculo utilizzando un colorante di colore scuro (come il blu di metilene concentrato) invece della sospensione batterica in agar. Eseguire la procedura descritta, ma l'eutanasia dell'animale subito dopo l'inoculazione del colorante (non permettendo all'animale di recuperare tra anestesia e l'eutanasia). Sezionare per determinare dove il colorante è stato immesso, e regolare tecnica conseguenza.
L'endpoint primario in questo modello è CFU dai polmoni infetti. La sopravvivenza non è un buon indicatore di carica batterica e non è un endpoint consigliato. Per gli studi di efficacia, la suggerita N è di 5 - 6 animali per gruppo come questo è predicted per rilevare ≥1 log10 differenze CFU tra i gruppi con almeno il 90% di potenza. Gli animali possono essere infettati in gruppi in modo tale che compagni di gabbia rimangano insieme, o di un vero e proprio processo di randomizzazione possono essere seguiti. Si noti che se i gruppi sono assegnati da gabbia, i gruppi dovrebbero essere infettati in sequenza casuale con i controlli di crescita di fine studio infetti ultima (per confermare che la sopravvivenza batterica / fitness non è stata influenzata dalla lunghezza del tempo esposto ad una temperatura elevata nel bagnomaria). Metodi dati censurare dovrebbe essere necessario, e nessuno è consigliato con l'eccezione di rimozione immediata di qualsiasi animale che è stata ovviamente mis-inoculati all'inizio dello studio (prima dell'inizio di eventuali trattamenti). Gli animali che sono eutanasia prima della fine dello studio dovrebbero essere campionati e risultati incluse nei set di dati a meno che un motivo valido per l'esclusione è stata identificata in modo prospettico (vale a dire un evento estraneo alla infezione o trattamento). riporto farmaco può affect alcuni campioni ed è una considerazione importante in tutti i modelli di infezione in vivo. Se un composto viene determinata frequenza, vicino al tempo dell'eutanasia o ha una lunga emivita, può essere presente nel tessuto omogenato ad una concentrazione sufficientemente elevata per continuare a uccidere i batteri ex vivo durante il processo di enumerazione batterica (diluizione e la placcatura di i campioni o sulle piastre di agar durante l'incubazione durante la notte). Per evitare questo, carbone attivo e / o un additivo che degrada la molecola attiva senza danneggiare le cellule batteriche possono essere aggiunti al campione prima della omogeneizzazione. Altri metodi includono centrifugazione dei campioni per rimuovere la maggior parte del composto attivo (che dovrebbe rimanere nel supernatante) e impiegando diversa diluizione e placcatura regimi diluire sufficientemente composto attivo ad una concentrazione non-inibitrice.
Come evidenziato dagli esempi illustrati nella Figura 2, questo modello con successo induces infezioni polmonari nei roditori con una vasta gamma di organismi, compresi quelli che non crescono bene in altri modelli (ad esempio H. influenzae). Queste infezioni sono coerenti e riproducibili, riducendo la probabilità che dovranno essere ripetuti a causa di insufficienza modello e / o scarso rendimento con un dato isolato esperimenti. Anche se gli animali sono immunocompetenti, non sono in grado di risolvere rapidamente l'infezione, se non del tutto. Questo consente una maggiore flessibilità nella durata dello studio, come molti isolati mantengono una infezione fattibile attraverso almeno 96 h senza la necessità di iniezioni ripetute di mantenere neutropenia. Il potenziale vantaggio di studiare l'efficacia antibatterica negli animali immunocompetenti è stato notato in precedenza 20, 21, e ci sono prove che, per alcuni composti (ad esempio ossazolidinoni), i dati di roditori non neutropenici possono più prevedere con precisione obiettivi di esposizione umani rispetto a quelli neutropenia reso 5. L'utilità polivalente tegli modello è dimostrata nelle figure 3 e 4 e tabelle 1 e 2. Questi studi sono parte di una grande raccolta di dati pubblicati e non pubblicati che è stato generato con questo modello di sostenere gli sforzi di ottimizzazione di piombo 16, 17, 22-24, per il confronto e la conferma del dosaggio umano proposto regimi 19, 25-29 e PK / PD caratterizzazione 18, 30-32 .While questo modello è inizialmente più complesso per condurre rispetto al metodo intranasale inalazione, ci sono molti vantaggi come descritto sopra. Con la pratica e l'uso di routine, le tecniche dovrebbero diventare semplice da eseguire.
Si può osservare in alcuni studi che la carica batterica al basale era inferiore a quello tipicamente mirata in altri modelli di infezione polmonare. Ciò è dovuto in gran parte alla diluizione richiesta in agar e il volume sfida piccola, particolarmente nei topi. Tuttavia, dovrebbe anche essere notatoche la crescita batterica è stata osservata in tutti i casi, anche quando il peso iniziale era relativamente basso. La carica batterica di riferimento obiettivo è 6-6,5 log10 CFU / polmoni (6.8 a 7.3 log 10 CFU / g di tessuto nei topi a base di peso medio del polmone), che corrisponde a densità stimate in pazienti umani con grave polmonite 33. Un fardello basale superiore può essere ottenuto concentrare ulteriormente l'inoculo batterico o ritardando l'inizio della somministrazione composti per consentire la crescita batterica supplementare; tuttavia, aumentando il carico sfida troppo può portare a malattie anormalmente grave ed acuta (cioè la morte in meno di 24 ore), che è refrattario a tutti i trattamenti antibatterici a prescindere di suscettibilità. Anche se l'inoculo è inizialmente posizionato preferibilmente nel polmone sinistro dell'animale, l'infezione si diffonde generalmente in entrambi i polmoni. malattia progressiva dei polmoni, la diffusione dei batteri ad altri organi, e l'eventuale morbidità è spesso observEd con S. pneumoniae, K. pneumoniae e P. aeruginosa. Di interesse, infezioni da H. influenzae e A. baumannii di solito sono più contenuti e raramente portano alla morte nel inoculi batterica prescritto.
I risultati di efficacia ottenuti da questo modello hanno correlato bene con i profili di sensibilità in vitro così come bersagli PK / PD definiti. Riduzioni di carica batterica sono regolarmente osservati per isolati ritenuti suscettibili all'agente in prova, mentre quelli mostre resistente considerati nessun cambiamento o crescita batterica sopra il basale 16, 17, 19, 24-29. Studi condotti su ratti valutano due chinoloni e un macrolide utilizzando questo modello 32 hanno dimostrato che la porta PK / PD necessarie per un 1-log 10 riduzione S. pneumoniae rispetto al basale correlata con l'obiettivo determinato topi neutropenici e, soprattutto, con obiettivi clinici per pneum batterica acquisita in comunitàonia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, un nuovo meccanismo di antibiotici, è stato testato contro multipla S. pneumoniae e ha richiesto un simile obiettivo PK / PD per un 1-log 10 riduzione di questo polmone modello di infezione 31 come quello richiesto per un 1-log 10 riduzione, nel modello coscia neutropenico 36 in cui la penetrazione del polmone è stato preso in considerazione (i dati su file). Allo stesso modo, i PK / PD obiettivi stabiliti nei topi per GSK2251052 contro P. aeruginosa sono stati coerenti per la stasi, 1 e 2 log10 riduzioni CFU tra questo modello polmone 30 e il modello di infezione coscia neutropenia in cui la penetrazione del polmone era considerato 37, 38 . Correlazione con un modello di infezione polmonare neutropenia con l'inoculazione intranasale era povera; tuttavia, GSK2251052 non produceva più di una risposta statica in questo studio 38. Questo può essere attribuibile alla inoculo batterico superiore, che era 8 log 10 CFU / topo rispetto ai 6 log
Esistono diverse limitazioni di questo modello polmonite immunocompetenti. In primo luogo, non è ben adatto a valutare comparsa di resistenza spontanea perché l'alto inoculo batterico generalmente richiesto per tali studi si traduce in troppo grave un'infezione. Dopo i tentativi di raggiungere oneri batteriche di 7 o 8 log 10 CFU al basale, la rapida morbilità è stato osservato (cioè gli animali che diventano moribondo in meno di 24 ore), nonostante il lavaggio accurato della inoculi per eliminare le tossine pre-esistente (dati su file). essopuò essere possibile superare questo problema utilizzando i roditori più grandi. Ratti, ratti particolarmente pesanti (> 250 g), sembrano tollerare meglio superiore inoculi rispetto a topi e possono essere adatti per questi tipi di studi. Una seconda limitazione è che l'uso di agar come un'infezione-enhancer può precludere utilizzando il modello per la valutazione di alcuni host: patogeno. Si ritiene che l'agar fornisce un punto focale protetta fino infezione è completamente stabilito all'interno del polmone. E 'possibile consegnare l'inoculo in soluzione salina invece di agar per aiutare a superare questo problema; Tuttavia, va notato che questo produrrà soltanto l'infezione con alcuni isolati. In terzo luogo, vi è una curva di apprendimento ripida necessaria per diventare esperti nella tecnica. La procedura può essere delicato, soprattutto nei topi. È facile posizionare erroneamente la cannula metallica nell'esofago, e forza eccessiva può portare alla puntura sia dell'esofago o della trachea. posizionamento attento del inoculo è anchetenuti o animali possono o non recuperare o non essere adeguatamente infetti. Tuttavia, con pazienza e perseveranza, si può diventare altamente competente ed eseguire la tecnica in modo rapido, agevole e preciso.
Rimuovendo il requisito per la neutropenia, aumentare la robustezza e la riproducibilità, permettendo ai ricercatori di studiare di più agenti patogeni e isolati, migliorare la flessibilità del disegno sperimentale e di fornire una infezione difficile da caratterizzare farmacodinamica per la polmonite, questo modello infezione polmonare immunocompetenti aggiunge valore sostanziale alla scoperta di antibiotici comunità. Un maggiore uso di questo modello dagli investigatori ulteriori contribuirà a fornire l'analisi comparativa necessario per la sua guadagnare più diffusa accettazione e continuare a fornire informazioni di supporto per l'interpretazione appropriata.
Disclosures
Gli autori sono tutti dipendenti della GlaxoSmithKline Pharmaceuticals e azioni proprie di azioni versate all'interno della società.
Acknowledgments
JH desidera riconoscere e ringraziare mentore, amico ed ex direttore di Valerie Berry per primo ci ha insegnato questo modello; e Gary Woodnutt, che ci ha insegnato le basi della e ispirato il nostro impegno nel campo della antibatterico PK / PD. Tutti gli autori desiderano ringraziare David Payne per il suo sostegno e apprezzamento per la nostra scienza. Vorremmo riconoscere la nostra prima in vivo colleghi di microbiologia che hanno contribuito al corpo di dati generati utilizzando questi metodi, soprattutto Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni Page e Nerissa Simon. Infine, il nostro ringraziamento va ai nostri colleghi in vitro microbiologia per la loro assistenza, in particolare per la fornitura di tutte le MIC noi richiesta (Lynn McCloskey, Josh occidentale e Sharon min); e per il nostro team di microbiologia clinica che offre consulenza e supporto (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman e Deborah Butler).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
| Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
| BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
| BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
| Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
| 0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
| Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
| 30 mL free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100 mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
| Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
| 90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
| 1 mL TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| Animal feeding needle - straight 20 x 3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
| Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand - Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
| 75 TN 5.0 µL syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
| Pyrex tube, culture 25x150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
| 70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
| Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
| Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
| Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
| Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |
References
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