Abstract
Effekt av kandidat antibakteriell behandling må demonstreres i dyremodeller med infeksjon som en del av oppdagelsen og utviklingen prosess, fortrinnsvis i modeller som etterligner den tiltenkte kliniske indikasjon. En fremgangsmåte for å indusere robuste lungeinfeksjoner hos immunkompetente rotter og mus er beskrevet som gjør det mulig for vurdering av behandlinger i en modell for alvorlig lungebetennelse forårsaket av S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae eller A. baumannii. Dyrene ble bedøvet, og en agar-baserte inokulum avsettes dypt i lungene via ikke-kirurgisk intratrakeal intubering. Den resulterende infeksjon er konsekvent, reproduserbar og stabil i minst 48 timer og opp til 96 timer for de fleste isolater. Studier med markeds antibakterielle midler har vist god korrelasjon mellom in vivo effekt og in vitro-følsomhet, og samsvar mellom farmakokinetiske / farmakodynamiske mål bestemmesi denne modellen og klinisk aksepterte mål har blitt observert. Selv om det er en innledende tid investering når lære teknikken, kan den bli utført hurtig og effektivt når dyktighet er oppnådd. Fordeler med modellen inkluderer eliminering av nøytropeni kravet, økt robusthet og reproduserbarhet, evne til å studere flere patogener og isolerer, økt fleksibilitet i studiedesign og etablering av en utfordrende infeksjon i en immunkompetente vert.
Introduction
Evaluere effekten av potensielle legemiddelkandidater i dyremodeller av infeksjon er en kritisk komponent i den antibakterielle stoffet funnet prosessen. In vivo effektstudier gi viktige data for beslutnings over span av funn innsats fra belyse struktur-aktivitetsforhold (SAR) og optimalisere leder kjemiske serien gjennom å bestemme farmakokinetisk-farmakodynamiske (PK / PD) karakteristikk av forbindelser og støtte utvalg dose for klinisk utvikling og myndighetsgodkjennelse. Tallrike dyr infeksjonsmodeller er beskrevet i litteraturen for disse formål. En av de vanligste og mest brukte modellene er nøytropeni musen lår infeksjon, som ble utviklet av Eagle 1, 2 og senere utvidet med Vogelman og Craig tre, fire. Denne modellen har vært uvurderlig for å støtte fastsettelse av bakterielle følsomhetsbrytningspunkter og for å gi PK / PD mål å veilede menneske dosering. Det er mange eksamensipper hvor den prediktive evnen til denne modellen har vist seg 4-7. Imidlertid er en av ulempene med låret infeksjonsmodell er mangelen på direkte relevans til lungeinfeksjoner. Det er nå en større vekt på matchende stedet for infeksjon i dyremodeller til området for infeksjon hos mennesker; og således, for å studere forbindelsene for behandling av lungebetennelse, er det ideelt å anvende en lungeinfeksjon modell i dyr.
Flere metoder for å indusere lungeinfeksjoner i forsøksdyr har blitt beskrevet og benyttet for antibakterielle effektstudier inkludert intranasal innånding, aspirasjon via orofaryngeal rute, aerosol eksponering, og kirurgisk intratrakeal inokulasjon åtte. I mange tilfeller må de dyr (særlig mus) først bli gjengitt nøytropeni for å oppnå en robust lungeinfeksjon. Til tross for dette alvorlig immunsvikt tilstand, er antall bakterielle patogener og stammer som produserer levedyktige infeksjoner hos gnagerebegrenset. For eksempel kan det være vanskelig å kunne etablere Haemophilus influenzae eller Acinetobacter baumannii i pneumoni modeller 9, 10, og enda mer virulente patogener, slik som Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa og Klebsiella pneumoniae, kan by på utfordringer 11-13.
I 1991, Smith beskrev en lungeinfeksjon modell i immunkompetente weanling rotter der infeksjon ble etablert av instilling bakterier direkte inn i lungene via en enkel nonsurgical intratrakeal intubasjon metode 14. Berry et al. senere modifisert metode for å infisere mus 15. Ved hjelp av en agar-baserte podestoff, induserer denne vaksinen teknikken robuste lungeinfeksjoner i både immun rotter og mus med S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa og A. baumannii. Det er mottagelig for et bredt spekter av isolater, inkludert de husing forskjellige motståkrings determinanter og de som ikke produserer en levedyktig smitte via andre inokulasjon ruter. Det gir også effekt skal fastsettes i immunkompetente dyr, en tilstand som er mer relevant enn den tradisjonelle nøytropeni musemodell for pasientgrupper som ikke er alvorlig immunsvikt. Konsistensen og pålitelighet av denne modellen på tvers av flere patogener og isolater gjør det godt egnet for antibakterielle effektstudier.
Protocol
S. pneumonie
Alle prosedyrer er i samsvar med protokoller godkjent av GSK Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC), og møter eller overgår kravene i den amerikanske foreningen for akkreditering av Laboratory Animal Care (AAALAC), United States Department of Health and Human tjenester og alle lokale og føderale dyrevelferd lover.
MERK: Med mindre annet er angitt, skal alle prosedyrer skal utføres ved bruk av aseptisk teknikk.
1. Kultur bakterieisolater
- Forbered 3 til 6 agar-plater med S. pneumoniae eller H. influenzae, som buljongkultur vanligvis ikke gir tilstrekkelig materiale for inokulering.
- Fjerne et frossent stamkultur fra lagring ved -80 ° C, tines helt, og strek opp til 100 ul per plate på tryptisk soyaagar supplert med saueblod (S. pneumoniae) eller på sjokolade-agar (H. influenzae) ved bruk av standard mikrobiologiske teknikker. Inkuber over natten ved 37 ° C med eller uten 5% CO2.
- Forbered kjøttkraft kulturer med K. pneumoniae, P. aeruginosa eller A. baumannii.
- Fjern en frossen lager kultur fra lagring ved -80 ° C, tines helt, og delmengde 100 mL av aksjer i 50 ml hjerne-hjerte infusjon (BHI). Inkuber over natten ved 37 ° C med forsiktig rysting (ca. 120 rpm).
- [Valgfritt] Hvis en log fase kultur er ønskelig, alikvot 1 ml av den resulterende kulturen natten over i 50 ml frisk BHI-kraft. Inkuberes i 3 timer ved 37 ° C med forsiktig rysting (ca. 120 rpm).
2. Forbered Saline Bakterielle utestengelse
- For alle suspensjon fremstillingstrinnene (2.1 til 2.3), utnytter sterilt saltvann ved en temperatur mellom omgivende luft og 37 ° C. Innhøsting over natten vekst av S. pneumoniae eller H. influenzae fra agarplatene ved skraping kolonierfra overflaten med en steril løkke. Overfør det høstede materiale inn i 5 ml sterilt saltvann inntil en uklar, blir ugjennomsiktig suspensjon erholdes og forsiktig vortex til homogen tilstand.
- Sentrifuge 50 ml av K. pneumoniae, P. aeruginosa eller A. baumannii endelig buljongkulturer beregnet for inokulering (for eksempel over natten eller log fase kultur) i 5 minutter ved 4500 x g. Fjern supernatanten med en pipette og kast. Resuspender pellet i det minste i 5 ml sterilt saltvann, og forsiktig vortex for å oppnå en homogen suspensjon.
- Hvis det er nødvendig, fortynnes suspensjonen ytterligere ved hjelp av steril saltløsning for å oppnå en densitet i området på 8 til 9 log 10 kolonidannende enheter (CFU) / ml. Fjerne en alikvot for bestemmelse av CFU / ml. Serielt fortynne og plate delmengden som beskrevet i avsnitt 7.5 og 7.6.
3. Klargjør Agar-basert Inoculum
- Forbered en liten flaske (ca. 50 ml) av næringsstoff agar According til produsentens instruksjoner eller smelte en flaske solid nærings agar som tidligere ble utarbeidet og lagret. La den avkjøles til ca 50 ° C.
- Transportere væsken agar og alle nødvendige verktøy og utstyr for smitte prosessen med prosedyren området der dyrene blir smittet. Opprettholde et lite vannbad innstilt på 42 ° C i området.
- Tillat agar for å nå en temperatur på ca. 50 ° C, og deretter delmengde 9 ml inn i et sterilt rør hensiktsmessig dimensjonert til å passe inn i vannbadet. La dette rør i vannbadet inntil agaren likevekt til omtrent 42 ° C. Sikre at vannet er ved en dybde som vil dekke overflaten av agar i beholderen, men ikke berører hetten eller lokket.
- Tilsett 1 ml saltbakteriesuspensjonen fra trinn 2,3 til røret som inneholdt 9 ml agar i vannbadet. Cap røret, snu flere ganger for å blande, og returnere det til vannbad.
4. Ennesthetize, intubere og Inokuler Dyr
MERK: Spesifikke patogenfrie (SPF) immunkompetente Sprague-Dawley-rotter som veide 100-120 g eller hann-CD-1-mus som veier 20 - 25 g anbefales. Gi alle dyr med mat og vann ad libitum og huse dem sosialt på flis eller annet absorberende sengetøy med standard 12 h lys-mørk sykluser.
- Før gjennomføre noen eksperimenter, innhente og sterilisere en metall kanyle og polyetylen rør av riktig størrelse for de dyrearter. Skaff sterile 1 ml engangssprøyter og sterile engangs 25 gauge nåler.
Advarsel: Alltid kast disse sprøyter og nåler i en beholder for skarpe gjenstander.- For rotter, kjøpe eller fremstille en metallkanyle som er omtrent 12 cm i lengde, har en ID på 0,9 til 1,0 mm og ytterdiameter på 1,0 til 1,2 mm, og er bøyd til en tilnærmet 45 ° vinkel i den ene enden. Skjær en 11- til 12-tommers lengde av polyetylen rør med en ID på 0,4 mm og OD 0,8 mm. (Referere til
- For mus, kjøpe en # 20 dyr materøret. Ta kulen fra enden av røret ved å gripe den med en tang og trekke kraftig, og deretter forsiktig bøye enden til en tilnærmet 45 ° vinkel. Skjær en 11- til 12-tommers lengde av polyetylen rør med en ID på 0,28 mm og OD 0,61 mm. Også kjøpe og sterilisere et glass 100 mL mikroinjeksjonssprøyte og en 30-gauge metall mikro-kanyle. (Se figur 1B.)
- Plasser metallkanyle i et glass, med skrukork og autoklav ved standardmetoder for å sterilisere. Sug og lagre kutte lengder av polyetylen rør i en dekket beger som inneholder alkohol.
- For rotter, kjøpe eller fremstille en metallkanyle som er omtrent 12 cm i lengde, har en ID på 0,9 til 1,0 mm og ytterdiameter på 1,0 til 1,2 mm, og er bøyd til en tilnærmet 45 ° vinkel i den ene enden. Skjær en 11- til 12-tommers lengde av polyetylen rør med en ID på 0,4 mm og OD 0,8 mm. (Referere til
- Klargjør arbeidsflate og intubasjon enhet.
- Plasser en ren engangs matte på arbeidsflaten, i nærheten av vannbadet. Overfør metallkanyle, i sitt glass lagringsrøret, på denne overflate. Fjern lokket fra lagrings røret og skyv "håndtaket" slutten av cannula til den åpne enden av røret.
- Ved hjelp av steril tang, fjerne en lengde av polyetylen rør fra begeret og sett det gjennom innsiden av den sterile metall kanyle, noe som gjør at den beveger seg fritt. Passe en steril engangs 25-gauge nål (for rotter) eller den steriliserte 30-gauge nål metall fra et glassmikroinjeksjonssprøyte (for mus) på den frie ende av polyetylenrør ved å skyve nålen flere mm inn i røret. (Se figur 1A for rotte og figur 1B for mus).
- Sted merkene på både metallkanyle og polyetylenrør for å indikere innføringsdybde i dyret ved å følge prosedyren som er beskrevet under intubasjon på en enkelt avlives dyret. Åpne brysthulen for observasjon, deretter plassere metall kanylen på riktig måte og fremme polyetylen rør på riktig måte (som beskrevet i punkt 4.7). Ved hjelp av et uutslettelig penn, markere metallkanyle hvor den møter munningen av dyret og polyetylen slangen der den møter toppen av metall kanylen for å hjelpe til med riktig plassering i gjenværende dyr.
- I løpet av en avtrekkshette (eller med en passende fjernende system), bedøve opp til 6 dyr om gangen i et lukket kammer forsynt med ≤5% isofluran i 1,5 l / min oksygen til gag refleks inhiberes (ca. 1 min).
MERK: Før du utfører noen eksperimenter, etablere trygg dose og eksponeringstid for isofluran under de spesielle forholdene som brukes (for eksempel størrelse / type kammer og størrelse / art / stamme av dyr) for å hindre utilsiktet dødelig eksponering. - Fyll en steril engangs 1 ml sprøyte (for rotter) med sterilt saltvann ved å plassere den sterile tuppen inn i saltvann og trekke tilbake på stempelet. Fyll sterile glassmikroinjeksjonssprøyte (for mus) som beskrevet nedenfor. Fest sprøyten med nålen montert på polyetylenrør, og skylle hele volum av saltløsning gjennom slangen inntil Syringe tømmes.
- For å fylle mikroinjeksjonssprøyte (for mus), fullstendig fjerne metallstempel og nål (montert på polyetylen rør) fra sprøyten og satt begge til side.
- Fyll en steril engangs 1 ml sprøyte med sterilt saltvann (som beskrevet ovenfor) og feste en steril engangs 25-gauge nål. Sett nålen inn i toppen av mikroinjeksjonssprøyte (hvor metallet stempelet vil bli satt inn) og stemplet trykkes av engangssprøyten til det fyller mikro-sprøyte med saltvann.
- Kast engangssprøyte og nål som ble brukt til å fylle mikroinjeksjonssprøyten i en beholder for skarpe gjenstander. Re-fester metallmikroinjeksjonsnål (montert på polyetylenrør) til tuppen av mikroinjeksjonssprøyte og sett metallet stempelet, å trykke inntil hele volumet av saltoppløsning er blitt spylt gjennom sprøyte og slangen.
- Fyll sprøyten med agar-baserte podestoff from beholderen i vannbadet, og i flukt agar gjennom røret bare inntil røret er fylt (f.eks fullstendig fylt med agar).
- For rotter, fjerne den 25-gauge nål (montert på polyetylenrør) fra engangssprøyte. Kast den brukte sprøyten i en beholder for skarpe gjenstander. Fylle en ny, steril engangs 1 ml sprøyte med agar-baserte inokulum fra beholderen i vannbadet ved å plassere den sterile spiss inn i inokulumet og holdt igjen på stempelet. Re-feste nålen (montert på polyetylenrør) og i flukt agar gjennom røret ved å trykke inn stempelet bare inntil røret er helt fylt med agar.
- For mus, fjerne metall mikro-kanyle (montert på polyetylen rør) og metall stempel fra mikroinjeksjonssprøyte og sett til side. Ved hjelp av en steril engangs 1 ml sprøyte og steril engangs 25-gauge nål, fylle mikroinjeksjonssprøyte med agar-baserte inokulum fra beholderen ivannbad med fylling prosedyren som er beskrevet i punkt 4.4. Re-fester metall mikro-kanyle (montert på polyetylen rør), setter metall stempelet, og skyll agar gjennom røret like før slangen er helt fylt med agar.
- Fjern ett dyr fra narkosen kammeret. Plasserer dyret i en liggende stilling på engangs matten med hodet mot høyre og halen til venstre som vist i figur 1C.
- Ved hjelp av intubasjon enheten (dvs. metall-kanyle utstyrt med polyetylenrør), intubere dyret og sette kanylen inn i den store flik av den venstre lunge (se figur 1D).
- Sette inn den frie enden av metall kanylen inn i dyrets munn. Slå kanylen slik at den frie enden er vinklet oppover og forsiktig fremme det inn i luftrøret, nøye utenom strupehodet strukturer med en liten vridning bevegelse. Bekrefte innføring inn i luftrøret i motsetning tilspiserøret ved å skyve kanylen litt fremover og tilbake flere ganger mens palpating tracheal ringer med venstre pekefinger som vist i figur 1C.
- Når kanylen når forgreningen hvor luftrøret deler seg i venstre og høyre bronkiene, foreta en liten skrubevegelse mot dyrets venstre side for å sikre at kanylen er satt inn i venstre bronkie. Advance metallet kanylen til slutten er halvveis til tre fjerdedeler ned til venstre lunge, ved hjelp av tidligere plassert guide mark for å bekrefte at riktig dybde er nådd.
- Med metallet kanylen på plass, skyver polyetylenrør flere mm. Bruke en tidligere lagt guiden merke på røret for å sikre at den føres frem bare langt nok til å gå ut av enden av metall kanylen og ikke punkterer lungen.
- Med både kanyler på plass, kan du bruke den vedlagte sprøyten å innpode 100 ul (for rotter) eller 20 mL (for mus) av agar suspension dypt inn i den store flik av den venstre lunge (se figur 1D). Trekk flere mm av polyetylen rør, og deretter fjerne den intakte intubasjon enheten forsiktig. Sett den tilbake i glass lagring tube, og flytte dyret inn i en frisk bur å gjenopprette.
- Fortsett bedøvelse, intubasjon og inoculating de resterende dyrene.
- Mellom grupper av bedøvede dyr, fjernes kanylen (montert på røret) fra sprøyten. For rotter, kaste den brukte engangssprøyte i en beholder for skarpe gjenstander og fylle en ny, steril engangssprøyte fra inokulumet i vannbadet. For mus, fylle den samme glassmikroinjeksjonssprøyte fra inokulumet i vannbadet ved hjelp av fyll teknikk som er beskrevet i avsnitt 4.4.
- Hvis agar begynner å tykne i intubasjon enhet, skylle all gjenværende agar gjennom røret. Fjern kanylen fra sprøyten (forlater nål montert på polyetylen rør). Følge prosedyrene beskreveti avsnitt 4.4 å spyle varm, sterilt saltvann gjennom intubasjon enhet, gjenta som nødvendig for å tømme blokkeringer. Empty alt saltvann fra sprøyten og forberede agar podestoff igjen som beskrevet i punkt 4.5.
- Beregn den endelige bakterieinokulum per dyr ved hjelp av CFU bestemt fra saltsuspensjonen (se avsnitt 2.3), den endelige fortynningsfaktor av saltsuspensjonen i agar (for eksempel ti ganger), og volumet innpodet i dyr (for eksempel 100 ul av rotter eller 20 ul for mus).
5. Vurdere Dyr for Potential Mis-vaksinasjon eller andre bivirkninger
- Nøye observere alle dyrene under intubasjon, drypping av agar og utvinning fra anestesi for å vurdere for potensielle mis-vaksinasjon. Umiddelbart avlive (i henhold til lokale IACUC retningslinjer) ethvert dyr som blør, viser unormal respirasjon (som tung pust eller gisper), ikke beveger segnormalt om buret, eller vises ikke lyse øyne og sunn på utvinning fra anestesi.
- Hvis spontan pustestans oppstår (vanligvis når pode ikke er plassert dypt nok og blokkerer luftveiene), bekrefter død ved observasjon og utføre en sekundær metode for eutanasi (for eksempel halshugging eller Thoracotomi).
- Minimer hvor lenge dyrene blir utsatt for isofluran, som anestesi kreves bare noen minutter å utføre prosedyren. Hvis injiserbare bedøvelse blir brukt, at dyrene er til observasjon inntil helt våken. Plasser dyr, spesielt mus, i en varmet miljø for utvinning ved bruk av injiserbare bedøvelse.
- Observer dyrene minst to ganger daglig i løpet av studieperioden for følgende tegn på luftveissykdom: uttalt pust, piloereksjon, redusert aktivitet og redusert kroppstemperatur. Umiddelbart avlive (i henhold til lokale IACUC retningslinjer) ethvert dyr som er døende, erfaring ogNCE anstrengt pust eller pustevansker, har en merkbart redusert kroppstemperatur på håndtering, er ikke villige til å flytte, eller kan ikke nå mat og vann.
6. Administrer Test behandlinger
- Utarbeide og administrere test behandlinger i henhold til planlagt studiedesign. Begynn administrasjon av behandlinger på en eller to timer etter infeksjon (eller utsette behandlingen videre hvis et høyere baseline bakteriemengden er ønskelig). Spesifikke detaljer for tilberedning og administrering av test behandlinger kan ikke gis som den er avhengig av formålet med studien, samt egenskapene til hver enkelt behandling. (Se figur 3 som et eksempel.)
- Sett av en gruppe av smittede, ubehandlede dyr for å tjene som baseline kontroller. Oppsummere den bakteriemengden i lungene til disse dyrene på det tidspunktet behandlingen er igangsatt for de andre gruppene, følge prosedyrene som er beskrevet i kapittel 7.
- For PK / PD-analyser, vurdereden farmakokinetiske profilen av den administrerte behandling (er) i blod og / eller vev av infiserte dyr. Spesifikke prosedyrer for farmakokinetiske studier er utenfor omfanget av denne artikkelen.
7. nummerere Levedyktige bakterier fra lungene
- Avlive en gruppe av ubehandlede dyr på det tidspunkt behandlingen innledes for de andre gruppene (grunnlinje) og alle de gjenværende dyr ved slutten av forsøksperioden (vanligvis 24, 48 eller 96 timer etter infeksjon) ved inhalering eksponering for gradvis økende nivåer av karbon dioksid i et lukket kammer eller en alternativ metode som anbefales av lokale IACUC retningslinjer. Kontroller død ved observasjon, og utføre en sekundær metode for eutanasi (for eksempel halshugging eller Thoracotomi).
- Plasser dyrene i liggende stilling på en ren engangs matte, og grundig våt pels over brystet med alkohol.
- Ved hjelp av steril saks, skjære gjennom huden, underliggende muskellaget og brystkasseparallelt med sternum å åpne brysthulen. Forsiktig tak lungene med steril tang og trekk for å fjerne, ved hjelp av saks for å skille dem fra luftrøret om nødvendig. Sett lungene på steril kompress å absorbere overflødig blod. Hvis hjertet har også blitt fjernet, dissekere den bort og kast.
- Lag små klipp i lungene med steril saks å avdekke indre deler og bruker steril tang til å plassere lungene (pluss noen stykker som ble utilsiktet klippet av) inn i bunnen av en lab blender bag. I korthet rulle en tykk rund gjenstand (for eksempel en penn eller markør) over utsiden av posen å mose vevet. Pipetter 1 ml sterilt saltvann i posen, plassere posen i en lab blender, og kjør lab blender i høy hastighet i 2 minutter.
- Overfør homogeniseres prøvene fra de blandede poser i rør eller plater ved hjelp av en pipette. Fortynn homogenat ti ganger ved aliquotting en-del homogenat inn i 9-deler saltløsning (for eksempel 100 ul homogenat inn i 900 ul Saline). Fortynne den resulterende suspensjon ved ti-ganger på nytt på lignende måte. Fortsett å fortynne hver ny resulterende suspensjonen av en annen ti-gangers faktor inntil minst 6 seriefortynninger er blitt fremstilt fra den opprinnelige homogenat.
- Pipetter tredoble porsjoner av 20 mL hver fra alle fortynninger bort på Trypticase agar plater supplert med saueblod (S. pneumoniae, K. pneumoniae, P. aeruginosa eller A. baumannii) eller på sjokolade agarskåler (H. influenzae). Inkuber over natten ved 37 ° C med og uten CO2. (Se figur 1E for et eksempel på en resulterende plate).
- Telle koloniene i hver av de tre replikater ved første fortynning som inneholder en "tellbar" nummer (dvs. ikke for mange kolonier til rimelig teller). Beregne den gjennomsnittlige verdi av de tre replikater. Bestemme CFU pr lungene ved å multiplisere gjennomsnittsverdien med 50 (for å står for plating 20 ul av det totale 1 mLhomogenat) og betraktning i den endelige fortynningen faktor fra den opprinnelige homogenat ved hvilken kolonier ble tellet.
Representative Results
Verktøyene er nødvendig, orientering av dyret, og dybden av intubasjon er vist i figur 1. Også vist er et representativt eksempel på kolonier som vokser på en agar plate etter seriefortynning og tre eksemplarer plettering av en lungehomogenat prøve. En økning i bakteriemengden av flere log 10 CFU ovenfor grunnlinjen kontroller blir typisk observert hos infiserte lunger for de fleste bakterielle isolater, selv ved 96 timer etter infeksjon, og variasjon mellom dyr er lav (figur 2). For noen H. influenzae, kan det være liten vekst; bør imidlertid infeksjonen begynner ikke å selv-løse innen en 48 eller 96 timers periode (figur 2B). Denne lungeinfeksjon modellen kan brukes under optimering av bly kjemisk serie for å støtte SAR, som vist i Figur 3 for representative forbindelser med to ulike serier 16, 17. Det gir en konsistent, reproduserbar møttehod for vurdering av PK / PD hos immunkompetente dyr, og ble anvendt for å bestemme det frie medikament areal under konsentrasjon-tidskurven i løpet av den minimale inhiberende konsentrasjon (fAUC / MIC) forbundet med effekten av en ny polypeptid deformylase (PDF) inhibitor mot S. pneumoniae og H. influenzae (figur 4). I tillegg er fAUC / MIC mål for stasis og en 1-log 10 reduksjon i CFU fra baseline kontroller ble bestemt over 11 S. pneumoniae og 5 H. influenzae isolater (tabell 1) 18. Kobling av denne infeksjonsmodell med et medikamentleveringssystem for å gjenskape menneskelig farmakokinetikk i rotter gir et kraftig verktøy for å evaluere human doseringsregimer før kliniske studier. Et eksempel på dette er oppsummert i tabell 2, som viser at en forlenget frigivelse formulering av amoxicillin-klavulanat var mer effektiv enn eksisterende doseringsregimer for organismer med Elevasted MIC verdier 19.
Figur 1: Nonsurgical intratrakeal intubering. Verktøy er vist for intubasjon rotte (A) og mus (B). Når de var bedøvet, bør dyret plassert som vist i C, med hodet mot høyre og halen til venstre hvis den enkelte utfører teknikken er høyrehendt. Plasser venstre pekefinger forsiktig på halsen for å hjelpe palpere tracheal ringene for bekreftelse av korrekt kanyle plassering. Podestoffet bør plasseres dypt inn i den venstre lunge, som vist i den ventrale riss av en rottelunge (D). Kolonier som vokser på agar etter seriefortynning og plettering av en prøve skal vises tilsvarende den som er vist på E. Figur 1D, Copyright © Gill Smith [forsøksdyr, Volume 25 (1991), G. Smith, Aenkel ikke-kirurgisk metode for intrabronkial instillasjon for etablering av luftveisinfeksjoner hos rotte, sider 46 - 49] 14. Gjengitt med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative eksempler på bakterievekst i lungene av smittede dyr. Gjennomsnitt ± standard avvik CFU data fra n = 5 dyr / gruppe er vist for forskjellige isolater av S. pneumoniae (A), H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) og A. baumannii (E). Den første linjen av hvert par (lys grå) er grunnlinjen bacterial byrde på en eller to timer etter infeksjon, mens andre bar er end-of-studie vekstkontroll i 48 timer etter infeksjon (mørk grå) eller 96 timer etter infeksjon (svart). Ingen data Sensur av metoder ble brukt, således disse resultater med data fra alle 5 dyr per gruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Evaluering av effekten av ulike kjemiske Series under Lead Optimization. Lungeinfeksjon modeller ved hjelp av de beskrevne teknikker ble brukt til å utforske struktur-aktivitetsforhold som en del av abacterial typen IIA topoisomerase program. Lovende forbindelser 7 og 1 ble evaluert mot kinolon-følsomme (A) 16 eller kinolon-resistente(B) 17 isolater av S. pneumoniae, henholdsvis. Hvert symbol representerer CFU bestemt fra lungene hos en rotte med linjer som representerer den gruppe gjennomsnitt og standardavvik. Nedre grense for kvantifisering (LLQ) var 1,7 log 10 CFU / lunger. Forbindelser ble veiet (56 eller 112 mg rent frie opphavsmolekylet), oppløst i 9 ml sterilt vann, fortynnet 3 ml i 3 ml vann (1: 1) og administrert ved oral føring av 1 ml / 125 g rotte to ganger daglig ( 6 - 7 timer fra hverandre) i 2 dager, starter på 1 time etter infeksjon. Ubehandlede kontroller (NTC) ble samplet ved 1 time etter infeksjon for grunnlinje eller behandlet med saltvann og samplet ved slutten av studien (48 h) for vekstkontroll. Figur 3A gjengitt fra bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 21, TJ Miles et al, Novel cykloheksylgruppene-amider som potente antibakterielle midler rettet mot bakteriell typen IIA topoisomeraser, Pages 7483 -. 7488, Copyright (2011) 16, med tillatelse fra Elsevier.Figur 3B gjengitt fra bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 26, TJ Miles et al, Novel trisykliske (f.eks GSK945237) som potente hemmere av bakteriell typen IIA topoisomeraser, Pages 2464 -. 2469, Copyright (2016) 17, med tillatelse fra Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: PK / PD Karakterisering av en Novel PDF-hemmer. Emax modeller ble opprettet ved hjelp av dose varierer effektdata hos immunkompetente mus infisert i lungene med isolater av S. pneumoniae (A) eller H. influenzae (B) for å bestemme PK / PD-mål for en ny PDF-hemmer 18. Circlesrepresenterer gjennomsnittet bakteriemengden 4-5 mus / gruppen behandlet med varierende doser av sammensatte. Analyser ble utført for å korrelere effekt med fritt medikament i 24 timer AUC (åpne sirkler) eller AUC / MIC (fylte sirkler). Gjengitt med tillatelse, Copyright © American Society for Microbiology, [Antimicrobial Agents og kjemoterapi, volum 60, 2016, side 180 - 189] 18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| stasis | 1-log 10 reduksjon | ||||||
| organisme | MIC (ug / ml) | R2 for linjen fit (%) | fAUC | fAUC / MIC | fAUC | fAUC / MIC | Max drap (log 10 reduksjon) |
| S. pneumoniae | |||||||
| 10127 | 0,25 | 99.9 | 2.0 | 8.1 | 3.6 | 14.4 | 2.8 |
| 1316009S | 0,25 | 96,1 | 6.5 | 26.0 | 15.1 | 60.3 | 1.8 |
| ATCC10813 | 0.5 | 100 | 8.4 | 16.9 | 22.2 | 44.5 | 1.2 |
| 1307007S | 1 95,8 | 16.1 | 16.1 | 20.1 | 20.1 | 2.7 | |
| ATCC6303 | 1 | 99,8 | 19.8 | 19.8 | 24,8 | 24,8 | 2.8 |
| 1629 | 2 | 100 | 15.8 | 7.9 | 21.2 | 10.6 | 2.4 |
| 298443 | 2 | 99.9 | 26.5 | 13.2 | 31,0 | 15.5 | 2.3 |
| 336808 | 2 | 86 | 8.2 | 4.2 | 19,0 | 9.5 | 2.6 |
| 338860 | 2 | 99.5 | 2.9 | 1.5 | 6.7 | 3.4 | 2.8 |
| & #160; 340449 | 2 | 94,6 | 8.0 | 4.0 | 14.9 | 7.4 | 2.1 |
| L11259 | 2 | 100 | 7.1 | 3,5 | 9.0 | 4.5 | 2.0 |
| Mean ± SD | NA en | NA | 11,0 ± 7,5 | 11,0 ± 7,9 | 17,0 ± 8,2 | 19,5 ± 17,8 | 2,3 ± 0,5 |
| median | NA | NA | 8.2 | 8.1 | 19,0 | 14.4 | 2.4 |
| H. influenzae | |||||||
| 1998-100-126H | 1 | 99,7 | 7.3 | 7.3 | 13.4 | 13.4 | 2.9 |
| 503-008H | 1 | 99,8 | 7.1 | 7.1 | 13.9 | 13.9 | 2.7 |
| 08003H | 2 | 99.9 | 14.5 | 7.2 | 16,7 | 8.3 | 2.7 |
| H128 | 2 | 96.6 | 15.3 | 7.6 | 26.0 | 13.0 | 2.7 |
| 19001H | 4 | 91.9 | 14.8 | 3.7 | 37.3 | 9.3 | 3.0 |
| Mean ± SD | NA | NA | 11,8 ± 4,2 | 6.6 ± 1.6 | 21,5 ± 10,2 | 11,6 ± 2,6 | 2,8 ± 0,1 |
| median | NA | NA | 14.5 | 7.2 | 16,7 | 13.0 | 2.7 |
| en NA, ikke aktuelt. | |||||||
Tabell 1: PK / PD Mål for en Novel PDF Inhibitor mot S. pneumoniae og H. influenzae isolater. Fritt narkotika AUC og AUC / MIC mål for stasis og en 1-log 10 reduksjon i CFU fra baseline ble bestemt for 11 S. pneumoniae og 5 H. influenzae i immunkompetente mus infisert i lungene og behandlet med forbindelse 18. den daten ble brukt til å hjelpe velge menneskelige doser for klinisk utvikling. Denne tabellen har blitt tilpasset og gjengitt med tillatelse, Copyright © American Society for Microbiology, [Antimicrobial Agents og kjemoterapi, volum 60, 2016, side 180 - 189] 18.
| Behandling konsernet | Logaritmisk 10 S. pneumoniae (CFU / lunge) b ± SD for stamme (AMX / CA MIC): | |||||||
| 05010S (2 ug / ml) | 16001S c (4 ug / ml) | 16001S (4 ug / ml) | 30005S (4 ug / ml) | 20009S (4 ug / ml) | 05003S (8 ug / ml) | 404053 (8 ug / ml) | 47003S (8 ug / ml) | |
| Kontroll | 7,3 ± 0,4 | 7.0 ± 0.8 | 5.7 ± 1.2 | 7.1 ± 0.7 | 7.1 ± 0.4 | 6.4 ± 0.6 | 6,8 ± 0,4 | 6,0 ± 0,3 |
| AMX / CA | ||||||||
| 2000/125 mg to ganger daglig (forholdet 16: 1) | ≤ 1,7 ** | 2,8 ± 1,2 ** | 2,2 ± 0,8 ** | 2.3 ± 0.9 ** | 2,5 ± 0,9 ** | 2,0 ± 0,9 ** | 3,8 ± 1,4 ** | 1,8 ± 0,2 ** |
| 1000/125 mg tre ganger daglig (ratio 8: 1) | NT | NT | 2,8 ± 0,5 ** | 2,7 ± 1,3 ** | 3.3 ± 0.9 ** | 4,9 ± 0,5 ** | 6.6 ± 1.3 | 4,7 ± 0,7 ** |
| NT | NT | 3,0 ± 1,3 * | 2.1 ± 0.7 ** | 3,2 ± 0,4 ** | 5,2 ± 0,9 * | 6.4 ± 0.6 | 4,9 ± 0,4 ** | |
| 875/125 mg to ganger daglig (forholdet 7: 1) | NT | NT | 4,5 ± 1,2 * | 5,6 ± 1,3 * | 5.2 ± 0.7 ** | 6.3 ± 0.7 | 6,4 ± 0,7 | 5.5 ± 0.4 |
| 500/125 mg tid (forhold 4: 1) | 3,1 ± 1,3 ** | 4,5 ± 0,9 ** | NT | NT | NT | NT | NT | NT |
| Azithromycin, 1000/500 mg od | NT | NT | NT | 5.8 ± 2.0 | 7.1 ± 0.9 | 3.1 ± 1.0 ** | 6,6 ± 0,4 | 6.07; 0.6 |
| Levofloxacin, 500 mg od | NT | NT | 4,2 ± 0,8 * | 5,7 ± 0,8 * | 4,9 ± 0,8 ** | 3,0 ± 1,3 ** | 3,5 ± 0,2 ** | 3,9 ± 0,8 ** |
| Behandlingsgruppe d | Logaritmisk 10 H. influenzae (CFU / lunge) ± SD for belastning: | |||||||
| H128 (β-laktamase positiv) | Chesterfield (β-laktamase negativ, ampicillin resistent) | |||||||
| Kontroll | 6.4 ± 0.6 | 6.7 ± 0.6 | ||||||
| AMX / CA | ||||||||
| 2000/125 mg to ganger daglig (forholdet 16: 1) | 2,0 ± 0,7 ** | 3.1 ± 0.9 ** | ||||||
| 1000/125 mg tre ganger daglig (ratio 8: 1) | 2.1 ± 1.0 ** | 3,6 ± 1,1 ** | ||||||
| 875/125 mg tid (forholdet 7: 1) | 2,8 ± 1,3 ** | 3,8 ± 1,3 ** | ||||||
| 875/125 mg to ganger daglig (forholdet 7: 1) | 2,0 ± 0,8 ** | 5.1 ± 1.1 ** | ||||||
| Azithromycin, 1000/500 mg od | 3,2 ± 1,7 * | 5.8 ± 1.1 | ||||||
| Levofloxacin, 500 mg od | ≤ 1,7 ** | ≤ 1,7 ** | ||||||
| en AMX / CA, amoxicillin-clavulanate; bud, to ganger om dagen; Tid., tre ganger om dagen; od, en gang om dagen. | ||||||||
| b Deteksjonsgrensen var <1,7; * Signifikant forskjellig fra kontrollen (P ≤ 0,05); ** Signifikant forskjellig fra kontrollen (P ≤ 0,01); NT ikke testet. | ||||||||
| c Stamme 16001S ble testet i to separate forsøk. | ||||||||
| d Amoxicillin-klavulanat 500/125 mg (4: 1) tre ganger om dagen ble ikke testet mot H. influenzae-stammer. | ||||||||
Tabell 2: Effekt av gjenskapt humant plasma Eksponerings profiler for ulike Amoxicillin / Clavulanate doseringsregime. Data som er generert i immunkompetente rotter infisert i lungen med isolater av S. pneumoniae eller H. influenzae ved hjelp av denne modellen har vist at en forbedret formulering av amoxicillin-clavulanat (2-000/125 mg to ganger daglig) var mer effektiv enn standard doseringsregime mot kulturer med forhøyet in vitro følsomhet 19. Denne tabellen har blitt tilpasset og gjengitt med tillatelse, Copyright © American Society for Microbiology, [Antimicrobial Agents og kjemoterapi, volum 49, 2005, side 908 - 915] 19.
Discussion
For optimal suksess i å reprodusere denne infeksjonen modellen, bør følgende tilleggsforslag vurderes. Virulens av nye isolater kan bli styrket ved aging 2 - 3 ganger i vivo før utnyttelse i en studie. Frosne bakterielle bestander bør alltid være forberedt fra en primær in vivo avledede kilde med så få passasjer som mulig fra den opprinnelige, og refreezing eller gjenbruk av tint lager frarådes. Ved hjelp av nyere kliniske isolater utvinnes fra pasienter med lungebetennelse, og / eller utarbeidelse kulturer i log fase vekst kan også bidra til å forbedre etablering av infeksjonen. En fem-gangers fortynning inn i agaren (for eksempel 2 ml saltsuspensjon tilsatt til 8 ml agar) kan brukes i stedet for ti-ganger for å øke bakteriepodestoff, og inokulumet volumet kan justeres basert på størrelsen på dyret (f.eks 200 pl / dyr vanligvis er inokulert i 250 grams rotter). Før tilsetting av saltvann bakteriesuspensjonen inn i detagar (dvs. trinn 2.3), bakterietettheten kan forutsies eller estimeres ved visuell inspeksjon, MacFarland standarder eller målinger optisk tetthet. Det er nyttig å bli kjent med in vitro vekst egenskaper for hvert isolat før drive in vivo eksperimenter. Konsistens i vekst og håndtering muliggjør den mest nøyaktige estimering av bakterietettheten for en gitt isolat. Standard mikrobiologiske metoder som er forskjellige fra de som er beskrevet, for eksempel alternative media og vev homogenisatorer, kan anvendes som passende for fremstilling av podestoffer og opplisting bakterier fra infiserte vev.
Det er sterkt anbefalt å forberede eller smelte agar dagen før forsøket og lagre det over natten i en egen vannbad innstilt på 50 ° C. Dette vil forenkle prosessen og å beskytte mot agaren blir for varm på tidspunktet for infeksjon. En temperatur av 41 - 42 ° C oppnår en god balanse mellom maintaining agar i flytende tilstand uten å være for varmt for kortsiktig bakteriell overlevelse. Som et mulig alternativ til næringsagar, og edel agar blitt brukt i noen eksperimenter. Et rør av agar-inokulum er vanligvis tilstrekkelig for en hel eksperiment (og anbefales), men multiple rør kan fremstilles for å infisere et stort antall dyr (for eksempel mer enn 60), eller når det infiserer prosessen tar lengre tid enn 30 - 45 min Hvis multiple inokulum rør er nødvendig, tilsett salt bakteriell suspensjon til hvert rør av agar som det er nødvendig. Dette reduserer risikoen for at bakteriell overlevelse og / eller egnethet vil bli påvirket av forlenget eksponering til en forhøyet temperatur før inokulering. Det skal bemerkes at ved hjelp av flere podestoff Rørene kan også kreve ytterligere dyr randomisering prosedyrer. Når det er mulig, infisere alle dyr fra samme podestoff forberedelse. Det anbefales å skreddersy størrelsen eksperimenter til dagens nivå av dyktighet med technique.
En dyktig forsker kan intubere og inokulere et dyr i løpet av mindre enn 30 s og inokuler opp til 5 - 6 dyr pr batch (dvs. med en sprøyte full av agar inokulum). For de som lærer teknikken, er fart viktig som agar vil begynne å stivne; imidlertid, er nøyaktig plassering av inokulumet viktigere. Begynn med 1 eller 2 dyr per batch, og øke etter hvert som teknikken blir mer kjent. Dyrene fortsette å puste under intubasjon; således, at tidsvinduet for inokulering avhenger av hvor raskt dyret gjenvinner fra isofluran, som bør være omtrent 2 - 3 min. Dyr som vekker under prosessen kan gjen bedøvet og forsøkt en gang, men det er ikke anbefalt å gjøre det flere ganger. Vellykket inokulering på den første forsøk er ventet i nesten 100% av dyrene når dyktighet er oppnådd. Merk at det er lettere å lære teknikk med rotter først; mus er mer delikat og den mindre forls er mer utsatt for blokkering med størknet agar hvis ikke manipulert raskt. Pre-oppvarming sprøyter, tubing og saltvann samt holde intubasjon enhet på en varm (ikke varmt) overflate, for eksempel en varmepute på lav innstilling, kan bidra til å forhindre størkning av agar. Når lære teknikken, er det også nyttig å praktisere riktig plassering av inokulumet ved hjelp av en mørkfarget fargestoff (slik som konsentrert metylenblått) i stedet for den bakterielle suspensjon i agar. Utfør prosedyren som er beskrevet, men avlive dyret umiddelbart etter inokulering av fargestoffet (ikke tillater dyret å komme seg mellom anestesi og eutanasi). Dissekere å bestemme hvor fargestoffet er plassert, og justere teknikken tilsvarende.
Det primære endepunktet i denne modellen er CFU fra infiserte lunger. Overlevelse er ikke en god indikator på bakteriell belastning og er ikke en anbefalt endepunkt. For effektstudier, er det foreslått N 5 - 6 dyr per gruppe som dette er predicted for å oppdage ≥1 log10 CFU forskjeller mellom gruppene med minst 90% strøm. Dyr kan bli smittet i grupper slik at buret mates forbli sammen, eller en sann randomisering fremgangsmåte kan følges. Merk at dersom grupper er tildelt av bur, bør gruppene være infisert i en tilfeldig sekvens med ende-til-studie vekstkontroll infiserte siste (for å bekrefte at bakteriell overlevelse / form ble ikke påvirket av hvor lang tid utsettes for en forhøyet temperatur i vannbad). Ingen data Sensur av metoder skulle være nødvendig, og ingen er anbefalt med unntak av umiddelbar fjerning av alle slags dyr som har vært åpenbart mis-inokulert ved begynnelsen av studien (før oppstart av noen behandlinger). Dyr som avlives før slutten av studien bør tas prøver og resultater inngår i datasettet med mindre en gyldig grunn for utelukkelse ble identifisert prospektivt (dvs. en hendelse relatert til infeksjon eller behandling). Drug carry kan affect noen prøver og er en viktig faktor i alle in vivo smittemodeller. Dersom en forbindelse er gitt ofte, nær tidspunktet for eutanasi eller har en lang halveringstid, kan det være til stede i vev homogenat ved en tilstrekkelig høy konsentrasjon til å fortsette å drepe bakterier ex vivo i løpet av bakteriell telling prosess (fortynning og plettering av prøvene eller på agar plater i løpet av natten inkubasjon). For å forhindre dette, aktivt kull og / eller et additiv som forringer det aktive molekylet uten å skade bakteriecellene kan tilsettes til prøven før homogenisering. Andre fremgangsmåter inkluderer sentrifugering av prøvene for å fjerne det meste av den aktive forbindelse (som bør forbli i supernatanten) og anvende forskjellig fortynning og plette ordninger for å i tilstrekkelig grad å fortynne den aktive forbindelse til en ikke-inhibitorisk konsentrasjon.
Som vist ved de eksemplene som er vist i figur 2, denne modellen med hell induces lungeinfeksjoner hos gnagere med et bredt spekter av organismer, inkludert de som ikke vokser godt i andre modeller (f.eks H. influenzae). Disse infeksjonene er konsistente og reproduserbare, noe som reduserer sannsynligheten for at eksperimenter må bli gjentatt på grunn av modellfeil og / eller dårlig ytelse med en gitt isolat. Selv om dyrene er immunkompetente, er de ikke i stand til raskt å løse infeksjon, hvis i det hele tatt. Dette sørger for økt fleksibilitet i studie lengde, som mange isolater opprettholde et levedyktig smitte gjennom minst 96 timer uten behov for gjentatte injeksjoner for å opprett neutropeni. Den potensielle nytten av å studere antibakteriell effekt hos immunkompetente dyr har blitt nevnt tidligere 20, 21, og det er dokumentert at for noen forbindelser (f.eks oksazolidinoner), data fra ikke-nøytropene gnagere kan mer nøyaktig forutsi humane eksponerings mål sammenlignet med dem gjengitt nøytropeni 5. Den multi-purpose nytten av than-modellen er vist i figurene 3 og 4 og tabell 1 og 2. Disse studiene er en del av en stor samling av publiserte og upubliserte data som har blitt generert med denne modellen for å understøtte ledningen optimalisering innsats 16, 17, 22-24, for sammenligning og bekreftelse av slått human doseringsregimer 19, 25-29 og for PK / PD-karakterisering 18, 30-32 .Mens denne modellen er i utgangspunktet mer komplisert å utføre i forhold til intranasal inhalering fremgangsmåten, er det mange fordeler som er beskrevet ovenfor. Med praksis og rutinemessig anvendelse, bør de teknikker som blir lett å utføre.
Det kan bemerkes i noen studier at den bakterielle belastningen ved start var lavere enn den som vanligvis rettet i andre lunge-infeksjonsmodeller. Dette skyldes i stor grad til den nødvendige fortynning i agar og det lille volum utfordring, spesielt i mus. Det bør imidlertid også bemerkesat bakterievekst ble sett i alle tilfeller, selv når den innledende byrden var relativt lav. Målet baseline bakteriemengde er 6 til 6,5 log 10 CFU / lungene (6,8 til 7,3 log 10 CFU / g vev hos mus basert på gjennomsnittlig lunge vekter) som tilsvarer tettheter estimerte hos mennesker med alvorlig lungebetennelse 33. En høyere referansebelastning kan bli oppnådd ved ytterligere konsentrering av bakteriepodestoff eller ved å forsinke starten av forbindelsen administrering for å tillate ytterligere bakterievekst; En økning av belastningen utfordring for mye kan føre til unormalt alvorlig og akutt sykdom (dvs. død i løpet av mindre enn 24 timer) som er motstandsdyktige overfor alle antibakteriell behandling uavhengig av følsomhet. Selv om inokulumet er i utgangspunktet plasseres fortrinnsvis i den venstre lungen av dyret, infeksjonen sprer seg vanligvis gjennom begge lunger. Progressive lungesykdom, spredning av bakterier til andre organer, og eventuelt sykelighet er ofte Observed med S. pneumoniae, K. pneumoniae og P. aeruginosa. Av interesse, infeksjoner med H. influenzae og A. baumannii er vanligvis mer inneholdt og sjelden føre til døden på foreskrevet bakteriell inocula.
Effekt resultatene fra denne modellen har korrelert godt med in vitro-følsomhet profiler samt definerte PK / PD mål. Reduksjoner i bakteriebelastning blir rutinemessig observeres for isolater anses å være følsomme for det middel som skal testes, mens de som anses motstandsdyktig oppviser ingen endring eller bakterievekst over basislinjen 16, 17, 19, 24-29. Studier i rotter som evaluerte to kinoloner og et makrolid ved hjelp av denne modellen 32 har vist at PK / PD-target nødvendig for en ett-log 10 reduksjon i S. pneumoniae, sammenlignet med referanse korrelert med målet bestemmes nøytropeni mus og, enda viktigere, med kliniske mål for samfunnet ervervet bakteriell pneumatiskonia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, en ny mekanisme antibiotikum, ble testet mot flere S. pneumoniae og krevde en lignende PK / PD mål for en 1-log reduksjon 10 i denne lunge-infeksjonsmodell 31 som den som er nødvendig for en ett-log 10 reduksjon i nøytropeni lår modellen 36 når lunge penetrasjon ble tatt i betraktning (data på fil). Tilsvarende PK / PD målene fastsatt i mus for GSK2251052 mot P. aeruginosa var konsistente for stasis, 1- og 2-log 10 reduksjon i CFU mellom denne lunge modell 30 og nøytropeni lår infeksjonsmodell når lunge penetrasjon ble ansett 37, 38 . Sammenheng med nøytropeni lungeinfeksjon modell ved hjelp av intranasal vaksinasjon var dårlig; imidlertid, GSK2251052 produserte ikke mer enn en statisk respons i denne studien 38. Dette kan skyldes høyere bakteriepodestoff, som var åtte log 10 CFU / mus sammenlignet med 6 log
Det er flere begrensninger av denne immunocompetent lungebetennelse modell. Først, det er ikke godt egnet til å vurdere framveksten av spontan motstand fordi den høye bakteriepodestoff vanligvis kreves for slike studier resulterer i altfor alvorlig infeksjon. Etter forsøk på å oppnå bakterie byrdene av 7 eller 8 log 10 CFU ved baseline, rask sykelighet har blitt observert (dvs. dyr blir døende på mindre enn 24 timer) til tross for grundig vask av podestoffer for å fjerne pre-eksisterende toksiner (data på fil). Denkan være mulig å løse dette problemet ved å bruke større gnagere. Rotter, spesielt tyngre rotter (> 250 g), ser ut til å bedre tåle høyere inokula sammenlignet med mus og kan være egnet for disse typer studier. En annen begrensning er at bruken av agar som en infeksjon-forsterker kan være til hinder ved bruk av modell for evaluering av visse verts: patogen interaksjoner. Det antas at agaren gir et beskyttet midtpunkt inntil infeksjonen er fullt etablert i lungene. Det er mulig å levere den inokulum i saltoppløsning i stedet for agar for å bidra til å overvinne dette problemet; Det bør imidlertid bemerkes at dette bare vil produsere infeksjon med noen isolater. For det tredje er det en bratt læringskurve som kreves for å bli dyktigere i teknikken. Prosedyren kan være delikat, spesielt i mus. Det er lett å plassere feilaktig metallet kanylen inn i spiserøret, og overdreven kraft kan føre til punktering av enten spiserøret eller trakea. Forsiktig plassering av inokulumet er ogsåpåkrevd eller dyr kan enten ikke gjenopprette eller ikke være tilstrekkelig smittet. Men med tålmodighet og utholdenhet, kan man bli svært dyktig og utføre teknikken raskt, jevnt og nøyaktig.
Ved å fjerne kravet til nøytropeni, økt robusthet og reproduserbarhet, slik at etterforskerne å studere flere patogener og isolater, forbedre fleksibiliteten i eksperimentell design og gir en utfordrende infeksjon å karakter farmakodynamikk for lungebetennelse, legger dette immunocompetent lungeinfeksjon modellen betydelig verdi mot antibiotika oppdagelsen samfunnet. Økt bruk av denne modellen ved flere etterforskere vil bidra til å gi den nødvendige benchmarking for å få mer utbredt aksept og fortsette å gi støttende informasjon for riktig tolkning.
Disclosures
Forfatterne er alle betalt ansatte i GlaxoSmithKline Pharmaceuticals og egne aksjer på lager i selskapet.
Acknowledgments
JH ønsker å erkjenne og takke mentor, venn og tidligere manager Valerie Berry for første lærer oss denne modellen; og Gary Woodnutt, som lærte oss grunnlaget for og inspirert vår forpliktelse til feltet av antibakterielle PK / PD. Alle forfatterne ønsker å takke David Payne for sin støtte og forståelse for vår vitenskap. Vi ønsker å takke våre tidligere in vivo mikrobiologi kolleger som har bidratt til kroppen av data generert ved hjelp av disse metodene, spesielt Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni Page og Nerissa Simon. Til slutt, vår takk går til våre in vitro mikrobiologi kolleger for deres hjelp, spesielt for å gi alle MIC vi ber om (Lynn McCloskey, Josh West og Sharon min); og for vår kliniske mikrobiologi team som gir råd og støtte ekspert (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman og Deborah Butler).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
| Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
| BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
| BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
| Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
| 0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
| Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
| 30 mL free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100 mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
| Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
| 90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
| 1 mL TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| Animal feeding needle - straight 20 x 3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
| Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand - Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
| 75 TN 5.0 µL syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
| Pyrex tube, culture 25x150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
| 70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
| Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
| Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
| Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
| Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |
References
- Eagle, H., Fleischman, R., Levy, M. Continuous' vs. 'discontinuous' therapy with penicillin: the effect of the interval between injections on therapeutic efficacy. N Engl J Med. 248 (12), 481-488 (1953).
- Eagle, H., Fleischman, R., Musselman, A. D. The bactericidal action of penicillin in vivo: the participation of the host, and the slow recovery of the surviving organisms. Ann Intern Med. 33 (3), 544-571 (1950).
- Vogelman, B., et al. Correlation of antimicrobial pharmacokinetic parameters with therapeutic efficacy in an animal model. J Infect Dis. 158 (4), 831-847 (1988).
- Craig, W. A. Pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters: rationale for antibacterial dosing of mice and men. Clin Infect Dis. 26 (1), 1-12 (1998).
- Ambrose, P. G., et al. Pharmacokinetics-pharmacodynamics of antimicrobial therapy: it's not just for mice anymore. Clin Infect Dis. 44 (1), 79-86 (2007).
- Ambrose, P. G., Bhavnani, S. M., Owens, R. C. Clinical pharmacodynamics of quinolones. Infect Dis Clin North Am. 17 (3), 529-543 (2003).
- Andes, D. Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of antimicrobials in the therapy of respiratory tract infections. Curr Opin Inf Dis. 14 (2), 165-172 (2001).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).
- Antibiotics in laboratory medicine, 5th edition. Chapter 15: Evaluation of antimicrobials in experimental animal infections. Lorian, V. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2005).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiol Rev. 37 (2), 130-155 (2013).
- Nuermberger, E. Murine models of pneumococcal pneumonia and their applicability to the study of tissue-directed antimicrobials. Pharmacotherapy. 25 (12 Pt 2), 134S-139S (2005).
- Mehrad, B., Standiford, T. J. Use of animal models in the study of inflammatory mediators of pneumonia. ILAR J. 40 (4), 167-174 (1999).
- De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Smith, G. A simple non-surgical method of intrabronchial instillation for the establishment of respiratory infections in the rat. Lab Anim. 25 (1), 46-49 (1991).
- Berry, V., Ferreira-Cornwell, M. C., Singley, C., Woodnutt, G. Development of experimental murine infections caused by H. influenzae and H. parainfluenzae. Clin Microbiol Infect. 7 (S1), 322 (2001).
- Miles, T. J., et al. Novel cyclohexyl-amides as potent antibacterials targeting bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 21 (24), 7483-7488 (2011).
- Miles, T. J., et al. Novel tricyclics (e.g. GSK945237) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 26 (10), 2464-2469 (2016).
- Hoover, J., et al. Pharmacokinetics/pharmacodynamics of peptide deformylase inhibitor GSK1322322 against Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Staphylococcus aureus in rodent models of infection. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), 180-189 (2016).
- Berry, V., Hoover, J., Singley, C., Woodnutt, G. Comparative bacteriological efficacy of pharmacokinetically enhanced amoxicillin-clavulanate against Streptococcus pneumoniae with elevated amoxicillin MICs and Haemophilus influenzae. Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 908-915 (2005).
- Czock, D., Markert, C., Hartman, B., Keller, F. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of antimicrobial drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5 (5), 475-487 (2009).
- Drusano, G. L., Fregeau, C., Liu, W., Brown, D. L., Louie, A. Impact of burden on granulocyte clearance of bacteria in a mouse thigh infection model. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4368-4372 (2010).
- Miles, T. J., et al. Novel hydroxyl tricyclics (e.g. GSK966587) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 23 (19), 5437-5441 (2013).
- Hunt, E. Pleuromutilin antibiotics. Drugs Future. 25 (11), 1163-1168 (2000).
- Jin, Q., et al. Novel LpxC inhibitors with broad-spectrum gram-negative activity. Proceedings of the 44th National Organic Chemistry Symposium.. College Park, MD, , Abstract T-31 (2015).
- Singley, C., Page, R., Hoover, J., Elefante, P., DeMarsh, P. Efficacy of a LRS inhibitor GSK2251052 against Enterobacteriaceae isolates using a computer-controlled infusion system to recreate human PK profiles in rats. Clin Microbiol Infect. 17 (S4), S429-S430 (2011).
- Berry, V., et al. Comparative in vivo activity of gemifloxacin in a rat model of respiratory tract infection. J Antimicrob Chemother. 45 (S1), 79-85 (2000).
- Tsuji, M., et al. S-649266, a Novel Siderophore Cephalosporin: Efficacy against Klebsiella pneumoniae producing NDM-1 or KPC in rat lung infection model with recreated humanized exposure profile of 2 gram dose with 1 hour and 3 hours infusion. Open Forum Infect Dis. 1 (S1), S106-S107 (2014).
- Tsuji, M., et al. Use of Iron Depleted Mueller Hinton Broth (IDMHB) for microdilution testing of S-649266, a novel siderophore cephalosporin. 26th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Amsterdam, Netherlands, , Abstract P0808 (2016).
- Singley, C., Hoover, J., DeMarsh, P. J., Elefante, P., Zalacain, M. Efficacy of PDF Inhibitor GSK1322322 Against Abscess Infections Caused by MRSA Using a Computer-Controlled Infusion System to Recreate Human PK Profiles in Rats. Proceedings of the 60th Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Boston, MA, , Abstract F1-2114 (2010).
- Hoover, J., Mininger, C., Rittenhouse, S. GSK2251052, a novel LeuRS inhibitor, is effective against multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa in a mouse pneumonia model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract B-1308 (2012).
- Hoover, J., Mininger, C., Novick, S., Rittenhouse, S. Efficacy of GSK2140944 against Streptococcus pneumoniae in a non-neutropenic mouse lung infection model. Proceedings of the 53rd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Denver, CO, , Abstract A-014 (2013).
- Hoover, J. L., et al. Selection of a lung infection model to predict efficacy in community-acquired pneumonia (CAP) caused by S. pneumoniae (SP). Proceedings of the 47th Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, Illinois, , Abstract A-17 (2007).
- Drusano, G. L., et al. Saturability of granulocyte kill of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of pneumonia. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2693-2695 (2011).
- Peric, M., Browne, F. A., Jacobs, M. R., Applebaum, P. C. Activity of nine oral agents against gram-positive and gram-negative bacteria encountered in community-acquired infections: use of pharmacokinetic/pharmacodynamic breakpoints in the comparative assessment of beta-lactam and macrolide antimicrobial agents. Clin Ther. 25 (1), 169-177 (2003).
- Calbo, E., Garau, J. Application of pharmacokinetics and pharmacodynamics to antimicrobial therapy of community-acquired respiratory tract infections. Respiration. 72 (6), 561-571 (2005).
- Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2140944 against Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 54th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Washington, DC, , Abstract A-680 (2014).
- Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1270 (2012).
- Andes, D. R., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli using data from a neutropenic murine-pneumonia infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1271 (2012).
