Abstract
Effekt av kandidat antibakteriella behandlingar måste demonstreras i djurmodeller av infektion som en del av forsknings- och utvecklingsprocessen, företrädesvis i modeller som efterliknar den avsedda kliniska indikationen. Ett förfarande för inducering av robusta lunginfektioner hos immunkompetenta råttor och möss beskrivs som möjliggör för bedömningen av behandlingar i en modell av allvarlig pneumoni orsakad av S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae eller A. baumannii. Djuren bedövas och ett agar-baserad ympen deponeras djupt in i lungorna via icke-kirurgisk intratrakeal intubering. Den resulterande infektion är konsekvent, reproducerbar och stabil under minst 48 h och upp till 96 h för de flesta isolat. Studier med salu antibakteriella har visat god korrelation mellan in vivo effektivitet och in vitro-känslighet, och samstämmighet mellan farmakokinetiska / farmakodynamiska mål bestämsi denna modell och kliniskt accepterade mål har observerats. Även om det finns en initial investering i tid när man lär sig tekniken, kan den utföras snabbt och effektivt när kunskaper uppnås. Fördelarna med modellen inkluderar eliminering av neutropeni krav ökad robusthet och reproducerbarhet, förmågan att studera flera patogener och isolat, ökad flexibilitet i studiedesign och etablering av en utmanande infektion i en immun värd.
Introduction
Utvärdera effekten av potentiella läkemedelskandidater i djurmodeller av infektion är en kritisk komponent i antibakteriella läkemedelsutvecklingsprocessen. In vivo effektivitetsstudier ger viktiga data för beslutsfattandet över loppet av upptäckten insatser från klarlägga struktur-aktivitetssamband (SAR) och optimera bly kemisk serie genom att bestämma farmakokinetiska-farmakodynamiska (PK / PD) egenskaper hos föreningar och stödja dosen för klinisk utveckling och godkännande. Ett stort antal djur infektionsmodeller beskrivs i litteraturen för dessa ändamål. En av de vanligaste och mest använda modellerna är neutropeni mus lår infektion, som var uppfunnen av Eagle 1, 2 och senare utökas med Vogelman och Craig 3, 4. Denna modell har varit ovärderlig för att stödja fastställandet av bakterie brytpunkter och för att tillhandahålla PK / PD mål för att styra dosering till människa. Det finns många examenciper där det prediktiva förmåga av denna modell har visat 4-7. Men en av nackdelarna med infektionen låret modellen bristen på direkt relevans för lunginfektioner. Det finns nu en större tonvikt på att matcha infektionsstället i djurmodeller till infektionsstället i människor; och sålunda, för att studera föreningar för behandling av lunginflammation, är det idealiskt att utnyttja en lunginfektionsmodell hos djur.
Flera metoder för att inducera lunginfektioner hos försöksdjur har beskrivits och använts för antibakteriella effektivitetsstudier inklusive intranasal inhalation, aspiration via munhåla rutten aerosolexponering och kirurgisk intratrakeal ympning 8. I många fall måste djuren (särskilt möss) först göras neutropena för att uppnå en robust lunginfektion. Trots detta allvarligt tillstånd av nedsatt immunförsvar, är antalet bakteriella patogener och stammar som producerar livskraftiga infektioner hos gnagarebegränsad. Till exempel kan det vara svårt att framgångsrikt etablera Haemophilus influenzae eller Acinetobacter baumannii i lunginflammation modeller 9, 10, och ännu mer virulent patogener, såsom Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa och Klebsiella pneumoniae, kan innebära utmaningar 11-13.
1991 beskrev Smith en lunginfektionsmodell hos immunkompetenta avvanda råttor där infektion etablerades genom att ingjuta bakterier direkt in i lungorna via en enkel icke-kirurgisk intratrakeal intubering metod 14. Berry et al. senare ändrat metod för att infektera möss 15. Med hjälp av en agar-baserad inokulum, inducerar denna ympning teknik robusta lunginfektioner hos både immunkompetenta råttor och möss med S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa och A. baumannii. Det är mottaglig för ett brett spektrum av isolat, inklusive de som härbärgerar olika resistringsfaktorer och de som inte producerar en livskraftig infektion via andra ympning vägar. Den tillåter också effekten som skall fastställas i immunkompetenta djur, ett tillstånd som är mer relevant än den traditionella neutropeni musmodell för patientpopulationer som inte är allvarligt nedsatt immunförsvar. Konsistensen och tillförlitligheten i denna modell över flera patogener och isolat gör den väl lämpad för antibakteriella effektivitetsstudier.
Protocol
S. pneumonie
Alla förfaranden är förenliga med protokoll som godkänts av GSK Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC), och möta eller överträffa normerna i American Association för ackreditering av Laboratory Animal Care (AAALAC), Förenta staternas Department of Health and Human tjänster och alla lokala och federala lagar djurskydds.
OBS: Om inget annat anges, bör alla förfaranden utföras med aseptisk teknik.
1. Kultur bakterieisolat
- Förbereda 3 till 6 agarplattor med S. pneumoniae eller H. influenzae, såsom buljongkultur i allmänhet inte ger tillräckligt material för ympning.
- Avlägsna en fryst stamkultur från lagring vid -80 ° C, tinas fullständigt, och strimma upp till 100 mikroliter per platta på tryptisk sojaagar kompletterat med fårblod (S. pneumoniae) eller på chokladagar (H. influenzae) med användning av mikrobiologiska standardtekniker. Inkubera över natten vid 37 ° C med eller utan 5% CO2.
- Förbereda buljongkulturer med K. pneumoniae, P. aeruginosa eller A. baumannii.
- Avlägsna en fryst stamkultur från lagring vid -80 ° C, tinas fullständigt, och delprov 100 mikroliter av beståndet i 50 ml hjärna-hjärta-infusion (BHI) buljong. Inkubera över natten vid 37 ° C med försiktig skakning (ca 120 rpm).
- [Valfritt] Om en logfas kultur önskas, delprov 1 ml från den resulterande natten kultur i 50 ml färsk BHI buljong. Inkubera under 3 h vid 37 ° C med försiktig skakning (ca 120 rpm).
2. Förbered Saline bakteriesuspensioner
- För alla berednings suspension steg (2,1 till 2,3), utnyttjar steril saltlösning vid en temperatur mellan omgivande luft och 37 ° C. Harvest natten tillväxt S. pneumoniae eller H. influenzae från agarplattorna genom att skrapa kolonierfrån ytan med en steril ögla. Överföra det skördade materialet i 5 ml steril saltlösning till dess att en grumlig, är ogenomskinlig suspension erhålls och försiktigt skaka tills homogen.
- Centrifugera 50 ml av K. pneumoniae, P. aeruginosa eller A. baumannii slutlig buljongodlingar avsedda för ympning (t.ex. över natten eller log fas kulturer) under 5 min vid 4500 x g. Avlägsna supernatanten med en pipett och kasta. Återsuspendera pelleten i åtminstone 5 ml steril saltlösning, och försiktigt virvel för att uppnå en homogen suspension.
- Om så är nödvändigt, späd suspensionen ytterligare med steril saltlösning för erhållande av en densitet inom området från 8 till 9 log 10 kolonibildande enheter (CFU) / ml. Ta en portion för bestämning av CFU / ml. Seriellt späda och plattan alikvoten som beskrivs i avsnitten 7.5 och 7.6.
3. Förbered Agar-baserade Vaccin
- Förbereda en liten flaska (ungefär 50 mL) av näringsagar enligding med tillverkarens instruktioner eller smälta en flaska solid näringsagar som tidigare framställdes och lagrades. Låta det svalna till ca 50 ° C.
- Transportera flytande agar och alla nödvändiga verktyg och utrustning för process infektion förfarandet område där djuren kommer att bli smittade. Bibehålla en liten vattenbad inställt på 42 ° C i området.
- Tillåta agar för att nå en temperatur av ca 50 ° C, och sedan alikvot 9 ml till ett sterilt rör med lämplig storlek för att passa in i vattenbadet. Lämna det här röret i vattenbadet till dess ägarn jämvikt till ca 42 ° C. Säkerställa att vattnet är på ett djup som kommer att täcka ytan av ägarn i sin behållare, men inte röra locket eller locket.
- Tillsätt 1 ml saltlösnings bakteriesuspensionen från steg 2,3 in i rör innehållande 9 ml agar i vattenbadet. Cap röret, vänd flera gånger för att blanda, och returnera den till vattenbadet.
4. Ennesthetize, intuberas och inokulera djur
NOT: specifika patogenfria (SPF) immunkompetenta Sprague-Dawley-råttor som vägde 100 till 120 g eller manliga CD-1-möss som vägde 20-25 g rekommenderas. Ge alla djur med mat och vatten efter behag och hus dem socialt på träflis eller annan absorberande strö med standard 12 h ljus-mörker cykler.
- Innan de genomför några experiment, skaffa och sterilisera en metallkanyl och polyetenrör av lämplig storlek för de djurarter. Skaffa sterila 1 ml engångssprutor och sterila engångs 25-nålar.
Varning: Alltid förfoga över dessa sprutor och nålar i en avfallsbehållare.- För råttor, köp eller tillverka en metallkanyl som är ca 12 cm i längd, har en ID 0,9-1,0 mm och OD 1,0-1,2 mm, och är böjd till en ungefärlig 45 ° vinkel i ena änden. Skär en 11- till 12-tums längd av polyeten slang med en ID av 0,4 mm och OD 0,8 mm. (Hänvisa till
- För möss, köpa en # 20 djurfoder röret. Ta bollen från slutet av röret genom att greppa den med en tång och dra kraftigt, och sedan försiktigt böja änden till en ungefärlig 45 ° vinkel. Skär en 11- till 12-tums längd av polyeten slang med en ID av 0,28 mm och OD 0,61 mm. Även köpa och sterilisera ett glas 100 mikroliter mikroinjektionsspruta och en 30-gauge metallmikroinjektionsnål. (Se figur 1B).
- Placera metallkanyl i ett glas, skruvkapsylröret och autoklav med standardmetoder för att sterilisera. Blötlägg och lagra skära längder av slangen polyeten i en täckt bägare innehållande alkohol.
- För råttor, köp eller tillverka en metallkanyl som är ca 12 cm i längd, har en ID 0,9-1,0 mm och OD 1,0-1,2 mm, och är böjd till en ungefärlig 45 ° vinkel i ena änden. Skär en 11- till 12-tums längd av polyeten slang med en ID av 0,4 mm och OD 0,8 mm. (Hänvisa till
- Förbered arbetsytan och intubation enhet.
- Placera en ren engångsmatta på arbetsytan, nära till vattenbadet. Överföra metallkanyl, i dess glaslagringsröret, till denna yta. Ta bort locket från lagringsröret och skjut "handtag" i slutet av cannula till den öppna änden av röret.
- Använda steril pincett, ta bort en längd av polyeten slang från bägaren och sätt in den genom insidan av den sterila metallkanyl, se till att det rör sig fritt. Passa en steril engångs 25-gauge nål (för råttor) eller den steriliserade 30-gauge metallnål av en glasmikroinjektionsspruta (för möss) på den fria änden av slangen polyeten genom att skjuta nålen flera mm in i röret. (Se figur 1A för råtta och figur 1B för möss).
- Placera markeringarna på både metallkanyl och polyetenrör för att indikera djupet av införande i djuret genom att följa intubation förfarande som beskrivs nedan på en enda avlivas djuret. Öppna brösthålan för observation, sedan placera metallkanyl ordentligt och föra slangen polyeten lämpligt sätt (som beskrivs i avsnitt 4.7). Med outplånlig penna markerar metallkanyl där den möter djurets mun och polyeten slangen där den möter toppen av metallkanyl för att underlätta korrekt placering i återstående djuren.
- Inom ett dragskåp (eller användning av ett lämpligt spolningssystem), söva upp till 6 djur i taget i en sluten kammare matas med ≤5% isofluran i 1,5 L / min syre tills kräkreflexen inhiberas (ca 1 min).
OBS: innan någon experiment fastställa säkra dosen och exponeringstid för isofluran på de särskilda villkor som används (t.ex. storlek / typ av kammaren och storlek / art / stam av djur) för att förhindra oavsiktlig dödlig exponering. - Fyll en steril engångs 1 ml spruta (för råttor) med steril koksaltlösning genom att placera den sterila spetsen i saltlösning och dra tillbaka kolven. Fyll den sterila glasmikroinjektionsspruta (för möss) såsom beskrivs nedan. Fäst sprutan till nålen inpassad på slangen polyeten, och spola hela volymen av saltlösning genom slangen tills Syringe töms.
- För att fylla mikroinjektionsspruta (för möss), helt ta bort metallkolven och nål (monterad på slangen polyeten) från sprutan och ställa in både åt sidan.
- Fyll en steril engångs 1 ml spruta med steril koksaltlösning (såsom beskrivits ovan) och bifoga en steril engångs 25-gauge nål. För in nålen i toppen av mikroinjektionsspruta (där metall kolven kommer att infogas), och tryck ned kolven i engångsspruta tills den fyller mikroinjektionsspruta med saltlösning.
- Kasta engångsspruta och nål som användes för att fylla mikroinjektion sprutan i en avfallsbehållare. Sätt tillbaka metallmikroinjektionsnål (inpassad på slangen polyeten) till spetsen av mikro-injektionsspruta den och sätt den metallkolven, deprimerande tills hela volym saltlösning har spolats genom sprutan och slangen.
- Fyll sprutan med agar baserade inokulum tillbakam behållaren i vattenbadet, och spola agar genom slangen bara tills slangen primas (t.ex. fylls fullständigt med agar).
- För råttor, avlägsna 25-gauge nål (monterad på slangen polyeten) från engångsspruta. Kasta den använda sprutan i en avfallsbehållare. Fyll en ny, steril engångs 1 ml spruta med agar-baserad ympen från behållaren i vattenbadet genom att placera den sterila spetsen i ympen och dra tillbaka kolven. Sätt tillbaka nålen (inpassad på slangen polyeten) och spola agar genom slangen genom att trycka in kolven bara tills slangen är helt fyllt med agar.
- För möss, avlägsna metallmikroinjektionsnål (monterad på slangen polyeten) och metall kolven från mikroinjektionsspruta och ställ åt sidan. Med hjälp av en steril engångs 1 ml spruta och sterila engångs 25-gauge nål, fylla mikro-injektionsspruta med agar-baserad ympen från behållaren ivattenbad med hjälp av fyllningsproceduren som beskrivs i avsnitt 4.4. Sätt tillbaka metallmikroinjektionsnål (monterad på slangen polyeten), för in metallkolven, och spola agar genom slangen bara tills slangen är helt fylld med agar.
- Ta bort ett djur från anestesi kammaren. Placera djuret i ryggläge på engångsmattan med huvudet åt höger och svans till vänster såsom visas i figur 1C.
- Använda intubation anordningen (dvs. metallkanyl försedd med polyetenrör), intuberas djuret och för in kanylen i den stora loben av den vänstra lungan (se figur 1D).
- För in den fria änden av metallkanylen in i djurets mun. Vrid kanylen så att den fria änden är vinklad uppåt och försiktigt föra den framåt in i luftstrupen, noggrant förbi de laryngeala strukturer med en lätt vridrörelse. Bekräfta insättning i luftstrupen i motsats till denmatstrupen genom att försiktigt dra kanylen något framåt och tillbaka flera gånger medan palpera trakealringar med vänster pekfinger som visas i figur 1C.
- När kanylen når bifurkationen där luftstrupen delas i de vänstra och högra bronkerna, göra att vrida den lätt i riktning mot djurets vänstra sida för att säkerställa att kanylen är införd i den vänstra bronk. Advance metallkanylen till slutet är halvvägs till tre fjärdedelar ner till vänster lunga, med hjälp av tidigare släppts ut styrtecken för att bekräfta att rätt djup har nåtts.
- Med metallkanylen på plats, föra fram polyetenslang flera mm. Använd tidigare placerad styr märke på slangen för att säkerställa att det förs fram tillräckligt bara långt för att avsluta slutet av metallkanyl och inte punktera lungan.
- Med både kanyler på plats, använd den bifogade sprutan för att ingjuta 100 mikroliter (för råttor) eller 20 mikroliter (för möss) av agar suspension djupt in i den stora loben av vänstra lungan (se figur 1D). Återkalla flera mm slangen polyeten, och sedan försiktigt bort den intakta intubering enheten. Ställa den tillbaka in i glaslagringsröret, och flytta djuret in i en färsk bur för att återhämta sig.
- Fortsätt anesthetizing, intuberande och ympa de återstående djuren.
- Mellan partier av bedövade djur, avlägsna nålen (monterad på slangen) från sprutan. För råttor, kassera den använda engångsspruta i en avfallsbehållare och fylla en ny, steril engångsspruta från ympen i vattenbad. För möss, fylla samma glasmikroinjektionsspruta från ympen i vattenbadet med hjälp fyllningen teknik som beskrivs i avsnitt 4.4.
- Om agar börjar tjockna i intubation enheten spola alla återstående agar genom slangen. Ta bort nålen från sprutan (lämnar nålen monterad på slangen polyeten). Följ de förfaranden som beskrivsi avsnitt 4.4 för att spola varmt, steril saltlösning genom intubation anordningen, som behövs för att helt klart något blockering upprepas. Töm alla saltlösning från sprutan och förbereda agar inokulum igen som beskrivs i avsnitt 4.5.
- Beräknar de slutliga bakteriell inokulum per djur med användning av CFU bestämdes från saltlösningssuspension (se avsnitt 2.3), det slutliga utspädningsfaktorn för denna saltlösningssuspension i agar (t.ex. tio-faldigt), och volymen instilleras i djuren (t.ex. 100 mikroliter för råttor eller 20 mikroliter för möss).
5. Utvärdera Djur för Potential Mis-ympning eller andra biverkningar
- Noggrant följa alla djur under intubering, instillation av agar och återhämtning från anestesi för att bedöma för potentiella mis-ympning. Omedelbart avliva (enligt lokala IACUC riktlinjer) varje djur som blöder, uppvisar onormal andning (t.ex. ansträngd andning eller kippa), inte rör signormalt om buren, eller inte visas klarögd och hälsosamt på återhämtning från anestesi.
- Om spontan andningssvikt inträffar (vanligtvis när inokulatet inte placeras tillräckligt djupt och blockerar luftvägarna), bekräfta döden genom observation och utföra en sekundär metod för dödshjälp (såsom halsdislokation eller torakotomi).
- Minimera den tid djuren utsätts för isofluran, som anestesi krävs endast några minuter att utföra proceduren. Om Injektionsanestetika används se till att djuren är under observation tills den är helt vaken. Placera djur, särskilt möss, i en varm miljö för återvinning vid användning av injicerbara anestetika.
- Observera djuren minst två gånger dagligen under studieperioden för följande tecken på respiratorisk sjukdom: uttalad andning, piloerektion, minskad aktivitet och minskad kroppstemperatur. Omedelbart avliva (enligt lokala IACUC riktlinjer) alla djur som är döende, experieNCES ansträngd andning eller andnöd, har en märkbart minskad kroppstemperatur vid hantering, är oförmögen eller ovillig att röra sig eller kan inte nå mat och vatten.
6. Administrera Testbehandlingar
- Förbereda och administrera provbehandlingar enligt planerade studiedesign. Börja administrering av behandlingar på ett eller två timmar efter infektion (eller fördröja behandlingen vidare om en högre utgångs bakteriell belastning önskas). Specifika detaljer för beredning och administrering av test behandlingar kan inte ges eftersom det beror på syftet med studien samt egenskaperna för varje individuell behandling. (Se Figur 3 som ett exempel.)
- Avsätt en grupp av infekterade, obehandlade djur för att tjäna som utgångs kontroller. Räkna den bakteriella bördan i lungorna hos dessa djur vid tidpunkten behandlingen inleds för de andra grupperna, enligt de förfaranden som beskrivs i avsnitt 7.
- För PK / PD-analyser, bedömaDen farmakokinetiska profilen för den administrerade behandlingen (s) i blodet och / eller vävnader av infekterade djur. Särskilda förfaranden för farmakokinetiska studier är utanför ramen för denna artikel.
7. Räkna levande bakterier från lungorna
- Avliva en grupp av obehandlade djur vid tidpunkten behandling initieras för de andra grupperna (baslinje) och alla kvarvarande djur vid slutet av studieperioden (vanligtvis 24, 48 eller 96 timmar efter infektion) genom inhalation exponering för successivt ökande nivåer av kol dioxid i en sluten kammare eller en alternativ metod som rekommenderas av lokala IACUC riktlinjer. Kontrollera döden genom observation, och utför en sekundär metod för eutanasi (såsom halsdislokation eller torakotomi).
- Placera djur i ryggläge på en ren engångs matta, och grundligt blöta pälsen över bröstet med alkohol.
- Med hjälp av steril sax, skär genom huden, underliggande muskellagret och bröstkorgparallellt med bröstbenet för att öppna brösthålan. Ta försiktigt tag i lungorna med steril pincett och dra ut, med hjälp av sax för att skilja dem från luftstrupen om det behövs. Placera lungor på steril gasbinda för att absorbera överskott av blod. Om hjärtat har också tagits bort, dissekera bort och kasta.
- Gör små snips i lungorna med steril sax för att exponera inre delar och använda sterila pincett för att placera lungorna (plus några bitar som av misstag klippt bort) i botten av en lab blender påse. rulla ned en tjock runt föremål (t.ex. en penna eller markör) över utsidan av påsen för att mosa vävnaden. Pipettera 1 ml steril koksaltlösning i påsen, placera påsen i ett labb mixer, och köra labbet mixer vid hög hastighet under 2 min.
- Överför homogeniserades proverna från de blandade påsar i rör eller plattor med hjälp av en pipett. Späd homogenatet tiofaldigt genom aliquotting en-del homogenatet i 9-delar saltlösning (t.ex. 100 mikroliter homogenatet i 900 mikroliter Saline). Späd den resulterande suspensionen med tio-faldig igen på ett liknande sätt. Fortsätt att späda varje ny erhållna suspensionen av en annan tiofaldig faktor förrän tidigast 6 serieutspädningar har framställts från det ursprungliga homogenatet.
- Pipett trippel alikvoter av 20 mikroliter vardera från alla utspädningar på Trypticase soja agarplattor kompletterade med fårblod (S. pneumoniae, K. pneumoniae, P. aeruginosa eller A. baumannii), eller på choklad agarplattor (H. influenzae). Inkubera över natten vid 37 ° C med eller utan CO2. (Se figur 1E för ett exempel på en resulterande platta.)
- Räkna kolonierna i varje av de tre replik vid den första spädningen som innehåller en "countable" nummer (dvs inte alltför många kolonier rimligen räknas). Beräkna det genomsnittliga värdet av de tre replikat. Bestämma CFU per lungorna genom att multiplicera medelvärdet med 50 (för att beakta för plätering 20 mikroliter av den totala 1 mlhomogenatet) och factoring i den slutliga utspädningsfaktorn från den ursprungliga homogenatet vid vilken kolonierna räknades.
Representative Results
De verktyg som krävs, orientering av djuret, och djupet av intubation visas i figur 1. Dessutom visas ett representativt exempel på kolonier som växer på en agarplatta efter serieutspädning och tre plattor av en lunghomogenat prov. En ökning av bakteriell belastning av flera log 10 CFU över baslinjenivåer kontroller typiskt observeras i infekterade lungor för de flesta bakterieisolat, även vid 96 h efter infektion, och variabilitet mellan djur är låg (Figur 2). För vissa H. influenzae, kan det finnas lite tillväxt; bör dock infektionen inte börja själv lösa inom en 48 eller 96 timmar tidsperiod (Figur 2B). Denna lunginfektionsmodell kan användas under optimering av bly kemisk serie för att stödja SAR, såsom visas i figur 3 för representativa föreningar enligt två olika serier 16, 17. Det ger en konsekvent, reproducerbart uppfylldahod för att bedöma PK / PD i immunkompetenta djur och användes för att fastställa att fritt läkemedel ytan under koncentrationskurvan över den minsta hämmande koncentrationen (fAUC / MIC) korrelerade med effektiviteten av en ny polypeptid deformylase (PDF) hämmare mot S. pneumoniae och H. influenzae (Figur 4). Dessutom är fAUC / MIC mål för stasis och en 1-log 10 minskning av CFU från baslinjen kontroller bestämdes över 11 S. pneumoniae och 5 H. influenzae isolat (tabell 1) 18. Koppling denna infektionsmodell med ett system för läkemedelsleverans för att återskapa mänskliga farmakokinetiska profiler i råttor skapar ett kraftfullt verktyg för att utvärdera mänskliga doseringsregimer före kliniska studier. Ett exempel på detta sammanfattas i tabell 2, som visar att en förlängd frisättning av amoxicillin-klavulanat var mer verksamt än existerande doseringsregimer för organismer med Elevated MIC-värden 19.
Figur 1: Icke-kirurgisk intratrakeal intubering. Verktyg visas för intuberande råtta (A) och mus (B). När sövda, bör djuret placeras som visas i C, med huvudet åt höger och svans till vänster om individen utför tekniken är högerhänt. Placera den vänstra pekfingret försiktigt på halsen för att palpera de trakeala ringarna för att bekräfta korrekt kanylplacering. Inokulatet bör placeras djupt in i vänster lunga, såsom visas i den ventrala vy av en råttlunga (D). Kolonier växer på agar efter serieutspädning och plätering av ett prov bör likna den som visas i E. Figur 1D, Copyright © Gill Smith [försöksdjur, volym 25 (1991), G. Smith, Aenkel, icke-kirurgisk metod för intrabronkial instillation för fastställandet av luftvägsinfektioner hos råtta, sid 46 - 49] 14. Återges med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa exempel på bakterietillväxt i lungorna hos infekterade djur. Medelvärde ± standardavvikelse CFU data från n = 5 djur / grupp visas för olika isolat av S. pneumoniae (A), H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) och A. baumannii (E). Den första stapeln i varje par (ljusgrå) är baslinjen bacterial börda på en eller två timmar efter infektion, medan den andra stapeln är den slut-på-studie tillväxtkontroll vid 48 h efter infektion (mörkgrå) eller 96 h efter infektion (svart). Inga data Censurering metoder tillämpas; Således är dessa resultat inkluderar data från alla 5 djur per grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Utvärdering av effekt av olika kemiska serie under Lead optimering. Lunginfektion modeller med de beskrivna teknikerna användes för att undersöka struktur-aktivitetssamband som en del av abakteriell typ IIA topoisomeras program. Lovande föreningar 7 och en utvärderades mot kinolon-känsliga (A) 16 eller kinolon-resistenta(B) 17 isolat av S. pneumoniae, respektive. Varje symbol representerar CFU bestämdes från lungorna hos en råtta med linjer som representerar gruppen medelvärde och standardavvikelse. Lägre kvantifieringsgränsen (LLQ) var 1,7 log 10 CFU / lungor. Föreningar vägdes (56 eller 112 mg ren fri modermolekylen), upplöst i 9 ml sterilt vatten, späddes 3 ml i 3 ml vatten (1: 1) och administrerades genom oral sondmatning av 1 ml / 125 g råtta två gånger per dag ( 6 - 7 h mellanrum) under 2 dagar, med början vid 1 h efter infektion. Obehandlade kontroller (NTC) provtogs vid en h efter infektion för baslinje eller behandlas med saltlösning och samplas vid slutet av studien (48 h) för tillväxtkontroller. Figur 3A omtryckt från Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volym 21, TJ Miles et al, Nya cyklohexyl-amider som potenta antibakteriella riktar bakteriell typ IIA topoisomeraser, sidor 7483 -. 7488, Copyright (2011) 16, med tillåtelse från Elsevier.Figur 3B omtryckt från Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volym 26, TJ Miles et al, Nya tricykliska (t ex GSK945237) som potenta hämmare av bakteriell typ IIA topoisomeraser, Pages 2464 -. 2469, Copyright (2016) 17, med tillåtelse från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: PK / PD karakterisering av en ny PDF-hämmare. Emax modeller skapas med hjälp av dos varierande effektdata hos immunkompetenta möss infekterade i lungan med isolat av S. pneumoniae (A) eller H. influenzae (B) för att bestämma PK / PD mål för en ny PDF-hämmare 18. cirklarrepresenterar medelvärdet bakteriell belastning 4-5 möss / grupp behandlades med varierande doser av förening. Analyser utfördes för att korrelera effekten med fri-läkemedel 24 h AUC (öppna cirklar) eller AUC / MIC (fyllda cirklar). Omtryckt med tillåtelse, Copyright © American Society for Microbiology, [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, volym 60, 2016, sid 180 - 189] 18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Stasis | 1-log 10 minskning | ||||||
| Organism | MIC (^ g / ml) | R 2 för line fit (%) | fAUC | fAUC / MIC | fAUC | fAUC / MIC | max dödande (log 10 minskning) |
| S. pneumoniae | |||||||
| 10127 | 0,25 | 99,9 | 2,0 | 8,1 | 3,6 | 14,4 | 2,8 |
| 1316009S | 0,25 | 96,1 | 6,5 | 26,0 | 15,1 | 60,3 | 1,8 |
| ATCC10813 | 0,5 | 100 | 8,4 | 16,9 | 22,2 | 44,5 | 1,2 |
| 1307007S | 1 95,8 | 16,1 | 16,1 | 20,1 | 20,1 | 2,7 | |
| ATCC6303 | 1 | 99,8 | 19,8 | 19,8 | 24,8 | 24,8 | 2,8 |
| 1629 | 2 | 100 | 15,8 | 7,9 | 21,2 | 10,6 | 2,4 |
| 298443 | 2 | 99,9 | 26,5 | 13,2 | 31,0 | 15,5 | 2,3 |
| 336808 | 2 | 86 | 8,2 | 4,2 | 19,0 | 9,5 | 2,6 |
| 338860 | 2 | 99,5 | 2,9 | 1,5 | 6,7 | 3,4 | 2,8 |
| & #160; 340449 | 2 | 94,6 | 8,0 | 4,0 | 14,9 | 7,4 | 2,1 |
| L11259 | 2 | 100 | 7,1 | 3,5 | 9,0 | 4,5 | 2,0 |
| Medelvärde ± SD | NA ett | NA | 11,0 ± 7,5 | 11,0 ± 7,9 | 17,0 ± 8,2 | 19,5 ± 17,8 | 2,3 ± 0,5 |
| Median | NA | NA | 8,2 | 8,1 | 19,0 | 14,4 | 2,4 |
| H. influenzae | |||||||
| 1998-100-126H | 1 | 99,7 | 7,3 | 7,3 | 13,4 | 13,4 | 2,9 |
| 503-008H | 1 | 99,8 | 7,1 | 7,1 | 13,9 | 13,9 | 2,7 |
| 08003H | 2 | 99,9 | 14,5 | 7,2 | 16,7 | 8,3 | 2,7 |
| H128 | 2 | 96,6 | 15,3 | 7,6 | 26,0 | 13,0 | 2,7 |
| 19001H | 4 | 91,9 | 14,8 | 3,7 | 37,3 | 9,3 | 3,0 |
| Medelvärde ± SD | NA | NA | 11,8 ± 4,2 | 6,6 ± 1,6 | 21,5 ± 10,2 | 11,6 ± 2,6 | 2,8 ± 0,1 |
| Median | NA | NA | 14,5 | 7,2 | 16,7 | 13,0 | 2,7 |
| en NA, inte tillämplig. | |||||||
Tabell 1: PK / PD Mål för en roman PDF hämmare mot S. pneumoniae och H. influenzae isolat. Fritt läkemedel AUC och AUC / MIC mål för stasis och en 1-log 10 minskning av CFU från baslinjen bestämdes för 11 S. pneumoniae och 5 H. influenzae i immunkompetenta möss infekterade i lungan och behandlades med förening 18. daten användes för att hjälpa till att välja humana doser för klinisk utveckling. Denna tabell har anpassats och återges med tillstånd, Copyright © American Society for Microbiology, [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, volym 60, 2016, sid 180 - 189] 18.
| Behandlingsgrupp a | Logaritmiska medelvärdet 10 S. pneumoniae (CFU / lunga) b ± SD för stammen (AMX / CA MIC): | |||||||
| 05010S (2 | ig / ml) | 16001S c (4 | ig / ml) | 16001S (4 | ig / ml) | 30005S (4 | ig / ml) | 20009S (4 | ig / ml) | 05003S (8 | ig / ml) | 404053 (8 | ig / ml) | 47003S (8 | ig / ml) | |
| Kontrollera | 7,3 ± 0,4 | 7,0 ± 0,8 | 5,7 ± 1,2 | 7,1 ± 0,7 | 7,1 ± 0,4 | 6,4 ± 0,6 | 6,8 ± 0,4 | 6,0 ± 0,3 |
| AMX / CA | ||||||||
| 2000/125 mg två gånger dagligen (förhållande 16: 1) | ≤ 1,7 ** | 2,8 ± 1,2 ** | 2,2 ± 0,8 ** | 2,3 ± 0,9 ** | 2,5 ± 0,9 ** | 2,0 ± 0,9 ** | 3,8 ± 1,4 ** | 1,8 ± 0,2 ** |
| 1000/125 mg tid (förhållande 8: 1) | NT | NT | 2,8 ± 0,5 ** | 2,7 ± 1,3 ** | 3,3 ± 0,9 ** | 4,9 ± 0,5 ** | 6,6 ± 1,3 | 4,7 ± 0,7 ** |
| NT | NT | 3,0 ± 1,3 * | 2,1 ± 0,7 ** | 3,2 ± 0,4 ** | 5,2 ± 0,9 * | 6,4 ± 0,6 | 4,9 ± 0,4 ** | |
| 875/125 mg två gånger dagligen (förhållande 7: 1) | NT | NT | 4,5 ± 1,2 * | 5,6 ± 1,3 * | 5,2 ± 0,7 ** | 6,3 ± 0,7 | 6,4 ± 0,7 | 5,5 ± 0,4 |
| 500/125 mg tre gånger dagligen (förhållande 4: 1) | 3,1 ± 1,3 ** | 4,5 ± 0,9 ** | NT | NT | NT | NT | NT | NT |
| Azitromycin, 1000/500 mg en gång dagligen | NT | NT | NT | 5,8 ± 2,0 | 7,1 ± 0,9 | 3,1 ± 1,0 ** | 6,6 ± 0,4 | 6,07; 0,6 |
| Levofloxacin, 500 mg en gång dagligen | NT | NT | 4,2 ± 0,8 * | 5,7 ± 0,8 * | 4,9 ± 0,8 ** | 3,0 ± 1,3 ** | 3,5 ± 0,2 ** | 3,9 ± 0,8 ** |
| Behandlingsgrupp d | Logaritmiska medelvärdet 10 H. influenzae (CFU / lunga) ± SD för stam: | |||||||
| H128 (β-laktamas positiv) | Chesterfield (β-laktamas negativ, ampicillinresistent) | |||||||
| Kontrollera | 6,4 ± 0,6 | 6,7 ± 0,6 | ||||||
| AMX / CA | ||||||||
| 2000/125 mg två gånger dagligen (förhållande 16: 1) | 2,0 ± 0,7 ** | 3,1 ± 0,9 ** | ||||||
| 1000/125 mg tid (förhållande 8: 1) | 2,1 ± 1,0 ** | 3,6 ± 1,1 ** | ||||||
| 875/125 mg tre gånger dagligen (förhållande 7: 1) | 2,8 ± 1,3 ** | 3,8 ± 1,3 ** | ||||||
| 875/125 mg två gånger dagligen (förhållande 7: 1) | 2,0 ± 0,8 ** | 5,1 ± 1,1 ** | ||||||
| Azitromycin, 1000/500 mg en gång dagligen | 3,2 ± 1,7 * | 5,8 ± 1,1 | ||||||
| Levofloxacin, 500 mg en gång dagligen | ≤ 1,7 ** | ≤ 1,7 ** | ||||||
| en AMX / CA, amoxicillin-klavulanat; bid, två gånger dagligen; tre gånger dagligen., tre gånger om dagen; od, en gång om dagen. | ||||||||
| b Detektionsgränsen var <1,7; * Signifikant skild från kontrollen (P ≤ 0,05); ** Signifikant skillnad från kontroll (P ≤ 0,01); NT, ej testad. | ||||||||
| c Stam 16001S testades i två separata experiment. | ||||||||
| d Amoxicillin-klavulanat 500/125 mg (4: 1) tre gånger om dagen har inte testats mot H. influenzae. | ||||||||
Tabell 2: Effekt av åter Human Plasma Exponerings profiler för olika Amoxicillin / klavulanat doseringsregimer. Data som genereras i immunkompetenta råttor infekterade i lungan med isolat av S. pneumoniae eller H. influenzae med denna modell visade att en förbättrad formulering av amoxicillin-klavulanat (2000/125 mg två gånger dagligen) var effektivare än vanliga doseringsregimer mot isolat med förhöjda in vitro känslighet 19. Denna tabell har anpassats och återges med tillstånd, Copyright © American Society for Microbiology, [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, volym 49, 2005, sid 908 - 915] 19.
Discussion
För optimal framgång reproducera denna infektionsmodell, bör följande ytterligare förslag övervägas. Virulens hos nya isolat kan förbättras genom att passera 2 - 3 gånger in vivo före användning i en studie. Frysta bakterie bestånd bör alltid framställas från en primär in vivo-härledda källa med så få passager som möjligt från den ursprungliga, och omfrysning eller återanvändning av den upptinade lager motverkas. Använda senaste kliniska isolat som återvunnits från patienter med lunginflammation, och / eller förbereda kulturer i logfas tillväxt kan också bidra till att förbättra etableringen av infektionen. En fem-faldig utspädning i ägarn (t.ex. 2 ml saltlösningssuspension sattes till 8 ml agar) kan användas i stället för tio-faldigt för att öka den bakteriella inokulatet och inokulum volymen kan justeras baserat på storleken av djuret (t.ex. 200 | il / djur är vanligtvis inokuleras i 250 g råttor). Före tillsats av saltlösning bakteriesuspensionen in iagar (dvs. steg 2,3), kan bakterietäthet förutsägas eller uppskattas genom visuell inspektion, MacFarland standarder eller optiska densitetsmätningar. Det är bra att bekanta sig med de in vitro tillväxtegenskaper för varje isolat innan start vid in vivo experiment. Konsekvens i tillväxt och hantering möjliggör den mest noggrann uppskattning av bakterietätheten för varje givet isolat. Mikrobiologiska standardmetoder som skiljer sig från dem som beskrivs, såsom alternativa medier och vävnads homogenisatorer, kan användas som är lämpligt för framställning av inokulat och listning av bakterier från infekterade vävnader.
Det rekommenderas att förbereda eller smälta agar dagen före experimentet och förvara den natten i en separat vattenbad inställd på 50 ° C. Detta kommer att förenkla processen och att skydda mot agar är för varmt vid tidpunkten för infektion. En temperatur på 41 - 42 ° C uppnår en god balans mellan upprätthålning agar i flytande tillstånd utan att vara alltför varmt för kortsiktiga bakteriell överlevnad. Som ett möjligt alternativ till näringsagar, har ädelagar med framgång använts i vissa experiment. Ett rör agar inokulum är vanligen tillräckligt för en hel experiment (och rekommenderas), men flera rör kan förberedas för att infektera ett stort antal djur (t.ex. mer än 60) eller när den infekterande processen tar längre tid än 30-45 minuter Om multipla inokulatnivåer rören erfordras, tillsätt saltlösning bakteriesuspension till varje rör av agar som det behövs. Detta minskar risken att bakteriell överlevnad och / eller lämplighet kommer att påverkas av förlängd exponering för en förhöjd temperatur före inokulering. Det bör noteras att med hjälp av flera inokulatnivåer rör också kan kräva ytterligare djur randomisering förfaranden. När det är möjligt, infektera alla djur från samma beredning av inokulat. Det rekommenderas att anpassa storleken på experiment för att den nuvarande kompetensnivå med technique.
En skicklig vetenskapsman kan intuberas och inokulera ett djur i mindre än 30 sekunder och inokulera upp till 5 - 6 djur per sats (dvs med en spruta full av agar inokulum). För dem som lär tekniken, är hastigheten viktig som agar börjar stelna; emellertid är viktigare noggrann placering av inokulat. Börja med 1 eller 2 djur per sats, och öka allteftersom tekniken blir mer bekant. Djuren fortsätter att andas under intubation; sålunda, tidsfönstret för ympning beror på hur snabbt djuret återhämtar sig från isofluran, som bör vara ungefär 2-3 min. Djur som väcker under processen kan åter bedövas och försökte en andra gång, men det är inte rekommenderat att göra så upprepade gånger. Framgångsrik ympning på första försöket väntas i nästan 100% av djuren när kunskaper uppnås. Observera att det är lättare att lära sig tekniken med användning av råttor först; möss är mer känsliga och mindre förls är mer benägna att blockering med stelnat agar om inte manipuleras snabbt. Pre-warming sprutor, slangar och saltlösning samt att hålla den intubering anordningen på en varm (inte het) yta, såsom en värmedyna på låg inställning kan hjälpa till att förhindra stelning av ägarn. När lära tekniken, är det också användbart att öva korrekt placering av inokulum med användning av en mörk-färgad färgämne (såsom koncentrerad metylenblått) i stället för den bakteriesuspension i agar. Utföra proceduren som beskrivs, men avliva djuret omedelbart efter ympning av färgämnet (inte tillåta djuret att återhämta sig mellan anestesi och eutanasi). Dissekera att avgöra var färgämnet har placerats, och justera tekniken därefter.
Det primära effektmåttet i denna modell är CFU från infekterade lungor. Överlevnad är inte en bra indikator på bakteriell belastning och inte är en rekommenderad endpoint. För effektstudier, är den föreslagna N 5 - 6 djur per grupp eftersom det är predicted att detektera ≥1 log 10 CFU skillnader mellan grupper med minst 90% effekt. Djur kan smittas i grupper så att burkamrater förblir tillsammans, eller en sann slumpprocess kan följas. Observera att om grupper tilldelas av bur, bör grupperna vara smittade i en slumpmässig sekvens med end-of-studie tillväxtkontroller infekterade sist (för att bekräfta att bakteriell överlevnad / fitness påverkades inte av den tid utsätts för en förhöjd temperatur i vattenbadet). Inga data Censurering metoder bör vara nödvändigt, och ingen rekommenderas med undantag av omedelbart borttagande av djur som har varit uppenbarligen mis-ympade i början av studien (före initiering av eventuella behandlingar). Djur som avlivas före slutet av studien bör provtas och resultat ingår i datamängden inte ett giltigt skäl för uteslutning identifierades prospektivt (dvs. en händelse samband med infektion eller behandling). Drug överföring kan affect några prover och är en viktig faktor i alla in vivo-infektionsmodeller. Om en förening ges ofta, nära tidpunkten för eutanasi eller har en lång halveringstid, kan det vara närvarande i vävnadshomogenat vid en tillräckligt hög koncentration för att fortsätta att döda bakterier ex vivo under den bakteriella uppräkning processen (utspädning och plätering av proverna eller på agarplattorna under natten inkubation). För att förhindra detta, aktiverat kol och / eller ett tillsatsmedel som bryter ned den aktiva molekylen utan att skada bakteriecellerna kan sättas till provet före homogenisering. Andra metoder inkluderar centrifugering av prover för att avlägsna huvuddelen av den aktiva föreningen (som bör förbli i supernatanten) och med användning av olika spädning och utstrykning scheman för att tillräckligt späda den aktiva föreningen till en icke-inhiberande koncentration.
Som framgår av de exempel som visas i figur 2, denna modell framgångsrikt induces lunginfektioner hos gnagare med ett brett spektrum av organismer, inklusive dem som inte växer bra i andra modeller (t.ex. H. influenzae). Dessa infektioner är konsekventa och reproducerbara, vilket minskar sannolikheten för att försöken måste upprepas på grund av modell fel och / eller dålig prestanda med ett givet isolat. Även om djuren är immunkompetenta, de är oförmögna att snabbt lösa infektion, om alls. Detta möjliggör ökad flexibilitet i studie längd, eftersom många isolat upprätthålla en livskraftig infektion genom åtminstone 96 timmar utan behov av upprepade injektioner för att bibehålla neutropeni. Den potentiella fördelen av att studera antibakteriell effekt i immunkompetenta djur har noterats tidigare 20, 21, och det finns bevis för att för vissa föreningar (t.ex. oxazolidinoner), kan uppgifter från icke-neutropena gnagare mer exakt förutsäga mänskliga exponering mål jämfört med dem som återges neutropeni 5. Den mångsidigt verktyg för tHan modell visas i figurerna 3 och 4 och tabellerna 1 och 2. Dessa studier är en del av en stor samling av publicerade och opublicerade data som har genererats med denna modell för att stödja ledningen optimering ansträngningar 16, 17, 22-24, för jämförelse och bekräftelse av föreslagna mänsklig doseringsregimer 19, 25-29 och för PK / PD karakterisering 18, 30-32 .While denna modell är initialt mer komplicerat att genomföra jämfört med intranasal inandning metoden, det finns många fördelar som beskrivits ovan. Med övning och rutinmässig användning, bör de tekniker blir lätt att utföra.
Det kan noteras i vissa studier att bakteriebördan vid baslinjen var lägre än vad som normalt riktad i andra lunginfektionsmodeller. Detta beror till stor del på den önskade utspädningen i agar och liten utmaning volym, särskilt i möss. Det bör emellertid också noterasatt bakterietillväxt sågs i samtliga fall, även när den initiala belastningen var relativt låg. Målet baslinjen bakteriehalten är 6-6,5 log 10 CFU / lungor (6,8 till 7,3 log 10 CFU / g av vävnad hos möss baserade på genomsnittliga lungvikter) vilket motsvarar densiteter uppskattade i humana patienter med svår lunginflammation 33. En högre baslinje börda kan åstadkommas genom att ytterligare koncentrera den bakteriella inokulat eller genom att fördröja starten av föreningen administrationen att tillåta ytterligare bakterietillväxt; dock kan öka utmaningen belastningen för mycket leda till onormalt allvarlig och akut sjukdom (t.ex. död i mindre än 24 timmar) som är behandlingsresistenta mot alla antibakteriella behandlingar oavsett känslighet. Även om inokulatet är från början placeras företrädesvis i den vänstra lungan hos djuret, infektionen sprider sig i allmänhet i hela båda lungorna. Progressiv lungsjukdom, spridning av bakterier till andra organ, och slutligen sjuklighet är ofta Observed med S. pneumoniae, K. pneumoniae och P. aeruginosa. Av intresse, infektioner med H. influenzae och A. baumannii är oftast mer sluten och sällan leder till döden vid den föreskrivna bakterie inokulat.
Effekt resultaten från denna modell har korrelerade väl med in vitro-känslighet profiler samt definierade PK / PD mål. Minskningar i bakteriell belastning rutinmässigt observerats för isolat anses vara känsliga för medlet som testas, medan de som anses resistenta uppvisar ingen förändring eller bakterietillväxt över baslinjen 16, 17, 19, 24-29. Studier på råttor utvärdera två kinoloner och en makrolid enligt denna modell 32 har visat att PK / PD mål som krävs för en 1-log 10 minskning av S. pneumoniae jämfört med baseline korrelerad med målet bestäms i neutropena möss och, ännu viktigare, med kliniska mål för samhällsförvärvad bakteriell pneumOnia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, en ny mekanism antibiotikum, testades mot flera S. pneumoniae och krävde en liknande PK / PD mål för en 1-log 10 minskning av denna lunginfektionsmodell 31 som krävs för en 1-log 10 minskning av neutropeni låret modell 36 när lungpenetration har beaktats (data på fil). På liknande sätt är PK / PD-mål som bestäms i möss för GSK2251052 mot P. aeruginosa var i överensstämmelse för stasis, 1- och 2-log 10 minskningar i CFU mellan denna lungmodellen 30 och neutropena låret infektionsmodell när lungpenetration ansågs 37, 38 . Korrelation med en neutropeni lunginfektion modell med intranasal ympning var dålig; Men GSK2251052 inte producera mer än en statisk reaktion i den studien 38. Detta kan tillskrivas den högre bakteriell inokulum, vilket var 8 log 10 CFU / mus jämfört med sex log
Det finns flera begränsningar av denna immunlunginflammation modell. Först är det inte väl lämpad för att utvärdera utvecklingen av spontan motstånd eftersom den höga bakterie inokulum krävs i allmänhet för sådana studier resulterar i alltför svår infektion. Efter försök att uppnå bakteriella bördor 7 eller 8 log 10 CFU vid baslinjen, snabb sjuklighet har observerats (dvs. djur blir döende på mindre än 24 timmar) trots noggrann tvättning av inokulat för att avlägsna redan existerande toxiner (uppgifter om fil). Detkan vara möjligt att övervinna det här problemet genom att använda större gnagare. Råttor, särskilt tyngre råttor (> 250 g), verkar bättre tolerera högre inokulat jämfört med möss och kan vara lämpliga för dessa typer av studier. En andra begränsning är att användningen av agar som en infektion-förstärkare kan hindra att använda modellen för utvärdering av vissa värd: patogen interaktioner. Man tror att ägarn ger en skyddad brännpunkt tills infektionen är fullt etablerad i lungan. Det är möjligt att leverera ympen i saltlösning snarare än agar att lösa det här problemet, Det bör dock noteras att detta endast kommer att producera infektion med några isolat. För det tredje finns det en brant inlärningskurva krävs för att bli skicklig i tekniken. Proceduren kan vara känslig, i synnerhet i möss. Det är lätt att av misstag placera metallkanyl in i matstrupen, och överdriven kraft kan leda till punktering av antingen matstrupen eller luftstrupen. Noggrann placering av inokulatet är ocksåkrävs eller djur kan antingen inte återhämta sig eller inte i tillräcklig utsträckning smittade. Men med tålamod och uthållighet, kan man bli mycket skicklig och utföra tekniken snabbt, smidigt och exakt.
Genom att ta bort kravet på neutropeni, ökar robusthet och reproducerbarhet, vilket gör att utredarna att studera flera patogener och isolat, förbättra flexibiliteten i experimentell design och ger en utmanande infektion för att karakterisera farmakodynamik för lunginflammation, tillägger denna immunlunginfektionsmodell betydande värde antibiotikumet upptäckten gemenskap. Ökad användning av denna modell med ytterligare utredare kommer att bidra till att ge den nödvändiga benchmarking för att få mer utbredd acceptans och fortsätta att ge stöd information lämplig tolkning.
Disclosures
Författarna är alla avlönade anställda av GlaxoSmithKline Pharmaceuticals och egna aktier i lager inom företaget.
Acknowledgments
JH vill erkänna och tacka mentor, vän och tidigare chef Valerie Berry för först lära oss denna modell; och Gary Woodnutt, som lärde oss grunderna för och inspirerat vårt engagemang för området antibakteriella PK / PD. Alla författare vill tacka David Payne för hans stöd och uppskattning för vår vetenskap. Vi vill tacka för vår tidigare in vivo mikrobiologi kolleger som har bidragit till den mängd data som genereras med hjälp av dessa metoder, särskilt Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni Page och Nerissa Simon. Slutligen, vårt tack till våra in vitro mikrobiologi kolleger för deras hjälp, särskilt för att tillhandahålla alla MIC vi begär (Lynn McCloskey, Josh West och Sharon min); och för vår klinisk mikrobiologi team som ger expertråd och stöd (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman och Deborah Butler).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
| Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
| BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
| BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
| Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
| 0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
| Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
| 30 mL free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100 mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
| Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
| 90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
| 1 mL TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| Animal feeding needle - straight 20 x 3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
| Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand - Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
| 75 TN 5.0 µL syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
| Pyrex tube, culture 25x150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
| 70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
| Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
| Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
| Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
| Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |
References
- Eagle, H., Fleischman, R., Levy, M. Continuous' vs. 'discontinuous' therapy with penicillin: the effect of the interval between injections on therapeutic efficacy. N Engl J Med. 248 (12), 481-488 (1953).
- Eagle, H., Fleischman, R., Musselman, A. D. The bactericidal action of penicillin in vivo: the participation of the host, and the slow recovery of the surviving organisms. Ann Intern Med. 33 (3), 544-571 (1950).
- Vogelman, B., et al. Correlation of antimicrobial pharmacokinetic parameters with therapeutic efficacy in an animal model. J Infect Dis. 158 (4), 831-847 (1988).
- Craig, W. A. Pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters: rationale for antibacterial dosing of mice and men. Clin Infect Dis. 26 (1), 1-12 (1998).
- Ambrose, P. G., et al. Pharmacokinetics-pharmacodynamics of antimicrobial therapy: it's not just for mice anymore. Clin Infect Dis. 44 (1), 79-86 (2007).
- Ambrose, P. G., Bhavnani, S. M., Owens, R. C. Clinical pharmacodynamics of quinolones. Infect Dis Clin North Am. 17 (3), 529-543 (2003).
- Andes, D. Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of antimicrobials in the therapy of respiratory tract infections. Curr Opin Inf Dis. 14 (2), 165-172 (2001).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).
- Antibiotics in laboratory medicine, 5th edition. Chapter 15: Evaluation of antimicrobials in experimental animal infections. Lorian, V. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2005).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiol Rev. 37 (2), 130-155 (2013).
- Nuermberger, E. Murine models of pneumococcal pneumonia and their applicability to the study of tissue-directed antimicrobials. Pharmacotherapy. 25 (12 Pt 2), 134S-139S (2005).
- Mehrad, B., Standiford, T. J. Use of animal models in the study of inflammatory mediators of pneumonia. ILAR J. 40 (4), 167-174 (1999).
- De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Smith, G. A simple non-surgical method of intrabronchial instillation for the establishment of respiratory infections in the rat. Lab Anim. 25 (1), 46-49 (1991).
- Berry, V., Ferreira-Cornwell, M. C., Singley, C., Woodnutt, G. Development of experimental murine infections caused by H. influenzae and H. parainfluenzae. Clin Microbiol Infect. 7 (S1), 322 (2001).
- Miles, T. J., et al. Novel cyclohexyl-amides as potent antibacterials targeting bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 21 (24), 7483-7488 (2011).
- Miles, T. J., et al. Novel tricyclics (e.g. GSK945237) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 26 (10), 2464-2469 (2016).
- Hoover, J., et al. Pharmacokinetics/pharmacodynamics of peptide deformylase inhibitor GSK1322322 against Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Staphylococcus aureus in rodent models of infection. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), 180-189 (2016).
- Berry, V., Hoover, J., Singley, C., Woodnutt, G. Comparative bacteriological efficacy of pharmacokinetically enhanced amoxicillin-clavulanate against Streptococcus pneumoniae with elevated amoxicillin MICs and Haemophilus influenzae. Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 908-915 (2005).
- Czock, D., Markert, C., Hartman, B., Keller, F. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of antimicrobial drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5 (5), 475-487 (2009).
- Drusano, G. L., Fregeau, C., Liu, W., Brown, D. L., Louie, A. Impact of burden on granulocyte clearance of bacteria in a mouse thigh infection model. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4368-4372 (2010).
- Miles, T. J., et al. Novel hydroxyl tricyclics (e.g. GSK966587) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 23 (19), 5437-5441 (2013).
- Hunt, E. Pleuromutilin antibiotics. Drugs Future. 25 (11), 1163-1168 (2000).
- Jin, Q., et al. Novel LpxC inhibitors with broad-spectrum gram-negative activity. Proceedings of the 44th National Organic Chemistry Symposium.. College Park, MD, , Abstract T-31 (2015).
- Singley, C., Page, R., Hoover, J., Elefante, P., DeMarsh, P. Efficacy of a LRS inhibitor GSK2251052 against Enterobacteriaceae isolates using a computer-controlled infusion system to recreate human PK profiles in rats. Clin Microbiol Infect. 17 (S4), S429-S430 (2011).
- Berry, V., et al. Comparative in vivo activity of gemifloxacin in a rat model of respiratory tract infection. J Antimicrob Chemother. 45 (S1), 79-85 (2000).
- Tsuji, M., et al. S-649266, a Novel Siderophore Cephalosporin: Efficacy against Klebsiella pneumoniae producing NDM-1 or KPC in rat lung infection model with recreated humanized exposure profile of 2 gram dose with 1 hour and 3 hours infusion. Open Forum Infect Dis. 1 (S1), S106-S107 (2014).
- Tsuji, M., et al. Use of Iron Depleted Mueller Hinton Broth (IDMHB) for microdilution testing of S-649266, a novel siderophore cephalosporin. 26th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Amsterdam, Netherlands, , Abstract P0808 (2016).
- Singley, C., Hoover, J., DeMarsh, P. J., Elefante, P., Zalacain, M. Efficacy of PDF Inhibitor GSK1322322 Against Abscess Infections Caused by MRSA Using a Computer-Controlled Infusion System to Recreate Human PK Profiles in Rats. Proceedings of the 60th Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Boston, MA, , Abstract F1-2114 (2010).
- Hoover, J., Mininger, C., Rittenhouse, S. GSK2251052, a novel LeuRS inhibitor, is effective against multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa in a mouse pneumonia model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract B-1308 (2012).
- Hoover, J., Mininger, C., Novick, S., Rittenhouse, S. Efficacy of GSK2140944 against Streptococcus pneumoniae in a non-neutropenic mouse lung infection model. Proceedings of the 53rd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Denver, CO, , Abstract A-014 (2013).
- Hoover, J. L., et al. Selection of a lung infection model to predict efficacy in community-acquired pneumonia (CAP) caused by S. pneumoniae (SP). Proceedings of the 47th Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, Illinois, , Abstract A-17 (2007).
- Drusano, G. L., et al. Saturability of granulocyte kill of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of pneumonia. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2693-2695 (2011).
- Peric, M., Browne, F. A., Jacobs, M. R., Applebaum, P. C. Activity of nine oral agents against gram-positive and gram-negative bacteria encountered in community-acquired infections: use of pharmacokinetic/pharmacodynamic breakpoints in the comparative assessment of beta-lactam and macrolide antimicrobial agents. Clin Ther. 25 (1), 169-177 (2003).
- Calbo, E., Garau, J. Application of pharmacokinetics and pharmacodynamics to antimicrobial therapy of community-acquired respiratory tract infections. Respiration. 72 (6), 561-571 (2005).
- Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2140944 against Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 54th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Washington, DC, , Abstract A-680 (2014).
- Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1270 (2012).
- Andes, D. R., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli using data from a neutropenic murine-pneumonia infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1271 (2012).
