Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

رسم خريطة الموقع ملزم لأبتمر على ATP عن طريق الميكروسكيل Thermophoresis

Published: January 7, 2017 doi: 10.3791/55070
Automatic Translation
1, 1
12bind GmbH

Introduction

التفاعل بين الجزيئات هو أساس الطبيعة. ومن هنا، والعلماء في العديد من مجالات البحوث الأساسية والتطبيقية محاولة لفهم المبادئ الأساسية للتفاعلات الجزيئية من أنواع مختلفة. الميكروسكيل Thermophoresis (MST) تمكن العلماء من أداء ودقيقة، وتوصيف سريع، ومراقبة الجودة فعالة من حيث التكلفة من التفاعلات الجزيئية في الحل، مع حرية اختيار المخازن. وهناك بالفعل أكثر من 1000 المنشورات باستخدام MST، اعتبارا من عام 2016 وحده، واصفا أنواع مختلفة من التحليلات، بما في ذلك عروض مكتبة، ملزمة التصديقات الحدث، فحوصات المنافسة، والتجارب مع شركاء ملزم متعددة 1-8. بشكل عام، يسمح MST دراسة المعلمات ملزمة الكلاسيكية، مثل تقارب ملزمة (بعد الظهر لملم)، رياضيات الكيمياء، والديناميكا الحرارية، من أي نوع من التفاعل الجزيئي. وهناك ميزة كبيرة من MST هي القدرة على دراسة الأحداث ملزمة مستقلة عن حجم شركاء التفاعل. حتى شالالتفاعلات lenging بين الأبتامرات الحمض النووي صغيرة (15-30 الإقليم الشمالي) وأهداف مثل الجزيئات الصغيرة، والمخدرات، والمضادات الحيوية، أو الأيض ويمكن قياس.

التكنولوجيات الحالية للدولة من بين الفن لتوصيف التفاعلات أبتمر المستهدفة هي إما مختبر مكثفة ومعقدة للغاية أو تفشل في تحديد-أبتمر صغيرة جزيء التفاعلات 9،10. السطح بلازمون الرنين (SPR) المستندة إلى فحوصات 11،12 والنهج المسعرية حقا خالية من التسمية، مثل متساوي الكالوري المعايرة (ITC) 13-15، شطف isocratic 16، التوازن فاي ltration 17،18، في خط التحقيق 19، gel- تحول المقايسات، stopped- آه فلوريدا فلوريدا uorescence الطيفي 20،21، مضان تباين (FA) 22،23، واحد جزيء فلوريدا uorescence التصوير 24،25، والحيوية طبقة التداخل (BLI) 26 هي أيضا إما غير دقيق أو غير متوافق مع جزيء صغير أبتمر التفاعلات. principa الآخرينقضايا لتر من هذه الأساليب هي حساسية منخفضة، وارتفاع استهلاك عينة، الشلل، والقيود النقل الجماعي على الأسطح، و / أو قيود العازلة. فقط عدد قليل من هذه التقنيات توفر ضوابط متكاملة لتجميع وامتصاص الآثار.

يمثل MST أداة قوية للعلماء للتغلب على هذا القيد لدراسة التفاعلات بين الأبتامرات والجزيئات الصغيرة 27-29، فضلا عن أهداف أخرى مثل البروتينات 30-33. وتعتمد هذه التقنية على حركة الجزيئات من خلال تدرجات درجة الحرارة. هذه الحركة موجهة، ودعا "thermophoresis،" تعتمد على حجم وتوجيه التهم وقذيفة الماء من جزيء 34،35. الربط ليجند للجزيء ستغير مباشرة واحدة على الأقل من هذه المعايير، مما أدى إلى التنقل thermophoretic تغييرها. بروابط مع أحجام صغيرة قد لا يكون لها تأثير كبير من حيث حجم التغيير من غير منضم إلى دولة منضمة، ولكنها يمكن أن يكون الدكتور آثار amatic على قذيفة الماء و / أو تهمة. التغييرات في حركة thermophoretic من جزيئات بعد التفاعل مع الشريك ملزم تمكن الكمي من المعلمات ملزمة الأساسية 2،7،34،36،37.

كما هو مبين في الشكل 1A، ويتكون الجهاز MST ليزر الأشعة تحت الحمراء التي تركز على العينة داخل الشعيرات الدموية الزجاج باستخدام نفس البصريات، وللكشف عن مضان. يمكن رصد حركة thermophoretic من البروتينات عن طريق uorescence فلوريدا لا يتجزأ من tryptophans 6 أو تفاعل شريك 3،8 fluorescently المسمى في حين أن الليزر يؤسس التدرج في درجة الحرارة (ΔT من 2-6 درجة مئوية). الفرق في درجة الحرارة مما أدى إلى الفضاء، ΔT، يؤدي إلى نضوب أو تراكم الجزيئات في مجال درجات الحرارة المرتفعة، والتي يمكن قياسها كميا بواسطة سوريه coef فاي cient (S T):

ز "/>

ج يمثل الساخنة التركيز في منطقة ساخنة، وج البرد هو تركيز في المنطقة الباردة الأولية.

كما هو مبين في الشكل 1B، نموذجية MST نتائج التجربة في ملف تعريف حركة MST (الوقت أثر)، ويتألف من المراحل المختلفة، والتي يمكن أن تكون مفصولة الجداول الزمنية الخاصة بكل منها. يتم قياس مضان الأولي في أول 5 ثوان في غياب التدرج في درجة الحرارة لتحديد مضان بدءا دقيقة وللتحقق ل photobleaching أو photoenhancement. الوثب درجة الحرارة (T-السريع) يمثل المرحلة التي التغييرات مضان قبل حركة thermophoretic. هذا الانخفاض الأولي في مضان يعتمد على التغييرات التي تعتمد على الحرارة من فلوريدا uorophore العائد الكم. يتبع مرحلة thermophoresis، التي ينخفض ​​مضان (أو زيادة) نتيجة لحركة thermophoretic من الجزيئات حتى توزيع ثابتة للدولة يتم التوصل.ويمكن ملاحظة أن TJump العكس ونشر الظهر يصاحب ذلك من الجزيئات uorescent فلوريدا كما هو مبين في الشكل 1B بعد يتم فيها تشغيل الليزر قبالة. من أجل الوصول إلى معايير ملزمة الأساسية، ويتم تحليل نسب المولي مختلفة من شركاء التفاعل ومقارنة. عادة، يتم دراسة 16 نسب مختلفة في تجربة MST واحد، في حين يتم الاحتفاظ جزيء مرئية بصري مستمر ويتم توفيره مع كمية متزايدة من يجند الخالي من الملصقات. التفاعل بين الشركاء ملزم اثنين يؤدي الى تغييرات في thermophoresis، وبالتالي في uorescence فلوريدا تطبيع، F القاعدة، والذي يحسب على النحو التالي:

معادلة

F الساخنة والباردة F تمثل متوسط كثافة uorescence فلوريدا في دي فاي نقطة زمنية نيد من آثار MST. الانتماءات الملزمة (ك د أو EC 50 القيم) ويمكن حساب من المنحنياتالبريد المناسب (الشكل 1C).

وعموما، MST هو أداة قوية لدراسة التفاعلات الجزيئية من أي نوع. تقدم هذه المخطوطة بروتوكول لوصف التفاعل تحديا بين ثلاثي صغيرة جزيء الفوسفات (ATP؛ 0.5 كيلو دالتون) و25 الإقليم الشمالي القصير ssDNA أبتمر DH25.42 (7.9 كيلو دالتون). على مدى المخطوطة، يتم تعيين موقع ملزم للأبتمر على جزيء ATP وصولا الى مجموعة الأدينين من لاعبي التنس المحترفين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المخزون العمل أبتمر

  1. اتبع إرشادات الشركة المصنعة وحل النوكليوتيد (5 Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3، سلسلة من مرجع 18) في الماء لتصل إلى تركيز النهائي 100 ميكرومتر.
  2. إعداد الحل أبتمر العمل التي تمييع الأسهم النوكليوتيد إلى 200 نيوتن متر مع العازلة ملزمة (20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.6، 300 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي MgCl 2، 0.01٪ Tween20).
  3. احتضان الخليط لمدة 2 دقيقة عند 90 درجة مئوية، والسماح للعينة يبرد على الفور إلى أسفل على الجليد، واستخدام العينة في درجة حرارة الغرفة.

2. إعداد والتخفيف سلسلة يجند

  1. لكل يجند (أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، ثنائي فسفات الأدينوزين (ADP)، أحادي فسفات الأدينوزين (AMP)، الأدينين، غوانوزين ثلاثي الفوسفات (GTP)، السيتوزين ثلاثي الفوسفات (CTP)، deoxyadenosine ثلاثي الفوسفات (dATP)، وميثيونين S-adenosyl (SAM) و 10 ملي الأسهم لكل منهما)، إعداد diluti مسلسل 16 خطوةعلى في 200 ميكرولتر أنابيب رد فعل الصغيرة.
    ملاحظة: الطرد المركزي من أسهم يجند لمدة 5 دقائق في 14000 x ج قد تساعد على إزالة الركام. ، ينصح انخفاض حجم منخفضة أنابيب رد فعل ملزم لتجنب امتصاص الجزيئات على الجدران أنبوب.
  2. بدء بأقصى تركيز لا يقل عن 50 مرات أعلى من النسب المقدرة والحد من تركيز يجند بنسبة 50٪ في كل خطوة التخفيف.
    ملاحظة: أداة تركيز مكتشف في تنفيذ البرامج السيطرة تحاكي ربط البيانات وتساعد في العثور على الحق في مجموعة تركيز لسلسلة التخفيف.
  3. ملء 20 ميكرولتر من الأسهم يجند (10 ملم) في أنبوب 1. إضافة 10 ميكرولتر من أبتمر العازلة ملزمة في أنابيب رد فعل الصغرى 2-16.
  4. نقل 10 ميكرولتر من أنبوب 1 إلى 2 أنبوب وتخلط بشكل صحيح من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. نقل 10 ميكرولتر إلى أنبوب التالي وكرر هذا التخفيف لأنابيب المتبقية.
  5. تجاهل الزيادة 10 ميكرولتر من الأنبوب الماضي. تجنب أي بuffer آثار التخفيف. يجب أن يكون المخزن المؤقت في أنبوب 1 وفي أنابيب 2-16 متطابقة.

3. إعداد مزيج رد الفعل النهائي

  1. إعداد ردود الفعل ملزمة الفردية مع حجم 20 ميكرولتر (10 ميكرولتر من أبتمر العمل الحل + 10 ميكرولتر من التخفيف يجند المعنية) للحد من الأخطاء pipetting ل. وبلغ حجم التداول ميكرولتر 4 فقط هو صوف فاي cient إلى الفرنسيسكان ليرة لبنانية الشعرية.
  2. إضافة 10 ميكرولتر من محلول العمل 200 نانومتر أبتمر إلى 10 ميكرولتر من كل تخفيف يجند وتخلط بشكل صحيح من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
  3. احتضان هذه العينات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وفاي ليرة لبنانية العينات في الشعيرات الدموية القياسية عن طريق غمس الشعيرات الدموية في العينة. قد تكون أوقات أطول الحضانة اللازمة لبعض التفاعلات. ومع ذلك، 5 دقائق كافية بالنسبة لمعظم. المس الشعيرات الدموية فقط على الجانبين، وليس على الجزء الأوسط، حيث سيتم اتخاذ القياس البصرية.
  4. وضع الشعيرات الدموية على عشرالبريد علبة الشعرية وبدء تشغيل الجهاز MST.

4. بدء تشغيل جهاز MST

ملاحظة: يوفر جهاز اثنين من حزم البرامج المثبتة مسبقا، و '' السيطرة "برنامج لإعداد فني من الظروف التجريبية و '' تحليل" برنامج لتفسير البيانات المنتجة.

  1. قبل وضع علبة الشعرية في الجهاز MST، بدء برنامج حاسوبي لمراقبة وضبط درجة الحرارة المطلوبة الشاملة عن طريق اختيار '' تمكين اليدوية التحكم في درجة الحرارة "في" "التحكم في درجة الحرارة" القائمة المنسدلة. ضبط درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية في هذا الطريق.
    ملاحظة: وثائق MST يمكن أن يكون 22-45 درجة مئوية التحكم في درجة حرارته.
  2. الانتظار لدرجة الحرارة للوصول إلى المستوى المتوقع ومن ثم وضع علبة الشعرية في الجهاز MST.
  3. تعيين القناة أدى إلى '' أحمر "لالأصباغ Cy5 وضبط الصمام السلطة لكسب فلوريدا uorescencإشارة (ه) من 300 إلى 1000 وحدة مضان في الجهاز MST مع جهاز استشعار قياسية. يستخدم 25٪ من الطاقة الصمام في هذه الدراسة.
    ملاحظة: ينصح 6000 إلى 18،000 وحدة مضان لMST مع جهاز استشعار عالية الحساسية.

5. شعري المسح الضوئي

  1. إجراء مسح الشعرية للتحقق جوانب نوعية مختلفة من العينة عن طريق اختيار موقف شعري على برنامج "السيطرة" والنقر على "بدء المسح الضوئي كاب" قبل البدء في قياس MST.
  2. تفقد مسح شعري لمضان تعزيز / تبريد والآثار العالقة (قمم على شكل حرف U أو بالارض) في البرنامج.
    ملاحظة: مزيد من التفاصيل حول الكشف والتعامل مع مضان والآثار العالقة يمكن العثور عليها في المناقشة.

6. قياس MST

ملاحظة: قبل البدء في قياس MST، للتأكد من استبعاد التمسك الآثار، وتعزيز / التبريد الآثار، أوأخطاء pipetting ل، والتأكد من أن مسح شعري يشير إلى أن إشارة فلوريدا uorescence هي SUF فاي cient. لمزيد من التفاصيل، انظر المناقشة.

  1. تعيين تركيزات يجند من سلسلة تخفيف لموقف الشعرية المعنية في مراقبة البرامج "" النظر في خطوة التخفيف من خلط أبتمر ويجند. (1: 1).
  2. أدخل أعلى تركيز من يجند (5 ملم) لالشعرية # 1، حدد نوع تخفيف الصحيح (هنا، 1: 1)، انقر على التركيز الأقصى، واستخدام وظيفة السحب لتعيين تركيزات المتبقية في الشعيرات الدموية # 2- تلقائيا 16. أقل تركيز هو 152.6 نيوتن متر.
  3. أدخل تركيز أبتمر uorescent فلوريدا (هنا، و 100 نيوتن متر) في القسم الخاص بكل من برامج التحكم.
  4. استخدام الإعدادات الافتراضية، التي كشف عن uorescence فلوريدا لمدة 5 ثانية، تسجيل MST لمدة 30 ثانية، وتسجيل مضان ل 5 ثانية مزيد من بعد تثبيط ر الليزر س مراقبة انتشار الخلفي من الجزيئات.
  5. ضبط قوة الليزر إلى 20٪ في قسم منها من برنامج التحكم.
    ملاحظة: من أجل الحصول على أفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء ولتجنب الآثار غير محددة، فمن المستحسن قوة الليزر من 20-40٪. في حالات معينة، قد تكون هناك حاجة إلى قوة الليزر أعلى للحصول على فصل جيد من الجزيئات غير منضم وملزمة.
  6. حفظ التجربة بعد اختيار مجلد الوجهة والبدء في قياس MST عن طريق الضغط على زر '' قياس بدء MST ".
    ملاحظة: سيتم إنشاء الملف .ntp في مجلد الوجهة. باستخدام هذا الإعداد، وقياس واحد يستمر 10-15 دقيقة.
  7. كرر الإجراء التجريبي على الأقل مرتين لتحديد أكثر دقة للقيمة EC 50.
    ملاحظة: من أجل اختبار استنساخ التقني، ونفس الشعيرات الدموية يمكن فحصها عدة مرات (تكرار التقنية).

7. تحليل البيانات MST

الإقليم الشمالي "> ملاحظة: برامج التحليل يمكن تحليل البيانات على فلوريدا ذ خلال قياس وتحليل البرامج المؤامرات آثار الساعة MST والتغيرات في تطبيع فلوريدا uorescence (F القاعدة) في مقابل تركيز يجند 37.

  1. بدء تشغيل برامج التحليل MST (تحليل MO.Affinity) وتحميل الملف .ntp من المجلد الوجهة. حدد "MST" كنوع التحليل في قائمة اختيار البيانات.
    ملاحظة: في حالة الآثار مضان تعتمد على يجند، مضان الأولي ويمكن اختيار لتحليلها.
  2. إضافة على المدى التقنية والبيولوجية منها (ق) لتحليل جديد عن طريق السحب والإفلات أو عن طريق الضغط على زر "+" أدناه على المدى التجريبية منها.
  3. اضغط على زر المعلومات الواردة أدناه على المدى التجريبية منها الحصول على معلومات عن خصائص التجربة، آثار MST، مسح شعري، شكل شعري، مضان الأولي، ومعدل التبييض.
    ملاحظة: هذه البيانات الخام يمكن آللذلك يتعين تفتيشها في خطوات لاحقة من التحليل.
  4. تفقد البصر آثار MST لتجميع وترسيب الآثار وظاهرة للعيان كما المطبات والمسامير.
    ملاحظة: للحصول على مزيد من المعلومات حول الكشف والتعامل مع آثار التجميع، قراءة المناقشة.
  5. تفقد البصر الفحص الشعرية والشعرية شكل غطاء لآثار الامتصاص وظاهرة للعيان كما قمم بالارض أو على شكل حرف U. تفقد البصر الفحص الشعرية ومضان الأولي للآثار مضان. تفقد البصر معدل تبيض ل photobleaching الآثار.
  6. التبديل إلى وضع الجرعة والاستجابة وتغيير إعداد تحليل لوضع "الخبير" عن طريق الضغط على زر منها. حدد "تي السريع" كما استراتيجية التقييم MST.
  7. حدد "هيل" نموذجا للtting منحنى فاي. سيتم تلقائيا تحسب المعلمات ملزم. تطبيع البيانات عن طريق اختيار نوع منها التطبيع في القائمة "مقارنة النتائج". تصديرالبيانات إما .xls أو قوات الدفاع الشعبي.
    ملاحظة: يلخص الجدول أدناه الرسم البياني ملزم المعلمات ملزمة حساب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذه الدراسة، تم تطبيق MST لتميز موقع ملزم للأبتمر DH25.42 الحمض النووي 18 على ATP. وعلى النقيض من الدراسات الأخرى التي تميز تفاعل ATP أو ATP-محاكاة جزيئات صغيرة مع البروتينات وصفت بشكل عشوائي مع واحد أو أكثر من fluorophores 38-40، وتشمل هذه الدراسة نسخة المسمى من أبتمر 7.9 كيلو دالتون ssDNA مع واحد جزيء Cy5 في نهاية 5' . المشتقات ATP مختلفة والجزيئات ذات الصلة، وجميع المختلفة من ATP في مناصب مختلفة استخدمت، لرسم خريطة للموقع ملزم على جزيء ATP. تم إعداد سلسلة تخفيف (في 16 خطوات، والحد من تركيز يجند بنسبة 50٪ لكل منهما) من بروابط مختلفة ومختلطة مع كمية ثابتة من أبتمر Cy5 المسمى. وقد تم تحليل العينات في الشعيرات الدموية قياسية عند 25٪ الصمام وقوة الليزر 20٪. سجلت ملامح حركة (MST آثار الزمن) وحدات مضان، والمستمدة من المرحلة T-السريع، ورسم مقابل concentr يجندأوجه (قارن الشكل 1C). تم إجراء منحنى المناسب تطبيق المعادلة هيل، مما أدى إلى EC 50 القيم. في 5 يكرر مستقلة البيولوجية (4 مشغلي مختلفة، 2 الأسهم أبتمر مختلفة، 2 مخزون ATP مختلفة)، ويظهر تفاعل ATP-أبتمر السعة ملزمة السلبية بين 6 و 13 وحدة ومتوسط القيمة EC 50 من 52.3 ± 5.0 ميكرومتر (الشكل 2A ). أشرطة الخطأ في الرسوم البيانية ملزمة و"±" الواردة في البيانات تقارب تمثل الانحراف المعياري من 5 يكرر البيولوجية (5 قياسات مستقلة في شعري مختلف). وكانت الانتماءات ذكرت سابقا للتفاعل أبتمر DH25.42 مع [2،8،5'- 3 H] -adenosine والاغاروز ATP مماثلة. وكان كميا تفاعل الأدينوزين رديولبلد مع أبتمر من قبل مرشح فحص الطرد المركزي، وكان مصمما على تقارب (K د) من 6 ± 3 ميكرومتر. تجارب شطف Isocratic مع IMMOBIL ATPأوتوماتيكية لالاغاروز أدى إلى تقارب (K د) من 13 ميكرومتر 18،41.

من أجل عالم أفضل مقارنة جنبا إلى جنب، ويمكن تطبيع البيانات إلى جزء من جزيئات المعقد (جزء ملزمة، FB) باستخدام المعادلة التالية:
معادلة
حيث قيمة (ج) هي القيمة MST قياس للتركيز ج، مجانا هي القيمة MST للدولة غير منضم (أقل تركيز)، والمعقد هو القيمة MST للدولة ملزمة بالكامل (الشكل 2B). هذا التطبيع هو المثالي لمقارنة نتائج بروابط مختلفة في رسم بياني واحد، كما هو مبين في الشكل 2C. والكشف عن nities AF فاي من ADP (63.6 ± 5.9 ميكرومتر في التكرارات البيولوجية)، AMP (91.6 ± 9.1 ميكرومتر في التكرارات البيولوجية)، وسام (44.4 ± 3.2 ميكرومتر في التكرارات البيولوجية)، والتي تختلف من ATP في نوmber من مجموعة فوسفات، يعني أن هذا الموقف لا يوجد لديه أو قاصر فقط في uence FL على سلوك ملزمة للأبتمر (الشكل 2C و D). ويمكن أيضا أن يتم استبعاد مجموعة OH في الكربون C2 من الريبوز للاعبي التنس المحترفين من كونه موقع ملزم كبير، وكان لا بد dATP أيضا أبتمر مع انخفاض طفيف NITY فاي أف (64.4 ± 6.1 ميكرومتر في التكرارات البيولوجية). تغيير مجموعة البيورين للاعبي التنس المحترفين إلى مجموعة بيريميدين أدى CTP في غير ملزم للأبتمر، مما يدل على أهمية هذه المجموعة للتفاعل. وأبتمر بد أن الأدينين مع تقارب من 141.7 ± 9.4 ميكرومتر (في مكررة البيولوجية)، وتبين أن موقع ملزم يجب أن يكون في هذا الجزء من جزيء ATP. جزيئات البيورين GTP وATP تختلف في المنطقة المظللة الخضراء ممثلة في الشكل 2D، وهو ما يمثل الموقع الرئيسي ملزم للأبتمر على ATP. دراسة أخرى تستخدم التجارب شطف غير الكمية مع المشتقات ATP مختلفة لأزل على أبتمر رديولبلد من ATP الاغاروز، والتي أظهرت نتائج مماثلة لهذه الدراسة MST 18.

الشكل 2
الشكل 1: الميكروسكيل Thermophoresis. (A) ويظهر الإعداد الفني للتكنولوجيا MST. وتركز البصريات في وسط الزجاج الشعيرات الدموية، وبالتالي الكشف عن إشارة مضان من جزيء وضوحا بصريا. ويستخدم ليزر الأشعة تحت الحمراء لإنشاء التدرج في درجة الحرارة في إطار مراقبة النظام البصري. التغيرات في مضان يمكن استخدامها لرصد حركة thermophoretic من الجزيئات في الحل (ب) MST الوقت التتبع الحركة المؤيدة فاي جنيه من الجزيئات في التدرج في درجة الحرارة. يتم قياس مضان الأولي لمدة 5 ثانية في حين أن الليزر هو خارج. التحول على الليزر يولد التدرج في درجة الحرارة. بعد فوري تي الانتقال السريع لصهاسي، الذي صبغ uorescent فل يقل العائد اشارة على تحريض الحرارة، وحركة thermophoretic تجري ورصدت لمدة 30 ثانية. بعد تشغيل الليزر قبالة، وجزيئات منتشر الظهر. (C) نتائج تجربة MST النموذجية: (يسار) 16 الشعيرات الدموية التي تحتوي على نفس تركيز جزيء فلوري وزيادة تركيز يجند الخالي من الملصقات. يتم تسجيل آثار الساعة MST وتطبيع مضان الأولي. (يمين) وuorescence فلوريدا تطبيع. يتم رسم الفرق بين F البارد والساخن F ضد تركيز يجند. وتناسب منحنى من هذه العوائد بيانات المعلمات، مثل NITY فاي أف ملزم ملزم. إعادة طباعة بإذن من السيفير، طرق 28؛ ترخيص رقم 3890230800113. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تحليل البيانات MST. (A) تصحيح خط الأساس فلوريدا تطبيع uorescence ΔF القاعدة (‰)، والمستمدة من إشارة MST TJump، يتم رسم مقابل تركيز ATP (في ميكرومتر). تم تطبيق المعادلة هيل (EC 50) لمنحنى المناسب. تمثل أشرطة الخطأ والانحراف المعياري من خمسة يكرر البيولوجية. وتقدم (B) مؤامرة محددة جزء من البيانات الواردة في A. تم تطبيع مجموعات البيانات منها إلى جزء ملزمة، ومتوسط هذه البيانات تطبيع في الرسم البياني ملزم. وتشير أشرطة الخطأ والانحراف المعياري من 5 يكرر البيولوجية. (C) ويبين الرسم البياني محددة جزء مقارنة كمية (هيل صالح) من بروابط مختلفة إلى أبتمر. تمثل أشرطة الخطأ وديفيا القياسيةنشوئها اثنين يكرر البيولوجية. (D) تجليد nities فاي AF (EC 50) من بروابط مختلفة إلى أبتمر. وتشير المنطقة المظللة الخضراء موقع ملزم للأبتمر على مجموعة الأدينين اعبي التنس المحترفين. تم تعديل هذا الرقم من إلسفير، طرق 28؛ وأعادوا تحليل رقم الترخيص 3890230800113. مجموعات بيانات من دراسة سابقة وتوسعت في هذه الدراسة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: الأمثل فحص للتجارب MST. (A) امتصاص البروتين والآثار العالقة يمكن الكشف عنها في الفحص الشعرية. الأشكال ذروة غير النظامية، مثل قمم بالارض أو على شكل حرف U، تشير إلى التصاق المواد العينة إلى سطح الزجاج. Cيمكن شنقا نوع الشعرية (قياسي، وقسط، أو مسعور) منع امتصاص جزيئات، مما أدى إلى ذروة شكل منتظم. (ب) آثار الساعة MST أيضا بمثابة مراقبة الجودة، ومنذ المجاميع يمكن أن يتم الكشف عن وجود مثل المطبات والمسامير. الظروف التجريبية يمكن أن يكون الأمثل من خلال تحسين ذوبان جزيئات (على سبيل المثال، بما في ذلك المنظفات مثل Pluronic F-127 أو متفاوتة قيم درجة الحموضة أو تركيز الملح). الطرد المركزي قد تساعد على إزالة الركام الأكبر حجما. لضمان جودة البيانات المثلى، يجب أن آثار الساعة MST تشبه المثال المذكور. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مراقبة الجودة:

غير محددة الشائكة / امتصاص مادة العينة على الأسطح، وكذلك آثار التجميع، يكون لها تأثير كبير على نوعية البيانات تقارب. ومع ذلك، سوى عدد قليل من التقنيات للدولة من بين الفن وتوفر خيارات دقيقة وسريعة لرصد وتجنب هذه الآثار. تقدم MST ضوابط الجودة المتكاملة التي تكشف عن وتساعد على التغلب على هذه القضايا، والسماح لتحسين تدريجي من الإعداد التقني. ويمكن استخراج معلومات مهمة عن الشائكة ومضان الآثار من الفحص الشعري والشكل الشعري (الخطوات 5.2 و 7.5)، في حين يمكن رصد تجميع / آثار الأمطار (الخطوة 7.7) في ملامح الحركة. وتمكن هذه الضوابط لالتحسين المستمر لجودة البيانات وتمثل الخطوات الحاسمة في البروتوكول.

الكشف عن الآثار الامتزاز واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:

ويجري الفحص الشعرية في المقام الأول باعتبارها رسائل كتبها هذا المؤلفخطوة للمحاكمة لتحديد موقف من الشعيرات الدموية على حامل صينية عن طريق مسح مضان أكثر من ذلك. وتمثل كل قمة شعري واحد، مما يدل على نقطة البداية لقياس MST. الفحص البصري من ذروة شكل يمكن تحديد امتصاص جزيئات على سطح الزجاج، وهو مراقبة الجودة الأساسية التي يجب أن يؤديها قبل بدء التجربة MST. تراكب شكل شعري يسمح للكشف بسهولة بالارض والأشكال قمة وعرة، أو حتى من قمم التي تشبه U-شكل، مما يدل على الامتزاز / التصاق جزيئات على سطح الزجاج الداخلي للالشعرية (الشكل 3A، لوحة العليا). المغلفة بشكل مختلف أنواع الشعيرات الدموية (قياسي، وقسط، ومسعور) مساعدة لضمان ذوبان والحد الأدنى من امتصاص الجزيئات إلى الشعيرات الدموية. وينبغي اختبار الشعيرات الدموية، لضمان ملاءمتها قبل التجارب ملزمة. المنظفات مثل توين (،005-0،1٪) أو F127 Pluronic (0،01 حتي 0،1٪) أماهذ أيضا منع الآثار الامتزاز غير محددة. الأمثل في هذه المرحلة من التجربة أمر ضروري لجودة البيانات عالية (قارن الشكل 3A، اللوحة السفلى).

الكشف عن آثار مضان واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:

الاختلافات في ذروة ارتفاع الشعيرات الدموية الممسوحة ضوئيا تقدم طبقة أخرى من المعلومات عن خصائص العينة. قد الاختلافات العشوائية في مضان الشعرية، من جهة، يكون راجعا إلى pipetting لأخطاء أو، من ناحية أخرى، تنشأ من المجاميع عينة كبيرة في منطقة المسح الضوئي التي قد تزيد من مضان بشكل كبير. عالية الدقة pipetting لإلزامية لتجنب الآثار التخفيف. خلط جميع الحلول من قبل pipetting صعودا وهبوطا يزيد من دقة أكبر. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الضروري للحفاظ على عازلة ثابت في كل شعري. وتعرض استراتيجيات للتعامل مع آثار تجميع في فقرة لاحقة.

تغييرات منهجية مضان مع increaالغناء تركيز يجند كثيرا ما تشير يجند تعتمد آثار تبريد / تعزيز. ويتم "SD اختبار" للخروج من أجل التمييز الناجم عن ملزمة التغيرات مضان من فقدان مضان غير محددة. هذا الاختبار يرصد كثافة مضان في ظل ظروف تغيير طبيعة. في حالة الآثار مضان تعتمد على يجند، يجب أن تكون كثافة مضان تحت شرط تغيير طبيعة متطابقة، بغض النظر عن تركيز محلول معاير. إذا كان الفرق في كثافة مضان لا تزال موجودة في ظل هذه الظروف، والمواد إما فقدت بسبب امتصاص غير محددة على الجدران أنبوب أو بسبب التجميع والطرد المركزي لاحق.

من أجل أداء SD اختبار، وكل نقل 10 ميكرولتر من أول و 10 ميكرولتر من آخر خطوة يجند التخفيف بعناية لأنبوب الطازجة التي تحتوي على 10 ميكرولتر من 2X SD ميكس (4٪ SDS و 40 ملي DTT). عينات مختلطة والجزيئات التشويه والتحريف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية. بعد عملية الشراءص ملء العينات في الشعيرات الدموية، ويتم قياس كثافة مضان. إذا تم الكشف عن تأثير مضان تعتمد على يجند، يمكن تحليل البيانات مباشرة من المعلومات ملزمة بالضد من التغييرات كثافة مضان.

الكشف عن آثار تجميع واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:

وعرة، متفاوتة آثار الساعة MST تشير تجميع و / أو هطول الأمطار الآثار (الشكل 3B، لوحة العليا). غير الاجمالية مادة العينة يعرض الملف نظيفة وناعمة thermophoretic حركة (الشكل 3B، اللوحة السفلى). الطرد المركزي من مادة العينة قبل استخدامها (5-10 دقيقة في 14000 x ج)، إضافة المنظفات (0،005-0،1٪ توين 20، 0،01-،1٪ Pluronic F-127، أو ما شابه ذلك)، واستخدام BSA ( ينصح> 0.5 ملغ / مل)، أو تغير الظروف العازلة (درجة الحموضة والقوة الأيونية) للحد من آثار تجميع ولتحسين جودة البيانات. من أجل الحصول على بيانات ذات جودة عالية، فإنهأمر ضروري للحد من آثار التجميع.

تحليل البيانات ومنحنى المناسب:

يتم تقسيم الملف الشخصي حركة thermophoretic إلى مراحل مختلفة، والتي يمكن أن تفقد إما بشكل منفصل أو في نفس الوقت. يصف تي الانتقال السريع لهذا التغيير المفاجئ في العائد مضان على التغير في درجة الحرارة، وهو ما يمثل سمة أصلية من fluorophores. مباشرة ملزمة في محيط قريبة من fluorophore أو التشكل التغييرات على ملزمة للغاية تؤثر على T-السريع. يشير أبطأ thermophoresis لحركة الجزيئات في مجال درجات الحرارة، وتقديم معلومات عن الهيكل العام للمجمع تشكيلها. النوع الافتراضي من تحليل البيانات ويستخدم الإعداد "Thermophoresis + T-السريع"، واستغلال هاتين الظاهرتين لتحديد المعايير الملزمة. في حالة مراحل لهما اتجاهين متعاكسين، فمن المستحسن لتحليل مراحل منفصلة. يرجى ملاحظة أن وقت الآثار وأنواع مختلفة من molecقد يؤدي ules الاختلافات في تقارب من thermophoresis وتي السريع. نوع آخر خيار تحليل هو الإعداد اليدوي، والتي تمكن من التحقيق في مناطق معينة من الشخصية الحركة. اضطرابات بسبب التجميع أو الحمل الحراري يمكن استبعاد بهذه الطريقة. من أجل تحسين جودة البيانات، قد يتم تعيين المؤشرات قبل إشارات التجميع. دراسة thermophoresis في وقت مبكر عادة تنتج البيانات مع أقل ضوضاء، منذ الحراري هو عملية تعتمد على الوقت. ينصح هذا الإعداد اليدوي في وقت مبكر للغاية لإجراء التجارب مع قوة الليزر عالية (80٪). عند اختيار الإعداد تحليل البيانات، نموذجين المناسب المتكاملة في برامج التحليل يمكن تطبيقها لتناسب منحنى ملزم. وظيفة صالحة للK د من قانون العمل الجماهيري هي مناسبة ل1: 1 وسائط ملزمة أو متعددة ملزمة المواقع التي تمتلك نفس النسب. يصف مستقلة تركيز التفكك المستمر K د التوازن بين بوالثانية والدولة غير منضم. وبالتالي، يتم قياس تقارب من موقع ملزم ليجند. المفوضية الأوروبية 50 قيمة تعتمد على التركيز المستمدة من المعادلة هيل تمثل الجرعة الفعالة ليجند في نصفها من الجزيئات المسمى هي في ولاية المربوطة. ينبغي تطبيق صالح هيل لمتعددي نماذج ملزمة، لا سيما إذا كانت التعاوني.

تمثل ضوابط متكاملة ذات جودة عالية ميزة واحدة كبيرة من MST خلال تقنيات مثل SPR أو المركز. هذه الأدوات تسمح للالتحسين السريع والسهل من الإعداد الفني لضمان جودة البيانات الأمثل. وبالإضافة إلى قياسات كفاءة في استهلاك الوقت (K د في 15 دقيقة)، والإعداد خالية من الشلل، MST يوفر حرية اختيار مخازن، والسماح تقييم التفاعلات الجزيئية، حتى في لست] والأمصال 5،42،43. يرجع ذلك إلى حقيقة أن thermophoresis الجزيئية يعتمد على حجم وتوجيه التهم وقذيفة الماء من جزيئات، لا توجد قيودفي حجم شركاء التفاعل المقاسة خلال القياسات MST. بالعربية نطاق فاي NITY الديناميكي، من رئيس الوزراء لملم، جنبا إلى جنب مع استهلاك منخفض عينة، ويكمل نقاط القوة في تكنولوجيا MST. ومن الجدير بالذكر أن MST يولد بيانات دقيقة عن المعلمات ملزمة الأساسية، مثل تقارب ملزمة، رياضيات الكيمياء، والديناميكا الحرارية. ومع ذلك، MST لا يسمح لقياس ك على وك قبالة أسعار الفائدة. وبالإضافة إلى ذلك، على المرء أن ينظر أنه بالنسبة لمعظم التجارب MST، يجب ان يضاف الى تعديل الفلورسنت لأحد الشركاء التفاعل. البيانات التي تم إنشاؤها هي في اتفاق جيد مع تقنيات للدولة من بين الفن، مثل SPR ومركز التجارة الدولية 32،43-46. ومع ذلك، فإن هذه البيانات لمراقبة الجودة، والتجارب هي أسرع، وأنها تستهلك أقل من المواد. وعموما، MST يمثل التكنولوجيا متعامد قوية لتقنيات للدولة من بين الفن، مع بعض المزايا الإضافية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

م، وTS هم موظفون من 2bind محدودة، والتي توفر الخدمات التحليلية الفيزيائية الحيوية. يتم دفع رسوم النشر لهذا الفيديو المادة تكفلها 2bind GmbH المزيد.

Acknowledgments

الكتاب ليس لديهم الاعترافات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aptamer binding buffer 20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer IDT, Leuven, Belgium sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-
ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP Sigma Aldrich, Germany  A2383 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
ADP Sigma Aldrich, Germany  A2754 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
AMP Sigma Aldrich, Germany  A2252 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Adenine Sigma Aldrich, Germany  A8626 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
SAM Sigma Aldrich, Germany  A7007 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
dATP Sigma Aldrich, Germany  11934511001 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
CTP Sigma Aldrich, Germany  C1506 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
GTP Sigma Aldrich, Germany  G8877 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Monolith NT.115  NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-G008 Blue/Red Channel
MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-K002
Eppendorf PCR tubes Eppendorf, Germany 30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1 NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2 Synergy Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Linke, P., et al. An Automated Microscale Thermophoresis Screening Approach for Fragment-Based Lead Discovery. J Biomol Screen. 21 (4), 414-421 (2015).
  2. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
  3. Zillner, K., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol Biol. 815, 241-252 (2012).
  4. Zhang, W., Duhr, S., Baaske, P., Laue, E. Microscale thermophoresis for the assessment of nuclear protein-binding affinities. Methods Mol Biol. 1094, 269-276 (2014).
  5. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat Commun. 1, 100 (2010).
  6. Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10656-10659 (2012).
  7. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
  8. Schubert, T., et al. Df31 protein and snoRNAs maintain accessible higher-order structures of chromatin. Mol Cell. 48 (3), 434-444 (2012).
  9. McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
  10. Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-Molecule Binding Aptamers: Selection Strategies, Characterization, and Applications. Front Chem. 4, 14 (2016).
  11. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Anal Chem. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  12. Chang, A. L., McKeague, M., Smolke, C. D. Facile characterization of aptamer kinetic and equilibrium binding properties using surface plasmon resonance. Methods Enzymol. 549, 451-466 (2014).
  13. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  14. Sokoloski, J. E., Dombrowski, S. E., Bevilacqua, P. C. Thermodynamics of ligand binding to a heterogeneous RNA population in the malachite green aptamer. Biochemistry. 51 (1), 565-572 (2012).
  15. Burnouf, D., et al. kinITC: a new method for obtaining joint thermodynamic and kinetic data by isothermal titration calorimetry. J Am Chem Soc. 134 (1), 559-565 (2012).
  16. Mannironi, C., Scerch, C., Fruscoloni, P., Tocchini-Valentini, G. P. Molecular recognition of amino acids by RNA aptamers: the evolution into an L-tyrosine binder of a dopamine-binding RNA motif. RNA. 6 (4), 520-527 (2000).
  17. Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
  18. Huizenga, D. E., Szostak, J. W. A DNA aptamer that binds adenosine and ATP. Biochemistry. 34 (2), 656-665 (1995).
  19. Lee, E. R., Baker, J. L., Weinberg, Z., Sudarsan, N., Breaker, R. R. An allosteric self-splicing ribozyme triggered by a bacterial second messenger. Science. 329 (5993), 845-848 (2010).
  20. Wickiser, J. K., Cheah, M. T., Breaker, R. R., Crothers, D. M. The kinetics of ligand binding by an adenine-sensing riboswitch. Biochemistry. 44 (40), 13404-13414 (2005).
  21. Jucker, F. M., Phillips, R. M., McCallum, S. A., Pardi, A. Role of a heterogeneous free state in the formation of a specific RNA-theophylline complex. Biochemistry. 42 (9), 2560-2567 (2003).
  22. Zhao, Q., Lv, Q., Wang, H. Aptamer fluorescence anisotropy sensors for adenosine triphosphate by comprehensive screening tetramethylrhodamine labeled nucleotides. Biosens Bioelectron. 70, 188-193 (2015).
  23. Zhang, D., et al. A sensitive fluorescence anisotropy method for detection of lead (II) ion by a G-quadruplex-inducible DNA aptamer. Anal Chim Acta. 812, 161-167 (2014).
  24. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule imaging of an in vitro-evolved RNA aptamer reveals homogeneous ligand binding kinetics. J Am Chem Soc. 131 (29), 9866-9867 (2009).
  25. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev Sci Instrum. 81 (8), 083705 (2010).
  26. Zichel, R., Chearwae, W., Pandey, G. S., Golding, B., Sauna, Z. E. Aptamers as a sensitive tool to detect subtle modifications in therapeutic proteins. PLoS One. 7 (2), 31948 (2012).
  27. Baaske, P., Wienken, C. J., Reineck, P., Duhr, S., Braun, D. Optical thermophoresis for quantifying the buffer dependence of aptamer binding. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (12), 2238-2241 (2010).
  28. Entzian, C., Schubert, T. Studying small molecule-aptamer interactions using MicroScale Thermophoresis (MST). Methods. 97, 27-34 (2016).
  29. Valenzano, S., et al. Screening and Identification of DNA Aptamers to Tyramine Using in Vitro Selection and High-Throughput Sequencing. ACS Comb Sci. 18 (6), 302-313 (2016).
  30. Jauset Rubio, M., et al. beta-Conglutin dual aptamers binding distinct aptatopes. Anal Bioanal Chem. 408 (3), 875-884 (2016).
  31. Breitsprecher, D., et al. Aptamer Binding Studies Using MicroScale Thermophoresis. Methods Mol Biol. 1380, 99-111 (2016).
  32. Stoltenburg, R., Schubert, T., Strehlitz, B. In vitro Selection and Interaction Studies of a DNA Aptamer Targeting Protein A. PLoS One. 10 (7), 0134403 (2015).
  33. Kinghorn, A. B., et al. Aptamer Affinity Maturation by Resampling and Microarray Selection. Anal Chem. 88 (14), 6981-6985 (2016).
  34. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (52), 19678-19682 (2006).
  35. Braun, D., Libchaber, A. Trapping of DNA by thermophoretic depletion and convection. Phys Rev Lett. 89 (18), 188103 (2002).
  36. Duhr, S., Arduini, S., Braun, D. Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence. Eur Phys J E Soft Matter. 15 (3), 277-286 (2004).
  37. Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay Drug Dev Technol. 9 (4), 342-353 (2011).
  38. He, K., Dragnea, V., Bauer, C. E. Adenylate Charge Regulates Sensor Kinase CheS3 To Control Cyst Formation in Rhodospirillum centenum. MBio. 6 (3), 00546 (2015).
  39. Brvar, M., et al. Structure-based discovery of substituted 4,5'-bithiazoles as novel DNA gyrase inhibitors. J Med Chem. 55 (14), 6413-6426 (2012).
  40. Pogorelcnik, B., et al. 4,6-Substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as monocyclic catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIalpha targeting the ATP binding site. Bioorg Med Chem. 23 (15), 4218-4229 (2015).
  41. Jhaveri, S., Rajendran, M., Ellington, A. D. In vitro selection of signaling aptamers. Nat Biotechnol. 18 (12), 1293-1297 (2000).
  42. Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. J Vis Exp. (78), (2013).
  43. Ramakrishnan, M., et al. Probing cocaine-antibody interactions in buffer and human serum. PLoS One. 7 (7), 40518 (2012).
  44. Chen, M., et al. Antiviral activity and interaction mechanisms study of novel glucopyranoside derivatives. Bioorg Med Chem Lett. 25 (18), 3840-3844 (2015).
  45. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186 (4,5), 61-67 (2015).
  46. Harazi, A., et al. The Interaction of UDP-N-Acetylglucosamine 2-Epimerase/N-Acetylmannosamine Kinase (GNE) and Alpha-Actinin 2 Is Altered in GNE Myopathy M743T Mutant. Mol Neurobiol. , (2016).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 119، الصغيرة جزيء أبتمر التفاعل والمعلمات ملزم، الميكروسكيل Thermophoresis، تقارب، رياضيات الكيمياء، الديناميكا الحرارية، الأحماض النووية ملزمة، ورسم خرائط موقع ملزم
رسم خريطة الموقع ملزم لأبتمر على ATP عن طريق الميكروسكيل Thermophoresis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Entzian, C., Schubert, T. Mapping… More

Entzian, C., Schubert, T. Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (119), e55070, doi:10.3791/55070 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter