Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kortlægning af bindingssted en aptamer på ATP Brug mikroskala Thermophoresis

Published: January 7, 2017 doi: 10.3791/55070
Automatic Translation
1, 1
12bind GmbH

Introduction

Interaktion mellem molekyler er grundlaget for naturen. Derfor forskere i mange områder af grundforskning og anvendt forskning forsøge at forstå de grundlæggende principper om molekylære interaktioner af forskellig art. Individuel Thermophoresis (MST) gør det muligt for forskere at udføre hurtig, præcis, omkostningseffektiv, og kvalitet-kontrollerede karakterisering af molekylære interaktioner i opløsning, med frit valg af buffere. Der er allerede mere end 1.000 publikationer MST, fra 2016 alene, der beskriver forskellige former for analyser, herunder bibliotekets screeninger, bindende event valideringer, konkurrence analyser og eksperimenter med flere bindende partnere 1-8. Generelt MST tillader studiet af de klassiske bindende parametre, såsom bindingsaffinitet (pM til mM), støkiometri og termodynamik, af enhver form for molekylær interaktion. En stor fordel ved MST er evnen til at studere bindingsbegivenheder uafhængigt af størrelsen af ​​de interaktionspartnere. Selv udfordrende interaktioner mellem små nucleinsyre aptamerer (15-30 nt) og mål såsom små molekyler, lægemidler, antibiotika eller metabolitter kan kvantificeres.

Aktuelle state-of-the-art teknologier til at karakterisere aptamer målgruppen interaktioner er enten lab-intens og meget komplekse eller undlader at kvantificere aptamer-lille molekyle interaktioner 9,10. Surface (SPR) -baserede assays 11,12 og virkelig label-fri kalorimetriske tilgange, såsom Isotermisk Titrering kalorimetri (ITC) 13-15, isokratisk eluering 16, ligevægt fi ltrering 17,18, in-line sondering 19, gel- skift analyser, stopped- fl ow fl uorescence spektroskopi 20,21, fluorescens anisotropi (FA) 22,23, single-molekyle fl uorescence billedbehandling 24,25, og Bio-lags interferometri (BLI) 26 er også enten upræcise eller uforenelig med aptamer-lille molekyle interaktioner. Andre principal spørgsmål af disse metoder er lav følsomhed, højt forbrug prøve, immobilisering, masse begrænsninger transport på overflader, og / eller buffer restriktioner. Kun få af disse teknologier giver integrerede styringer til sammenlægning og adsorption effekter.

MST er et effektivt redskab for forskerne at overvinde denne begrænsning for at undersøge samspillet mellem aptamerer og små molekyler 27-29, samt andre mål, såsom proteiner 30-33. Teknologien bygger på flytning af molekyler gennem temperaturgradienter. Denne rettet bevægelse, kaldet "thermophoresis," afhænger af størrelse, ladning, og hydrering skallen af molekylet 34,35. Bindingen af ​​en ligand til molekylet vil direkte ændre mindst en af ​​disse parametre, hvilket resulterer i en ændret thermophoretic mobilitet. Ligander med små størrelser kan ikke have en betydelig indvirkning i form af størrelse ændring fra den ubundne til den bundne tilstand, men de kan have dr amatic virkninger på hydrering skal og / eller beregning. Ændringerne i thermophoretic bevægelse af molekyler efter interaktioner med bindingspartneren muliggør kvantificering af grundlæggende bindingsparametre 2,7,34,36,37.

Som afbildet i figur 1A, MST anordning består af en infrarød laser fokuseres på prøven inden for de glaskapillarer anvendelse af de samme optikker som for fluorescens detektion. Kan overvåges thermophoretic bevægelse af proteiner via den iboende fl uorescence af tryptophaner 6 eller af en fluorescens-mærket interaktion partner 3,8, mens laseren etablerer en temperaturgradient (AT på 2-6 ° C). Den resulterende temperaturforskel i rummet, AT, fører til udtømning eller akkumulering af molekyler i området for forhøjet temperatur, som kan kvantificeres ved Soret fi cient (S T):

g "/>

c varmt repræsenterer koncentrationen i den opvarmede region, og C Kold er koncentrationen i den indledende koldt region.

Som vist i figur 1B, en typisk MST eksperimentresultaterne i en MST bevægelse profil (tidssporet), der består af forskellige faser, som kan adskilles ved deres respektive tidsplaner. Den indledende fluorescens måles i de første 5 s i fravær af temperaturgradienten at definere den præcise start fluorescens og for at kontrollere for fotoblegning eller photoenhancement. Temperaturen Jump (T-jump) repræsenterer den fase, hvor fluorescens ændringer før thermophoretic bevægelse. Denne indledende fald i fluorescens afhænger varme-afhængige ændringer i fl uorophore kvantumudbytte. Den thermophoresis fase følger, hvor fluorescens falder (eller stiger) på grund af den thermophoretic bevægelse af molekylerne indtil steady-state fordelingen er nået.Kan observeres den omvendte TJump og samtidig tilbagediffusion af fl uorescent molekyler som vist i figur 1 B, efter at laseren er slukket. For at få adgang grundlæggende bindende parametre, er forskellige molære forhold af interaktionspartnere analyseret og sammenlignet. Typisk er 16 forskellige forhold undersøgt i en MST eksperiment, hvorimod den optiske synlige molekyle holdes konstant og leveres med en stigende mængde af umærket ligand. Samspillet mellem de to bindende partnere inducerer ændringer i thermophoresis, og dermed i det normaliserede fl uorescence, F norm, der beregnes som følger:

ligning

F varmt og F koldt repræsenterer gennemsnit fl uorescence intensiteter på defineret tidspunkter af MST spor. Bindingsaffiniteter (K d eller EC 50 værdier) kan beregnes ved Curve fitting (figur 1C).

Samlet set MST er et stærkt værktøj til at studere molekylære interaktioner af nogen art. Dette håndskrift tilbyder en protokol til at karakterisere udfordrende samspil mellem det lille molekyle adenosin trifosfat (ATP, 0,5 kDa) og 25-nt kort ssDNA aptamer DH25.42 (7,9 kDa). I løbet af manuskriptet, er bindingsstedet for aptameren på ATP-molekylet kortlagt ned til adenin gruppe af ATP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af aptameren arbejdslager

  1. Følg producentens anvisninger og opløse oligonukleotidet (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sekvens fra henvisning 18) i vand, når en 100-uM endelig koncentration.
  2. Forbered aptamer arbejdsopløsning ved fortynding af oligonukleotidet lager til 200 nM med bindingsbuffer (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCI; 5 mM MgCl2; 0,01% Tween20).
  3. Inkuber blandingen i 2 minutter ved 90 ° C, lad prøven straks køle ned på is, og bruge prøven ved stuetemperatur.

2. Fremstilling af liganden fortyndingsrækken

  1. For hver ligand (adenosintriphosphat (ATP), adenosindiphosphat (ADP), adenosinmonophosphat (AMP), adenin, guanosintriphosphat (GTP), cytidintrifosfat (CTP), deoxyadenosintriphosphat (dATP), og S-adenosylmethionin (SAM) ; 10 mM lager hver), udarbejde en 16-trins seriel dilutiindenfor 200 pi mikro reaktionsrør.
    BEMÆRK: Centrifugering af ligand bestande i 5 minutter ved 14.000 xg kan bidrage til at fjerne aggregater. Lav lydstyrke, er lav binding reaktionsrør anbefales for at undgå adsorption af molekyler til rørvæggene.
  2. Start med en maksimal koncentration på mindst 50 gange højere end den estimerede affinitet og reducere ligandkoncentrationen med 50% i hvert fortyndingstrin.
    BEMÆRK: Koncentrationen Finder værktøj implementeret i kontrol software simulerer bindende data og hjælper med at finde den rigtige koncentrationsområde til fortynding serien.
  3. Fyld 20 pi af liganden lager (10 mM) i røret 1. Tilsæt 10 pi aptamer bindingsbuffer i mikro reaktionsrør 2 til 16.
  4. Transfer 10 pi røret 1 til røret 2 og bland korrekt ved pipettering op og ned adskillige gange. Overfør 10 uL til næste rør og gentage denne udvanding for de resterende rør.
  5. Kassér 10 pi overskydende fra den sidste rør. Undgå enhver buffer udvanding effekter. Bufferen i rør 1 og i rør 2-16 skal være identisk.

3. Forberedelse af den endelige Reaction Mix

  1. Forbered individuelle bindingsreaktioner med et volumen på 20 pi (10 pi aptamer arbejdsopløsning + 10 pi af den respektive ligand fortynding) for at minimere pipetteringsfejl. Et rumfang på kun 4 pi er til- fi keligt at fi ll kapillarrøret.
  2. Tilsæt 10 pi af 200 nM aptamer arbejdsopløsning til 10 pi af hver ligand fortynding og bland korrekt ved pipettering op og ned adskillige gange.
  3. Inkuber prøverne i 5 minutter ved stuetemperatur og fi ll prøverne til standardmeldinger kapillærer ved at dyppe kapillærerne ind i prøven. Længere inkubationstider kan være nødvendigt for nogle interaktioner; dog 5 min er tilstrækkelig for de fleste. Tryk kapillærerne kun på siderne, ikke på den midterste del, hvor den optiske måling vil blive taget.
  4. Placer kapillærer onto the kapillar bakke og start MST enheden.

4. Start af MST-enhed

BEMÆRK: Enheden indeholder to forudinstallerede software-pakker, den '' kontrol "software til den tekniske opsætning af de eksperimentelle betingelser og '' analyse" software til fortolkning af de producerede data.

  1. Før du placerer den kapillære bakken ind i MST-enhed, start kontrol software og justere den overordnede ønskede temperatur ved at vælge '' aktivere manuel temperaturstyring "i '' temperaturkontrol" dropdown-menu. Temperaturen holdes på 25 ° C på denne måde.
    BEMÆRK: MST instrumenter kan være temperaturstyret 22-45 ° C.
  2. Vent på, at temperaturen at nå det forventede niveau og derefter placere den kapillære skuffen ind i MST-enhed.
  3. Sæt LED kanal til '' røde "for Cy5 farvestoffer og juster LED power til at få en fl uorescence signal på 300 til 1.000 fluorescensenheder ved MST enhed med en standard sensor. 25% LED power er anvendt i denne undersøgelse.
    BEMÆRK: 6.000 til 18.000 fluorescensenheder anbefales til MST med en høj følsomhed sensor.

5. Kapillær Scan

  1. Udfør en kapillær scanning for at kontrollere forskellige kvalitetsaspekter af prøven ved at vælge den kapillære position på "kontrol" software og klikke på "start cap scan" før du starter MST målingen.
  2. Undersøg kapillær scanning til fluorescens enhancement / afkølende og stikning effekter (U-formet eller fladtrykt toppe) i softwaren.
    BEMÆRK: Flere detaljer om påvisning og håndtering af fluorescens og stikning effekter kan findes i diskussionen.

6. MST Måling

BEMÆRK: Før du starter MST måling, skal du sørge for at udelukke stikning effekter, forbedring / afkølende effekt, ellerpipetteringsfejl, og sikre, at den kapillære scanning viser, at fl uorescence signalet er til- fi keligt. For flere detaljer, se diskussionen.

  1. Tildel ligandkoncentrationer fra fortyndingsrækken til den respektive kapillær position i '' kontrol "software Overvej fortynding trinnet som omfatter blanding aptameren og liganden. (1: 1).
  2. Indtast den højeste koncentration af ligand (5 mM) til kapillær # 1, vælge den korrekte fortynding type (her, 1: 1), skal du klikke på den maksimale koncentration, og bruge træk-funktionen til automatisk at tildele de resterende koncentrationer i kapillærer # 2- 16. Den laveste koncentration er 152,6 nM.
  3. Angiv koncentrationen af ​​fl uorescent aptamer (her, 100 nM) i den respektive sektion af styresoftware.
  4. Brug standardindstillingerne, som registrerer fl uorescence i 5 sek, optage MST i 30 sek, og registrere fluorescens i yderligere 5 sek efter inaktivering af laser t o overvåge tilbagediffusion af molekyler.
  5. Juster lasereffekten til 20% i de respektive afsnit af styresoftware.
    BEMÆRK: For at modtage det bedste signal-til-støj-forhold og for at undgå uspecifikke effekter, anbefales en laser effekt på 20-40%. I særlige tilfælde kan en højere laser magt være forpligtet til at få en god adskillelse af ubundne og bundne molekyler.
  6. Gem eksperimentet efter valg destinationsmappen og start MST målingen ved at trykke på "" knappen 'Start MST måling.
    BEMÆRK: .ntp fil vil blive genereret i destinationsmappen. Med denne opsætning, en måling varer 10-15 min.
  7. Gentag den eksperimentelle procedure mindst to gange for en mere nøjagtig bestemmelse af EC50-værdi.
    BEMÆRK: For at teste den tekniske reproducerbarhed, kan de samme kapillærer scannes flere gange (tekniske gentagelser).

7. MST Dataanalyse

nt "> NOTE: Analysen software muliggør analysen af data på fl y under målingen Analysen software plotter MST tid spor og ændringer i den normaliserede fl uorescence (F norm) versus ligandkoncentrationen 37..

  1. Start MST analyse software (MO.Affinity Analysis) og indlæse .ntp filen fra destinationsmappen. Vælg "MST" som analysen type i valgmenuen data.
    BEMÆRK: I tilfælde af ligand-afhængig fluorescens virkninger, kan den indledende fluorescens vælges til analyse.
  2. Tilsæt respektive tekniske eller biologiske run (s) til en ny analyse med træk og slip, eller ved at trykke på knappen "+" under den respektive eksperimentelle løb.
  3. Tryk på knappen nedenfor den respektive eksperimentelle løb at få oplysninger om egenskaberne for eksperimentet, MST spor, kapillær scanning, kapillær form, indledende fluorescens, og blegning sats.
    BEMÆRK: Disse rådata kan alså inspiceres i senere trin i analysen.
  4. Efterse MST spor for sammenlægning og nedbør effekter, synlige som stød og pigge.
    BEMÆRK: Yderligere oplysninger om påvisning og håndtering af sammenlægning effekter, læse diskussionen.
  5. Efterse kapillær scanning og det kapillære form overlay for adsorption effekter, synlige som flade eller U-formede toppe. Efterse kapillær scanning og den indledende fluorescens for fluorescens effekter. Efterse blegning sats for fotoblegning effekter.
  6. Skift til dosis-respons-tilstand og ændre indstillingen analyse til "ekspert" ved at trykke på den pågældende knap. Vælg "T-Hop" som MST evalueringsstrategi.
  7. Vælg "Hill" model for kurve udrustning. De bindende parametre vil automatisk blive beregnet. Normalisere data ved at vælge den respektive type normalisering i "sammenlign resultaterne" menuen. Eksporterdata enten som en .xls eller .pdf.
    BEMÆRK: Nedenstående tabel den bindende graf opsummerer de beregnede bindende parametre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne undersøgelse blev MST anvendt til at karakterisere bindingssted DH25.42 DNA aptamer 18 på ATP. I modsætning til andre undersøgelser kendetegner interaktionen af ATP eller ATP-efterlignende små molekyler med proteiner tilfældigt mærket med en eller flere fluoroforer 38-40, denne undersøgelse omfatter en mærket version af 7,9 kDa ssDNA aptamer med én Cy5 molekyle på 5'enden . Forskellige ATP derivater og beslægtede molekyler, der alle er forskellige fra ATP i forskellige positioner, blev anvendt til at kortlægge bindingssted på ATP-molekylet. Fortyndingsrække (i 16 trin, hvilket reducerer ligandkoncentration med 50% hver) af de forskellige ligander blev fremstillet og blandet med en konstant mængde Cy5-mærket aptamer. Prøver blev analyseret i standard kapillærer ved 25% LED og 20% ​​lasereffekt. Bevægelsesprofiler (MST tid spor) blev registreret og fluorescensenheder, afledt af T-jump fase blev afbildet versus liganden concentrtion (sammenlign figur 1C). Kurvetilpasning blev udført anvendelse af Hill-ligningen, hvilket resulterer i EC 50 -værdier. I 5 uafhængige biologiske gentagelser (4 forskellige operatører, 2 forskellige aptamer bestande, 2 forskellige ATP bestande), ATP-aptamer interaktion viser negativ bindende amplitude på 6 til 13 enheder og en gennemsnitlig EC50-værdi på 52,3 ± 5,0 pM (figur 2A ). Fejl barer i de bindende grafer og "±" præsenteres i affinitet data repræsenterer standardafvigelsen af ​​5 biologiske gentagelser (5 uafhængige målinger i en anden kapillær). Tidligere beskrevne affiniteter for interaktionen af DH25.42 aptamer med [2,8,5'- 3H] adenosin og ATP-agarose var sammenlignelige. Vekselvirkningen af radioaktivt mærket adenosin med aptamer blev kvantificeret ved en centrifugal filter assay og en affinitet (Kd) på 6 ± 3 uM blev bestemt. Isokratisk eluering eksperimenter med ATP IMMOBILliseret til agarose resulterede i en affinitet (Kd) på 13 uM 18,41.

For en bedre side-by-side sammenligning, kan dataene normaliseres til den del af kompleksbundne molekyler (Fraktionen bundet, FB) ved følgende ligning:
ligning
hvor værdien (c) er den MST målte værdi for koncentrationen c, fri er MST værdi for den ubundne tilstand (laveste koncentration), og kompleks er MST værdi for den fuldt bundne tilstand (figur 2B). Denne normalisering er ideel til at sammenligne resultaterne af forskellige ligander i en graf, som vist i figur 2C. De fundne AF fi heder af ADP (63,6 ± 5,9 pM i biologiske dubletter), AMP (91,6 ± 9,1 pM i biologiske dubletter), og SAM (44,4 ± 3,2 pM i biologiske dubletter), som adskiller sig fra ATP i number af phosphatgrupper, indebærer, at denne holdning har ingen eller kun mindre indflydelse på den bindende opførsel af aptamer (figur 2C og D). OH-gruppen på C2 kulstof på ribosen af ​​ATP kunne også udelukket fra at være den største bindingssted, som dATP også var bundet af aptameren med en lidt reduceret of fi skabet (64,4 ± 6,1 pM i biologiske dubletter). Ændring af purin gruppe af ATP til pyrimidingruppe CTP resulterede i ikke-bindende af aptameren, hvilket viser betydningen af ​​denne gruppe for interaktionen. Aptameren bundet til adenin med en affinitet på 141,7 ± 9,4 pM (i biologiske dubletter), hvilket viser, at bindingsstedet skal være i denne del af ATP-molekylet. Purin molekyler GTP og ATP er forskellige i det grønne skraverede område i figur 2D, som repræsenterer den største bindingssted aptamer på ATP. En anden undersøgelse anvendte ikke-kvantitative elueringsbetingelser eksperimenter med forskellige ATP-derivater tileluere et radiomærket aptamer fra ATP agarosen, som viste sammenlignelige resultater til denne MST undersøgelse 18.

Figur 2
Figur 1: mikroskala Thermophoresis. (A) Den tekniske opsætning af MST teknologien er vist. Optikken fokuserer på midten af ​​glaskapillarer og derved detektere fluorescenssignal af det optisk synlige molekyle. En IR laser anvendes til at etablere en temperaturgradient i observationsvinduet af det optiske system. Ændringer i fluorescens kan anvendes til at overvåge thermophoretic bevægelse af molekylerne i opløsning (B) MST tidssporet-bevægelse fi l af molekyler i en temperaturgradient. Den indledende fluorescens måles i 5 sek, mens laseren er slukket. Tænd laseren genererer en temperaturgradient. Efter den umiddelbare T-jump phase, hvor fl uorescent farvestof reducerer sit signal udbytte på varme induktion, thermophoretic bevægelse finder sted, og der ses i 30 sek. Efter at laseren er slukket, molekylerne diffunderer tilbage. (C) Resultater af et typisk MST eksperiment: (venstre) 16 kapillærer indeholdende samme koncentration af fluorescerende molekyle og en stigende koncentration af det umærkede ligand; MST tid spor registreres og normaliseret til deres oprindelige fluorescens. (Højre) Den normaliserede fl uorescence; forskellen mellem F kold og F hot er afbildet mod koncentrationen af liganden. En kurve fit af disse data udbytter bindende parametre, såsom binding af fi skabet. Re-print med tilladelse fra Elsevier, Methods 28; licensnummer 3890230800113. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: MST dataanalyse. (A) baseline korrigeret normaliserede fl uorescence bf norm (‰), afledt af MST TJump signalet er plottet mod ATP-koncentration (i uM). Hill-ligningen (EC50) blev påført til kurvetilpasning. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen fra fem biologiske gentagelser. (B) Fraktion-bundne plot af dataene vist i A. De respektive datasæt blev normaliseret til fraktionen bundet, og gennemsnittet af disse normaliserede data er præsenteret i den bindende graf. Fejlsøjlerne angiver standardafvigelsen af ​​5 biologiske gentagelser. (C) Fraktionen bundet graf viser en kvantitativ sammenligning (Hill fit) af de forskellige ligander til aptamer. De fejl repræsenterer standardafvigelsen Deviation af to biologiske gentagelser. (D) binding af fi heder (EF 50) af forskellige ligander til aptamer. Det grønne skraverede område angiver det bindingssted aptamer på adenin gruppen af ​​ATP. Dette tal er modificeret fra Elsevier, Methods 28; licensnummer 3890230800113. Datasæt fra den tidligere undersøgelse er analyseres igen og udvides inden for denne undersøgelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Assay optimering for MST eksperimenter. (A) proteinadsorption og stikning virkninger kan påvises i det kapillære scanning. Uregelmæssige peak former såsom flade eller U-formede toppe, angives klæbning af prøvematerialet til glasoverfladen. Chængende den kapillære type (standard, premium, eller hydrofob) kan forhindre molekyle adsorption, hvilket resulterer i en regelmæssig topform. (B) De MST tid spor tjener også som en kvalitetskontrol, da kan påvises aggregater der som bump og spikes. Forsøgsbetingelserne kan optimeres ved at forbedre opløseligheden af molekylerne (f.eks, herunder detergenter, såsom Pluronic F-127 eller varierende pH-værdier eller saltkoncentrationer). Centrifugering kan bidrage til at fjerne større aggregater. For at sikre optimal datakvalitet, bør MST tid spor ligne det givne eksempel. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvalitet kontrol:

Uspecifik fastklæbning / adsorption af prøvemateriale til overflader, samt aggregering effekter, har en dramatisk indflydelse på kvaliteten af ​​de affinitet data. Men kun få state-of-the-art teknologier giver præcise og hurtige muligheder for at overvåge og undgå disse effekter. MST tilbyder integrerede kvalitetskontroller, der registrerer og bidrage til at overvinde disse problemer, der giver mulighed for trinvis optimering af tekniske setup. Vigtig information om knaster og fluorescens effekter kan udvindes fra kapillær scanning og kapillær form (trin 5.2 og 7.5), hvorimod kan overvåges sammenlægning / nedbør effekter (trin 7.7) i bevægelse profiler. Disse kontroller aktivere for løbende forbedring af datakvalitet og repræsenterer kritiske trin i protokollen.

Påvisning af adsorption effekter og fejlfinding:

Den kapillære scanningen er primært udført som en inioplys- trin at bestemme positionen af ​​kapillærerne på holderen bakken ved at scanne fluorescens over det. Hver top repræsenterer én kapillær, hvilket indikerer startpunktet for MST måling. Visuel inspektion af topform muliggør bestemmelse af adsorption af molekyler til glasoverfladen, som er et væsentligt kvalitetskontrol, der skal udføres før start MST eksperimentet. Den kapillære form overlay muliggør let påvisning af fladtrykte, hullede toppene, eller endog for toppe, der ligner en U-formen, hvilket indikerer adsorptionen / klæbning af molekyler til den indre glasoverflade af kapillæren (figur 3A, øvre panel). Anderledes belagt kapillær typer (standard, premium, og hydrofobe) med til at sikre opløselighed og minimal adsorption af molekylerne til kapillærerne. Kapillærer bør testes for deres egnethed forud for bindingsforsøg. Detergenter, såsom Tween (0,005-0,1%) eller Pluronic F127 (0,01-0,1%) may også forhindre uspecifikke adsorptionseffekter. Optimering på dette trin af forsøget er afgørende for høj kvalitet data (sammenlign figur 3A, nedre panel).

Påvisning af fluorescens effekter og fejlfinding:

Variationer i tophøjden af ​​de scannede kapillærer tilbyde endnu et lag af information om prøvetyper karakteristika. Tilfældige forskelle i kapillær fluorescens kan på den ene side skyldes pipetteringsfejl eller, på den anden side, stammer fra store prøve aggregater i scanneområdet, der kan øge fluorescensen drastisk. Høj pipettering nøjagtighed er obligatorisk for at undgå udvanding effekter. At blande alle løsninger ved pipettering op og ned forøger nøjagtigheden yderligere. Desuden er det vigtigt at holde bufferen konsekvent i hvert kapillar. Strategier til at håndtere sammenlægning effekter præsenteres i en senere afsnit.

Systemisk ændringer i fluorescens med increasynge ligandkoncentration indikerer ofte ligandafhængig quenching / enhancement virkninger. "SD Test" udføres for at skelne binding-induceret fluorescens skifter fra uspecifik fluorescens tab; denne test overvåger fluorescensintensiteter under denaturerende betingelser. I tilfælde af ligand-afhængig fluorescens virkninger, bør fluorescensintensiteterne under denaturerende betingelse være identiske, uafhængig af koncentrationen af ​​titreringsmiddel. Hvis forskellen i fluorescensintensiteter stadig er til stede under disse betingelser blev materialet enten tabt på grund af uspecifik adsorption til rørvæggene eller grundet aggregering og efterfølgende centrifugering.

For at udføre SD Test, er 10 pi af den første og 10 pi af det sidste ligand fortyndingstrin hver forsigtigt overført til et frisk rør indeholdende 10 pi af en 2x SD Mix (4% SDS og 40 mM DTT). Prøverne blandes og molekylerne denatureres i 5 minutter ved 95 ° C. after fyldning prøverne i kapillærerne, er fluorescensintensiteterne målt. Hvis der detekteres en ligand-afhængig fluorescens virkning, kan dataene analyseres direkte ved bindingen information udledes af ændringer fluorescensintensiteten.

Påvisning af sammenlægning effekter og fejlfinding:

Ujævn, ujævne MST tid spor tyder sammenlægning og / eller nedbør effekter (figur 3B, øverste panel). Ikke-aggregeret prøvemateriale viser en ren og glat thermophoretic bevægelse profil (figur 3B, nederste panel). Centrifugeringen af ​​prøvematerialet før anvendelse (5-10 min ved 14.000 xg), tilsætning af detergenter (0,005-0,1% Tween-20, 0,01-0,1% Pluronic F-127, eller lignende), anvendelse af BSA ( > 0,5 mg / ml), eller ændringen af ​​pufferbetingelser (pH og ionstyrke) anbefales at minimere aggregering effekter og at optimere kvaliteten af ​​data. For at opnå data af høj kvalitet, deter vigtigt at minimere sammenlægning virkninger.

Dataanalyse og kurvetilpasning:

En thermophoretic bevægelse profil er opdelt i forskellige faser, som kan inspiceres enten separat eller samtidigt. T-jump beskriver den pludselige ændring i fluorescens udbytte ved temperaturændring, altså en iboende egenskab ved fluoroforer. Direkte binding i de tætte omgivelser af fluoroforen eller kropsbygning ændringer efter binding stærkt påvirker T-Jump. Den langsommere thermophoresis refererer til bevægelsen af ​​molekyler i marken temperatur, der tilbyder information om den overordnede struktur af det dannede kompleks. Standard type data analyse beskæftiger indstillingen "Thermophoresis + T-Hop", udnytter begge fænomener til at bestemme de bindende parametre. I tilfælde de to faser har modsatte retninger, anbefales det at analysere faserne adskilt. Bemærk venligst, at time-effekter og forskellige arter af MolecESTEMMELSER kan føre til forskelle i affinitet thermophoresis og T-Jump. En anden type analyse mulighed er den manuelle indstilling, som muliggør undersøgelse af specifikke områder af bevægelsen profil. Forstyrrelser på grund af sammenlægning eller konvektion kan udelukkes på denne måde. For at forbedre datakvaliteten, kan markører sættes før sammenlægning signaler. Undersøgelse af tidlige thermophoresis frembringer almindeligvis data med mindre støj, idet konvektion er en tidsafhængig proces. Denne tidlige manuel indstilling er stærkt anbefales til eksperimenter med høj laser effekt (80%). Ved at vælge indstillingen dataanalyse, kan to montering modeller integreret i analyse software anvendes til at passe den bindende kurve. Pasformen funktion for K d fra loven af masse handling er velegnet til 1: 1 bindende tilstande eller for flere bindingssteder har samme affinitet. Koncentrationen-uafhængige dissociationskonstant Kd beskriver ligevægten mellem bound og ubundet tilstand; Således er affiniteten af ​​et bindingssted til en ligand målt. Den koncentrationsafhængig EC50-værdi afledt af Hill-ligningen repræsenterer den effektive dosis af en ligand, hvor halvdelen af de mærkede molekyler er i den bundne tilstand. The Hill fit bør anvendes på multivalente bindende modeller, især hvis de er samarbejdsvillig.

De integrerede kvalitetskontrol repræsenterer en stor fordel af MST forhold teknologier som SPR eller ITC. Disse kontroller giver mulighed for hurtig og nem optimering af tekniske setup for at sikre optimal datakvalitet. Ud over de tid-effektive målinger (K d i 15 min) og immobilisering-fri setup, tilbyder MST frit valg af buffere, tillader vurdering af molekylære interaktioner, selv i lysater og sera 5,42,43. På grund af det faktum, at molekylær thermophoresis afhænger af størrelse, ladning, og hydrering skallen af ​​molekyler, er der ingen begrænsningeri størrelsen af ​​de målte interaktion partnere i MST målinger. Den dynamiske of fi skabet interval, fra pM til mM, sammen med det lave forbrug prøve, fuldender styrker MST-teknologi. Det er værd at nævne, at MST genererer præcise data om grundlæggende bindende parametre, såsom bindende affinitet, støkiometri, og termodynamik. Imidlertid MST ikke mulighed for måling af k på og koff priser. Derudover må man overveje at for de fleste MST eksperimenter, skal en fluorescerende modifikation hvormed en af ​​interaktionspartnere. De genererede data er i god overensstemmelse med state-of-the-art teknologier, såsom SPR og ITC 32,43-46. Men disse data er, kvalitetskontrollerede, forsøgene er hurtigere, og de bruger mindre materiale. Samlet set MST repræsenterer en kraftig teknologi vinkelret på state-of-the-art teknologier, med nogle ekstra fordele.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CE og TS er medarbejdere i 2bind GmbH, som giver biofysiske analytiske tjenester. Offentliggørelse gebyrer for denne video-artikel, er betalt af 2bind GmbH.

Acknowledgments

Forfatterne har ingen bekræftelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aptamer binding buffer 20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer IDT, Leuven, Belgium sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-
ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP Sigma Aldrich, Germany  A2383 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
ADP Sigma Aldrich, Germany  A2754 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
AMP Sigma Aldrich, Germany  A2252 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Adenine Sigma Aldrich, Germany  A8626 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
SAM Sigma Aldrich, Germany  A7007 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
dATP Sigma Aldrich, Germany  11934511001 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
CTP Sigma Aldrich, Germany  C1506 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
GTP Sigma Aldrich, Germany  G8877 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Monolith NT.115  NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-G008 Blue/Red Channel
MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-K002
Eppendorf PCR tubes Eppendorf, Germany 30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1 NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2 Synergy Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Linke, P., et al. An Automated Microscale Thermophoresis Screening Approach for Fragment-Based Lead Discovery. J Biomol Screen. 21 (4), 414-421 (2015).
  2. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
  3. Zillner, K., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol Biol. 815, 241-252 (2012).
  4. Zhang, W., Duhr, S., Baaske, P., Laue, E. Microscale thermophoresis for the assessment of nuclear protein-binding affinities. Methods Mol Biol. 1094, 269-276 (2014).
  5. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat Commun. 1, 100 (2010).
  6. Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10656-10659 (2012).
  7. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
  8. Schubert, T., et al. Df31 protein and snoRNAs maintain accessible higher-order structures of chromatin. Mol Cell. 48 (3), 434-444 (2012).
  9. McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
  10. Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-Molecule Binding Aptamers: Selection Strategies, Characterization, and Applications. Front Chem. 4, 14 (2016).
  11. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Anal Chem. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  12. Chang, A. L., McKeague, M., Smolke, C. D. Facile characterization of aptamer kinetic and equilibrium binding properties using surface plasmon resonance. Methods Enzymol. 549, 451-466 (2014).
  13. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  14. Sokoloski, J. E., Dombrowski, S. E., Bevilacqua, P. C. Thermodynamics of ligand binding to a heterogeneous RNA population in the malachite green aptamer. Biochemistry. 51 (1), 565-572 (2012).
  15. Burnouf, D., et al. kinITC: a new method for obtaining joint thermodynamic and kinetic data by isothermal titration calorimetry. J Am Chem Soc. 134 (1), 559-565 (2012).
  16. Mannironi, C., Scerch, C., Fruscoloni, P., Tocchini-Valentini, G. P. Molecular recognition of amino acids by RNA aptamers: the evolution into an L-tyrosine binder of a dopamine-binding RNA motif. RNA. 6 (4), 520-527 (2000).
  17. Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
  18. Huizenga, D. E., Szostak, J. W. A DNA aptamer that binds adenosine and ATP. Biochemistry. 34 (2), 656-665 (1995).
  19. Lee, E. R., Baker, J. L., Weinberg, Z., Sudarsan, N., Breaker, R. R. An allosteric self-splicing ribozyme triggered by a bacterial second messenger. Science. 329 (5993), 845-848 (2010).
  20. Wickiser, J. K., Cheah, M. T., Breaker, R. R., Crothers, D. M. The kinetics of ligand binding by an adenine-sensing riboswitch. Biochemistry. 44 (40), 13404-13414 (2005).
  21. Jucker, F. M., Phillips, R. M., McCallum, S. A., Pardi, A. Role of a heterogeneous free state in the formation of a specific RNA-theophylline complex. Biochemistry. 42 (9), 2560-2567 (2003).
  22. Zhao, Q., Lv, Q., Wang, H. Aptamer fluorescence anisotropy sensors for adenosine triphosphate by comprehensive screening tetramethylrhodamine labeled nucleotides. Biosens Bioelectron. 70, 188-193 (2015).
  23. Zhang, D., et al. A sensitive fluorescence anisotropy method for detection of lead (II) ion by a G-quadruplex-inducible DNA aptamer. Anal Chim Acta. 812, 161-167 (2014).
  24. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule imaging of an in vitro-evolved RNA aptamer reveals homogeneous ligand binding kinetics. J Am Chem Soc. 131 (29), 9866-9867 (2009).
  25. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev Sci Instrum. 81 (8), 083705 (2010).
  26. Zichel, R., Chearwae, W., Pandey, G. S., Golding, B., Sauna, Z. E. Aptamers as a sensitive tool to detect subtle modifications in therapeutic proteins. PLoS One. 7 (2), 31948 (2012).
  27. Baaske, P., Wienken, C. J., Reineck, P., Duhr, S., Braun, D. Optical thermophoresis for quantifying the buffer dependence of aptamer binding. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (12), 2238-2241 (2010).
  28. Entzian, C., Schubert, T. Studying small molecule-aptamer interactions using MicroScale Thermophoresis (MST). Methods. 97, 27-34 (2016).
  29. Valenzano, S., et al. Screening and Identification of DNA Aptamers to Tyramine Using in Vitro Selection and High-Throughput Sequencing. ACS Comb Sci. 18 (6), 302-313 (2016).
  30. Jauset Rubio, M., et al. beta-Conglutin dual aptamers binding distinct aptatopes. Anal Bioanal Chem. 408 (3), 875-884 (2016).
  31. Breitsprecher, D., et al. Aptamer Binding Studies Using MicroScale Thermophoresis. Methods Mol Biol. 1380, 99-111 (2016).
  32. Stoltenburg, R., Schubert, T., Strehlitz, B. In vitro Selection and Interaction Studies of a DNA Aptamer Targeting Protein A. PLoS One. 10 (7), 0134403 (2015).
  33. Kinghorn, A. B., et al. Aptamer Affinity Maturation by Resampling and Microarray Selection. Anal Chem. 88 (14), 6981-6985 (2016).
  34. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (52), 19678-19682 (2006).
  35. Braun, D., Libchaber, A. Trapping of DNA by thermophoretic depletion and convection. Phys Rev Lett. 89 (18), 188103 (2002).
  36. Duhr, S., Arduini, S., Braun, D. Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence. Eur Phys J E Soft Matter. 15 (3), 277-286 (2004).
  37. Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay Drug Dev Technol. 9 (4), 342-353 (2011).
  38. He, K., Dragnea, V., Bauer, C. E. Adenylate Charge Regulates Sensor Kinase CheS3 To Control Cyst Formation in Rhodospirillum centenum. MBio. 6 (3), 00546 (2015).
  39. Brvar, M., et al. Structure-based discovery of substituted 4,5'-bithiazoles as novel DNA gyrase inhibitors. J Med Chem. 55 (14), 6413-6426 (2012).
  40. Pogorelcnik, B., et al. 4,6-Substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as monocyclic catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIalpha targeting the ATP binding site. Bioorg Med Chem. 23 (15), 4218-4229 (2015).
  41. Jhaveri, S., Rajendran, M., Ellington, A. D. In vitro selection of signaling aptamers. Nat Biotechnol. 18 (12), 1293-1297 (2000).
  42. Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. J Vis Exp. (78), (2013).
  43. Ramakrishnan, M., et al. Probing cocaine-antibody interactions in buffer and human serum. PLoS One. 7 (7), 40518 (2012).
  44. Chen, M., et al. Antiviral activity and interaction mechanisms study of novel glucopyranoside derivatives. Bioorg Med Chem Lett. 25 (18), 3840-3844 (2015).
  45. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186 (4,5), 61-67 (2015).
  46. Harazi, A., et al. The Interaction of UDP-N-Acetylglucosamine 2-Epimerase/N-Acetylmannosamine Kinase (GNE) and Alpha-Actinin 2 Is Altered in GNE Myopathy M743T Mutant. Mol Neurobiol. , (2016).

Tags

Biokemi Lille molekyle-aptamer interaktion bindende parametre mikroskala Thermophoresis bindende affinitet støkiometri termodynamik nukleinsyrer bindingssted kortlægning
Kortlægning af bindingssted en aptamer på ATP Brug mikroskala Thermophoresis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Entzian, C., Schubert, T. Mapping… More

Entzian, C., Schubert, T. Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (119), e55070, doi:10.3791/55070 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter