Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Published: January 7, 2017 doi: 10.3791/55070
Automatic Translation
1, 1
12bind GmbH

Introduction

Interactie tussen moleculen is de basis van de natuur. Vandaar dat wetenschappers op vele terreinen van fundamenteel en toegepast onderzoek proberen om de fundamentele principes van de moleculaire interacties van verschillende soorten te begrijpen. Microschaal Thermophoresis (MST) kunnen wetenschappers de snelle, nauwkeurige, kostenefficiënte en op kwaliteit gecontroleerde karakterisering van moleculaire interacties uit te voeren in een oplossing, met een vrije keuze van buffers. Er zijn al meer dan 1.000 publicaties met behulp van MST, van 2016 alleen al, de beschrijving van verschillende soorten analyses, met inbegrip van de bibliotheek screenings, bindende event validaties, de concurrentie assays, en experimenten met meerdere bindende partners 1-8. Over het algemeen MST maakt de studie van de klassieke bindingsparameters, zoals bindingsaffiniteit (pM tot mM), stoichiometrie en thermodynamica, van elke soort moleculaire interactie. Een groot voordeel van MST is het vermogen binding gebeurtenissen onafhankelijk van de grootte van de interactiepartners bestuderen. zelfs challenging interacties tussen kleine nucleïnezuur aptameren (15-30 nt) en targets zoals kleine moleculen, geneesmiddelen, antibiotica, of metabolieten kunnen worden gekwantificeerd.

De huidige state-of-the-art technologieën te karakteriseren aptameer-target interacties ofwel lab-intense en zeer complexe of niet te kwantificeren aptameer-klein molecuul interacties 9,10. Surface Plasmon Resonance (SPR) gebaseerde assays 11,12 en echt label-free calorimetrische benaderingen, zoals Isotherme Titratie Calorimetrie (ITC) 13-15, isocratische elutie 16, evenwicht filtratie 17,18, in-line sonderen 19, gel- shift assays, stoppunt fl ow fluorescentie-spectroscopie 20,21, fluorescentie anisotropie (FA) 22,23, single-molecule fluorescentie beeldvorming 24,25, en Bio-layer interferometrie (BLI) 26 zijn ook ofwel onnauwkeurig of niet verenigbaar met aptameer-klein molecuul interacties. andere principal vraagstukken van deze methoden zijn lage gevoeligheid, hoge monster verbruik, immobilisatie, massatransport beperkingen op oppervlakken, en / of buffer beperkingen. Slechts een paar van deze technologie te bieden geïntegreerde schakelaars voor aggregatie en adsorptie effecten.

MST is een krachtig hulpmiddel voor wetenschappers om deze beperking op de interactie tussen aptameren en kleine moleculen 27-29, alsmede andere doelen zoals eiwitten 30-33 bestuderen overwonnen. De technologie is gebaseerd op de beweging van moleculen door temperatuurgradiënten. Deze gerichte beweging, genaamd "thermophoresis," afhankelijk van de grootte, lading en hydratatie shell van het molecuul 34,35. De binding van een ligand aan het molecuul direct ten minste één van deze parameters verandert, wat resulteert in een veranderde mobiliteit thermophoretic. Liganden met kleine maten kan geen aanzienlijke gevolgen in termen van grootte veranderen van de niet-gebonden aan de gebonden toestand, maar ze kunnen dr hebben amatic effecten op de hydratatie shell en / of kosten. De veranderingen in de thermophoretic beweging van moleculen na interactie met de bindende partner maakt de kwantificering van fundamentele bindingsparameters 2,7,34,36,37.

Zoals weergegeven in figuur 1A, de MST inrichting bestaat uit een infrarood laser gefocust op het monster in de glazen capillairen met dezelfde optiek als voor fluorescentiedetectie. De thermophoretic beweging van eiwitten via de intrinsieke fluorescentie van tryptofaan 6 of een fluorescent gelabelde interactiepartner 3,8 kan worden bewaakt terwijl de laser wordt een temperatuurgradiënt (AT van 2-6 ° C). Het resulterende temperatuurverschil in de ruimte, AT, leidt tot de uitputting of accumulatie van moleculen in het gebied van verhoogde temperatuur, die kan worden gekwantificeerd door de Soret coëfficiënt (S T):

g "/>

c hete geeft de concentratie in het verwarmde gebied, en c koud de concentratie in de oorspronkelijke koud gebied.

Zoals getoond in figuur 1B, een typische MST experiment resulteert in een MST bewegingsprofiel (tijddiagram), bestaande uit verschillende fasen, die gescheiden kunnen worden door hun respectieve tijdschema. De initiële fluorescentie gemeten in de eerste 5 s bij afwezigheid van de temperatuurgradiënt de precieze start fluorescentie definiëren en controleren fotobleken of photoenhancement. De temperatuursprong (T-Jump) vertegenwoordigt de fase waarin de fluorescentieveranderingen voor thermophoretic beweging. Deze initiële afname in fluorescentie afhankelijk warmte-afhankelijke veranderingen van fl uorophore kwantumopbrengst. De thermophoresis fase volgt, waarbij de fluorescentie afneemt (of verhogingen) door de thermophoretic beweging van de molecules tot de steady-state verdeling wordt bereikt.Het omgekeerde TJump en gelijktijdige terugdiffusie van fluorescerende moleculen zoals aangegeven in figuur 1B nadat de laser is uitgeschakeld worden waargenomen. Om bij fundamentele bindingsparameters worden verschillende molaire verhoudingen van de interactiepartners geanalyseerd en vergeleken. Gewoonlijk worden 16 verschillende ratio's bestudeerd in een MST experiment, terwijl de optische zichtbaar molecuul constant wordt gehouden en wordt geleverd met een toenemende hoeveelheid van de niet-gelabelde ligand. De interactie tussen de twee bindingspartners induceert veranderingen in de thermophoresis, en dus de genormaliseerde fluorescentie, F norm, die wordt berekend als volgt:

Vergelijking

F warme en koude F vertegenwoordigen gemiddelde fluorescentie-intensiteiten in de gedefinieerde tijdstippen van het MST sporen. Bindende affiniteiten (Kd of EC 50 waarden) kan worden berekend door curve fitting (figuur 1C).

Over het geheel genomen MST is een krachtig hulpmiddel om de moleculaire interacties van welke aard dan ook te bestuderen. Dit manuscript biedt een protocol bij de uitdagende interactie te karakteriseren tussen de kleine molecule adenosine trifosfaat (ATP; 0,5 kDa) en de 25-nt korte ssDNA aptameer DH25.42 (7,9 kDa). In de loop van het manuscript wordt de bindingsplaats van de aptameer aan het ATP molecuul in kaart gebracht naar de adenine groep van ATP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van de aptameer werken Stock

  1. De instructies van de fabrikant en los het oligonucleotide (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sequentie uit referentie 18) in water, tot een 100-uM eindconcentratie.
  2. Bereid de aptameer werkende oplossing door verdunning van de oligonucleotide voorraad tot 200 nm met bindingsbuffer (20 mM Tris, pH 7,6, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,01% Tween 20).
  3. Incubeer het mengsel gedurende 2 minuten bij 90 ° C, laat het monster onmiddellijk afgekoeld op ijs, en gebruik het monster bij kamertemperatuur.

2. Bereiding van het ligand verdunningsreeks

  1. Voor elk ligand (adenosine trifosfaat (ATP), adenosine difosfaat (ADP), adenosine monofosfaat (AMP), adenine, guanosine trifosfaat (GTP), cytosine trifosfaat (CTP) deoxyadenosinetrifosfaat (dATP) en S-adenosyl methionine (SAM) ; 10 mM voorraad elk) bereiden een 16-stap seriële dilutiop in 200 ul micro reageerbuizen.
    OPMERKING: Centrifugeren ligand bestanden 5 min bij 14.000 xg kunnen helpen om aggregaten te verwijderen. Klein volume worden lage bindingsreactie buizen aanbevolen adsorptie van moleculen voorkomen dat de buiswanden.
  2. Begin met een maximale concentratie van ten minste 50 maal hoger dan de geschatte affiniteit en vermindering van de ligand concentratie 50% per verdunningsstap.
    LET OP: De concentratie finder instrument in de besturingssoftware geïmplementeerd simuleert binding data en helpt bij het vinden van de juiste concentratie bereik voor de verdunningsreeks.
  3. Vul 20 ul van de ligand voorraad (10 mM) in buis 1. Voeg 10 ui bindingsbuffer aptameer in micro reactiebuizen 2-16.
  4. Breng 10 pl van de buis 1 aan de buis 2 en meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen. Transfer 10 pi de volgende buis en herhaal deze verdunning voor de resterende buizen.
  5. Gooi de 10 ul overtollige uit de laatste buis. Vermijd bUffer verwatering effecten. De buffer in de buis 1 en in tubes 2-16 moet identiek zijn.

3. Voorbereiding van de Final Reaction Mix

  1. Bereid de individuele bindingsreacties met een volume van 20 pl (10 ui werkoplossing aptameer + 10 ul van de respectievelijke ligand verdunning) te pipetteren fouten te minimaliseren. Een volume van slechts 4 pi is die voldoende is om fi ll het capillair.
  2. Voeg 10 ul van 200 nM aptameer werkoplossing 10 pi van elke verdunning ligand en meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen.
  3. Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en fi ll de monsters in standaard capillairen door dompelen de capillairen in het monster. Langere incubatietijden kunnen nodig zijn voor sommige interacties; echter 5 min is voldoende voor de meeste. Tik de capillairen alleen aan de zijkanten, niet op het middendeel, waarbij het optisch meting genomen.
  4. Plaats de capillairen naar ee capillaire lade en start de MST-apparaat.

4. Het starten van de MST Device

OPMERKING: Het apparaat biedt twee vooraf geïnstalleerde software pakketten, de '' control 'software voor de technische opzet van de experimentele condities en de' 'analyse "software voor het interpretatie van de geproduceerde gegevens.

  1. Voor het plaatsen van de capillaire lade in de MST-apparaat, start de besturingssoftware en de algehele gewenste temperatuur door '' in staat stellen handmatige controle van de temperatuur 'in de' 'temperatuurregeling "dropdown menu te selecteren aan te passen. Breng de temperatuur op 25 ° C die manier.
    OPMERKING: De MST instrumenten kunnen temperatuurgeregelde 22-45 ° C.
  2. Wacht tot de temperatuur tot het verwachte niveau te bereiken en plaats dan de capillaire lade in de MST-apparaat.
  3. Stel de LED-kanaal '' red 'voor Cy5 kleurstoffen en stel de LED power te winnen a fl uorescencsignaal e van 300 tot 1000 fluorescentie-eenheden op MST via een standaard sensor. 25% LED stroom wordt gebruikt in deze studie.
    LET OP: 6.000 tot 18.000 fluorescentie-eenheden worden aanbevolen voor de MST met een zeer gevoelige sensor.

5. Capillaire Scan

  1. Voer een capillair scan om verschillende aspecten van het monster kwaliteit te controleren door te kiezen voor de capillaire positie op de "controle" software en te klikken op "start cap scan" vóór het begin van het MST meting.
  2. Inspecteer de capillaire scan op fluorescentie verhoging / quenching en vasthouden effects (U-vormig of afgeplat pieken) in de software.
    OPMERKING: Meer details over de opsporing en behandeling van fluorescentie en plakken effecten zijn te vinden in de discussie.

6. MST Measurement

LET OP: Voordat u de MST meten, zorg ervoor om uit te sluiten plakken effecten, enhancement / blussen effecten, ofpipetteerfouten, en ervoor te zorgen dat het capillair scan geeft aan dat de fluorescentie-signaal die voldoende is. Voor meer informatie, zie de bespreking.

  1. Wijs de ligand concentraties van de verdunningsreeks de respectieve positie in de capillaire ' "controle" programmatuur Beschouw de verdunningsstap van mengen van de aptameer en ligand. (1: 1).
  2. Voer de hoogste concentratie van ligand (5 mm) voor capillaire # 1, selecteert u de juiste verdunning type (hier, 1: 1), klikt u op de maximale concentratie, en het gebruik van de functie sleep om de resterende concentraties in de haarvaten # 2- automatisch toe te wijzen 16. De laagste concentratie is 152,6 nM.
  3. Voer de concentratie van het fluorescerende aptameer (hier, 100 nM) in het respectieve gedeelte van besturingssoftware.
  4. Gebruik de standaardinstellingen, waarbij de fluorescentie gedurende 5 sec detecteren MST opnemen 30 seconden, en de fluorescentie gedurende nog 5 seconden op nadat de inactivering van de laser t o toezicht achter diffusie van moleculen.
  5. Stel het laservermogen tot 20% in het betreffende deel van de besturingssoftware.
    Opmerking: Om de beste signaal-ruisverhouding ontvangen en niet-specifieke effecten te vermijden, wordt een laservermogen van 20-40% aanbevolen. In bepaalde gevallen kan een hogere laservermogen worden verplicht om een ​​goede scheiding van ongebonden en gebonden moleculen te krijgen.
  6. Sla het experiment na het selecteren van de doelmap en start de MST meting door op de '' toets 'Start MST meting.
    NB: De .ntp bestand wordt in de doelmap worden gegenereerd. Met behulp van deze opstelling, één meting duurt 10-15 min.
  7. Herhaal de experimentele procedure ten minste tweemaal voor een nauwkeurige bepaling van de EC 50 waarde.
    meerdere malen Om de technische reproduceerbaarheid te testen, kan dezelfde capillairen worden gescand (technische herhalingen): Let.

7. MST Data Analysis

nt "> NB: De analyse software kan de analyse van gegevens over de fl y tijdens de meting De analyse software plot de MST tijd sporen en de veranderingen in de genormaliseerde fluorescentie (F norm) ten opzichte van de ligand concentratie. 37.

  1. Start de MST analyse software (MO.Affinity Analysis) en de .ntp bestand uit de doelmap te laden. Selecteer "MST", zoals het type analyse in de data selectie menu.
    OPMERKING: Bij ligand-afhankelijke fluorescentie effecten, kunnen de aanvankelijke fluorescentie wordt gekozen voor analyse.
  2. Voeg de desbetreffende technische of biologische run (s) een nieuwe analyse door middel van drag-and-drop of door op de "+" knop onder de respectieve experimentele run.
  3. Druk op de knop informatie onder de desbetreffende experimentele run om informatie over de eigenschappen van het experiment, MST sporen, capillaire-scan, capillaire vorm, aanvankelijk fluorescentie, en bleken tarief te verkrijgen.
    LET OP: Deze ruwe data kan alin latere stappen van de analyse worden gecontroleerd.
  4. Inspecteer de MST sporen voor aggregatie en neerslag effecten zichtbaar als hobbels en spikes.
    LET OP: Voor meer informatie over de opsporing en behandeling van aggregatie effecten, lees de discussie.
  5. Inspecteer de capillaire scan en de capillaire vorm overlay voor adsorptie effecten zichtbaar als afgeplatte of U-vormige pieken. Inspecteer de capillaire scan en de eerste fluorescentie voor fluorescentie-effecten. Visueel te inspecteren het bleken tarief voor fotobleken effecten.
  6. Schakel de dosis-respons-modus en verander de analyse instelling in "expert" modus door op de bijbehorende knop. Selecteer "T-Jump" als het MST evaluatie strategie.
  7. Selecteer de "Heuvel" model voor de curve fi tting. De bindende parameters wordt automatisch berekend. Normaliseren van de gegevens door te kiezen voor de respectievelijke soort normalisering in de "resultaten te vergelijken" menu. Exporteer dedata hetzij als een .xls of .pdf.
    NB: De tabel onder de bindende grafiek geeft een overzicht van de berekende bindende parameters.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bij deze studie werd MST aangebracht op de bindingsplaats van de DH25.42 DNA aptameer 18 karakteriseren op ATP. In tegenstelling tot andere studies karakteriseren van de interactie van ATP of ATP lijkende kleine moleculen eiwitten willekeurig gemerkt met één of meer fluoroforen 38-40 Deze studie omvat een gemerkte versie van het 7,9 kDa ssDNA aptameer met een Cy5 molecuul op het 5'- uiteinde . Verschillende ATP derivaten en verwante moleculen, alle verschillend van ATP in verschillende posities, werden gebruikt voor de bindingsplaats op het ATP molecuul in kaart. Verdunningsreeksen (in 16 stappen, waardoor de ligand concentratie elk 50%) van de verschillende liganden werden bereid en gemengd met een constante hoeveelheid Cy5-gelabelde aptameer. Monsters werden geanalyseerd op standaard capillairen LED 25% en 20% laservermogen. Bewegingsprofielen (MST tijd sporen) werden geregistreerd en fluorescentie-eenheden, afgeleid van de T-Jump fase werden uitgezet tegen het ligand concentratie (vergelijken figuur 1C). Curve fitting werd uitgevoerd toepassen van de Hill-vergelijking, waardoor EC 50-waarden. In 5 onafhankelijke biologische herhalingen (4 verschillende operators, 2 verschillende aptameer voorraden, 2 verschillende ATP voorraden), de ATP-aptameer interactie toont een negatief bindend amplitude van 6 tot 13 eenheden en een gemiddelde EC50 waarde van 52,3 ± 5,0 micrometer (Figuur 2A ). Foutbalken in de binding grafieken en "±" dat in de affiniteit data geven de standaardafwijking van 5 biologische herhalingen (5 onafhankelijke meting in een ander capillair). Eerder gemeld affiniteiten voor de interactie van de aptameer met DH25.42 [2,8,5'- 3H] adenosine en ATP agarose vergelijkbaar. De interactie van radioactief gemerkt adenosine met de aptameer werd gekwantificeerd door een centrifugaal filter assay, en een affiniteit (Kd) van 6 ± 3 uM werd bepaald. Isocratische elutie experimenten met ATP immobilized aan agarose resulteerde in een affiniteit (Kd) van 13 uM 18,41.

Voor een betere side-by-side vergelijking, kunnen de gegevens worden genormaliseerd om de fractie gecomplexeerde moleculen (gebonden fractie, FB) met de volgende vergelijking:
Vergelijking
waarbij waarde (c) de MST gemeten waarde voor de concentratie c, vrij is MST waarde voor de ongebonden toestand (laagste concentratie) en gecomplexeerde de MST waarde voor het volledig gebonden toestand (figuur 2B). Deze normalisatie is ideaal om de resultaten van verschillende liganden te vergelijken in een grafiek, zie figuur 2C. De ontdekte af fi schappen van ADP (63,6 ± 5,9 uM in biologische duplicaten), AMP (91,6 ± 9,1 uM in biologische duplicaten), en SAM (44,4 ± 3,2 uM in biologische duplicaten), die verschillen van ATP in het number van fosfaatgroepen, impliceren dat deze positie geen of slechts geringe invloed op het bindende gedrag van de aptameer (figuur 2C en D). De OH-groep op de C2 koolstof van de ribose van ATP zou ook kunnen worden uitgesloten van de belangrijkste bindingsplaats, zoals dATP werd ook gebonden aan de aptameer met een iets lagere affiniteit (64,4 ± 6,1 uM in biologische duplicaten). Veranderen van de purine groep ATP aan de pyrimidine groep CTP resulteerde in niet-binding van de aptameer, waaruit het belang van deze groep voor de interactie. De aptameer gebonden aan adenine met een affiniteit van 141,7 ± 9,4 uM (in biologische duplo), waaruit blijkt dat de bindingsplaats moet in dit deel van het ATP molecuul. De purine moleculen GTP en ATP verschillen in de groene gearceerde gebied weergegeven in figuur 2D, die de belangrijkste bindingsplaats van de aptameer aan ATP vertegenwoordigt. Een andere studie gebruikte niet-kwantitatieve elutie experimenten met verschillende ATP derivatenelueren een radioactief gemerkt ATP aptameer uit agarose, die vergelijkbare resultaten toonden deze studie MST 18.

Figuur 2
Figuur 1: microschaal Thermophoresis. (A) De technische opzet van de MST techniek weergegeven. De optiek gericht op het midden van glazen capillairen, waarbij het fluorescentiesignaal van de optisch zichtbare molecuul detecteren. Een IR-laser gebruikt om een ​​temperatuurgradiënt te vestigen in het kijkvenster van het optische systeem. Veranderingen in fluorescentie kan worden gebruikt om de thermophoretic beweging van de moleculen in oplossing (B) MST tijddiagram beweging fi el moleculen monitoren een temperatuurgradiënt. De initiële fluorescentie wordt gemeten 5 seconden terwijl de laser uitgeschakeld. Inschakelen van de laser produceert een temperatuurgradiënt. Na de onmiddellijke T-Jump phase, waarbij de fluorescerende kleurstof vermindert het signaal rendement bij hitte-inductie, de thermophoretic beweging plaatsvindt en waargenomen voor 30 sec. Nadat de laser is uitgeschakeld, het diffunderen terug. (C) De resultaten van een typisch experiment MST: (links) 16 capillairen die dezelfde concentratie van fluorescerend molecuul en toenemende concentratie van het ongelabelde ligand; de MST tijd sporen worden geregistreerd en genormaliseerd naar hun oorspronkelijke fluorescentie. (Rechts) De genormaliseerde fluorescentie; het verschil tussen F koud en warm F is uitgezet tegen de concentratie van het ligand. Een curve fit van deze gegevens levert binding parameters, zoals de bindende affiniteit. Re-print met toestemming van Elsevier, Methods 28; licentienummer 3890230800113. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: MST data-analyse. (A) De basislijn gecorrigeerde genormaliseerde fluorescentie AF norm (‰), afgeleid van de MST TJump signaal wordt uitgezet tegen de ATP-concentratie (in gM). De Hill-vergelijking (EC 50) werd toegepast voor curve fitting. De foutbalken geven de standaardafwijking van vijf biologische herhalingen. (B)-gebonden fractie grafiek gefotografeerde data A. De respectievelijke gegevenssets werden genormaliseerd aan de gebonden fractie en het gemiddelde genormaliseerde deze gegevens worden gepresenteerd in de grafiek binding. De foutbalken geven de standaardafwijking van 5 biologische herhalingen. (C) De fractie gebonden grafiek laat een kwantitatieve vergelijking (Hill fit) van de verschillende liganden aan de aptameer. De fout balken geven de standaard Deviatie van twee biologische herhalingen. (D) Binding af fi schappen (EC 50) van verschillende liganden aan de aptameer. De green gearceerde gebied geeft de bindingsplaats van de aptameer aan het adenine van ATP groep. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Elsevier, Methods 28; licentienummer 3890230800113. data sets uit de vorige studie worden opnieuw geanalyseerd en uitgebreid in deze studie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Assay optimalisatie voor MST experimenten. (A) Eiwitadsorptie en vasthouden effecten kunnen worden gedetecteerd in de capillaire scan. Onregelmatige piekvormen zoals afgeplatte of U-vormige pieken, geven de plakken van het monstermateriaal het glasoppervlak. Copknoping het type capillair (standaard, premium of hydrofoob) kan adsorptie molecuul voorkomen, waardoor een regelmatige piekvorm. (B) De MST timetraces ook dienen als een kwaliteitscontrole, omdat aggregaten daar stoten en stroompieken kunnen worden gedetecteerd. De proefomstandigheden kan worden geoptimaliseerd door het verbeteren van de oplosbaarheid van moleculen (bv, waaronder detergentia zoals Pluronic F-127 of variërende pH en zoutconcentraties). Centrifugeren kan helpen om grotere aggregaten te verwijderen. Om een ​​optimale kwaliteit van de gegevens waarborgen, moet het MST tijd sporen het gegeven voorbeeld lijken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kwaliteitscontroles:

Aspecifieke plakken / adsorptie van monstermateriaal op oppervlakken en aggregatie effecten, een wezenlijke invloed op de kwaliteit van de affiniteit gegevens. Slechts enkele state-of-the-art technologieën bieden een nauwkeurige en snelle opties te controleren en deze te vermijden. MST biedt geïntegreerde kwaliteitscontroles die detecteren en helpen om deze problemen te overwinnen, waardoor de stapsgewijze optimalisatie van de technische installatie. Belangrijke informatie over steken en fluorescentie effecten kunnen worden geëxtraheerd uit de capillaire scan en capillaire vorm (stap 5,2 en 7,5), terwijl aggregatie / precipitatie effecten (stap 7,7) in de bewegingsprofielen worden bewaakt. Deze controles mogelijk te maken voor de constante verbetering van de kwaliteit van gegevens en vertegenwoordigen kritische stappen in het protocol.

Detectie van adsorptie-effecten en het oplossen van problemen:

De capillaire scan wordt hoofdzakelijk uitgevoerd als initiële stap om de positie van de haarvaten op de lade houder bepalen door het scannen van de fluorescentie in het. Elke piek vertegenwoordigt een capillair, met vermelding van het startpunt voor het MST meting. Visuele inspectie van de piek vorm maakt de bepaling van de adsorptie van moleculen op het glasoppervlak, waarbij een essentieel kwaliteitscontrole die moeten worden uitgevoerd voordat de MST experiment. De capillaire vorm overlay maakt het mogelijk om eenvoudige detectie van afgeplat, hobbelige piek vormen, of zelfs van de pieken die een U-vorm te lijken, met vermelding van de adsorptie / plakken van moleculen aan het binnenste glasoppervlak van het capillair (Figuur 3A, bovenste paneel). Anders beklede capillaire types (standaard, premium en hydrofobe) helpen de oplosbaarheid en minimale adsorptie van de moleculen aan de capillairen waarborgen. Capillairen moeten worden getest op hun geschiktheid voor de bindingsexperimenten. Detergentia, zoals Tween (0,005-0,1%) of Pluronic F127 (0,01-0,1%) may ook voorkomen dat niet-specifieke adsorptie effecten. Optimalisatie in deze fase van de proef essentiële gegevens van hoge kwaliteit (vergelijk Figuur 3A, onderste paneel).

Detectie van de fluorescentie effecten en het oplossen van problemen:

Variaties in de piekhoogte van de gescande haarvaten bieden een andere laag van informatie over de materiaaleigenschappen. Willekeurige verschillen in capillaire fluorescentie kan, enerzijds, als gevolg van fouten pipetteren of, anderzijds, afkomstig van grote aggregaten monster in het aftastgebied dat de fluorescentie drastisch toenemen. High pipetteren nauwkeurigheid is verplicht om verwatering effecten te vermijden. Mengen van alle oplossingen en neer te pipetteren verhoogt de nauwkeurigheid verder. Bovendien, is het essentieel om de buffer consistent elk capillair houden. Strategieën om aggregatie effecten te behandelen worden gepresenteerd in een latere paragraaf.

Systemische veranderingen van de fluorescentie met increazingen ligand concentratie vaak aan ligand afhankelijke uitdoving / verbetering effecten. "SD-Test" wordt uitgevoerd om bindende geïnduceerde fluorescentie veranderingen ten opzichte van niet-specifieke fluorescentie verlies discrimineren verricht; Deze test controleert fluorescentie-intensiteiten onder denaturerende omstandigheden. Bij ligand-afhankelijke fluorescentie effecten moeten de fluorescentie-intensiteiten onder denaturerende toestand identiek, onafhankelijk van de concentratie van titrant. Indien het verschil in fluorescentie-intensiteiten aanhoudt onder deze omstandigheden, werd materiaal ofwel verloren als gevolg van niet-specifieke adsorptie aan buiswanden of door aggregatie en daaropvolgende centrifugatie.

Om de SD Test uitvoeren 10 ul van de eerste en 10 pl van het ligand laatste verdunningsstap zijn elk zorgvuldig overgebracht naar een nieuwe buis met 10 pl van een 2 x SD Mix (4% SDS en 40 mM DTT). De monsters worden gemengd en de moleculen gedenatureerd gedurende 5 minuten bij 95 ° C. after vullen van de monsters in capillairen, worden de gemeten fluorescentie-intensiteiten. Als een ligand-afhankelijke fluorescentie effect wordt gedetecteerd, kunnen de gegevens direct door de bindende informatie afgeleid uit de fluorescentie-intensiteit verandert geanalyseerd.

Detectie van aggregatie-effecten en het oplossen van problemen:

Hobbelige, ongelijke MST tijd sporen geven aggregatie en / of neerslag effecten (Figuur 3B, bovenste paneel). Niet-geaggregeerde monstermateriaal toont een schoon en glad thermophoretic beweging profiel (Figuur 3B, onderste paneel). Het centrifugering van het monstermateriaal voorafgaand aan gebruik (5-10 min bij 14.000 xg), de toevoeging van detergentia (0,005-0,1% Tween-20, 0,01-0,1% Pluronic F-127, en dergelijke), het gebruik van BSA ( > 0,5 mg / ml), of de verandering van buffer omstandigheden (pH en ionsterkte) het beste de aggregatie te minimaliseren en de gegevenskwaliteit optimaliseren. Om een ​​hoge kwaliteit te verkrijgen, isis essentieel om de aggregatie te minimaliseren.

Data-analyse en curve fitting:

Een thermophoretic bewegingsprofiel wordt verdeeld in verschillende fasen, die afzonderlijk of gelijktijdig worden geïnspecteerd. De T-sprong beschrijft de plotselinge verandering in fluorescentie opbrengst op temperatuurverandering, hetgeen een intrinsieke eigenschap van fluoroforen. Directe binding in de nabije omgeving van het fluorofoor of conformatie veranderingen na binding sterk van invloed op de T-Jump. De langzamere thermophoresis verwijst naar de beweging van moleculen in het gebied temperatuur, die informatie over de algemene structuur van het gevormde complex. Het standaard type data-analyse maakt gebruik van de instelling "Thermophoresis + T-Jump", het benutten van beide fenomenen aan de bindende parameters bepalen. Indien de twee fasen tegengestelde richtingen, wordt aanbevolen om de fasen afzonderlijk te onderzoeken. Houd er rekening mee dat de time-effecten en verschillende soorten Molecdules kan leiden tot verschillen in de affiniteit van de thermophoresis en T-sprong. Een ander type analyse optie is de handmatige instelling, die het onderzoek van specifieke gebieden van bewegingsprofiel maakt. Storingen ten gevolge van aggregatie of convectie kan worden uitgesloten op deze manier. Om de kwaliteit van de gegevens te verbeteren, kunnen cursors worden ingesteld voordat aggregatie signalen. Onderzoekt de vroege thermophoresis produceert gewoonlijk data met minder ruis, aangezien convectie een tijdsafhankelijk proces. Deze vroege handmatige instelling wordt sterk aanbevolen voor experimenten met een hoog laservermogen (80%). Bij het kiezen van de data-analyse instelling kan twee pasmodellen in de analyse software worden toegepast op de binding curve fit. De fit-functie voor K d van de wet van de massa-actie is geschikt voor 1: 1 bindende modes of voor meerdere bindingsplaatsen bezit dezelfde affiniteit. De concentratie onafhankelijke dissociatieconstante Kd beschrijft de balans tussen de bound en ongebonden toestand; Aldus wordt de affiniteit van een bindingsplaats voor een ligand gemeten. De concentratie-afhankelijke EC 50 waarde afgeleid van de Hill-vergelijking representeert de effectieve dosis van een ligand waarbij de helft van de gemerkte moleculen in de gebonden toestand. The Hill fit moet worden toegepast om bindende modellen meerwaardige, vooral als ze coöperatie.

De geïntegreerde kwaliteitscontroles vormen een groot voordeel van MST dan technologieën zoals SPR of ITC. Deze controles zorgen voor de snelle en eenvoudige optimalisering van de technische opzet om een ​​optimale kwaliteit van de gegevens te waarborgen. Naast de tijdbesparende metingen (Kd in 15 min) en de immobilisatie set-up MST biedt de vrije keuze van buffers, waardoor de beoordeling van moleculaire interacties, zelfs in lysaten en sera 5,42,43. Vanwege het feit dat moleculaire thermophoresis afhankelijk van de grootte, lading en hydratatie shell moleculen, zijn er geen beperkingenin de grootte van de gemeten interactiepartners tijdens MST metingen. De dynamische affiniteit bereik, van pM tot mm, samen met de lage monster verbruik, completeert de sterke punten van de MST-technologie. Het vermelden waard is dat MST genereert nauwkeurige gegevens over fundamentele bindende parameters, zoals bindende affiniteit, stoichiometrie en thermodynamica. Echter MST niet kunnen meten van kaan en k off rates. Bovendien moet men overwegen dat voor de meeste MST experimenten, moet een fluorescerende modificatie worden toegevoegd aan een van de interactiepartners. De gegenereerde gegevens zijn in goede overeenstemming met state-of-the-art technologieën, zoals SPR en ITC 32,43-46. Echter, deze gegevens zijn kwaliteit gecontroleerd, de experimenten zijn sneller, en ze verbruiken minder materiaal. Overall, MST is een krachtige technologie loodrecht op state-of-the-art technologie, met een aantal extra voordelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CE en TS zijn medewerkers van 2bind GmbH, dat biofysische analytische diensten levert. Publicatie vergoedingen voor deze video-artikel worden betaald door 2bind GmbH.

Acknowledgments

De auteurs hebben geen bevestigingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aptamer binding buffer 20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer IDT, Leuven, Belgium sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-
ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP Sigma Aldrich, Germany  A2383 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
ADP Sigma Aldrich, Germany  A2754 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
AMP Sigma Aldrich, Germany  A2252 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Adenine Sigma Aldrich, Germany  A8626 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
SAM Sigma Aldrich, Germany  A7007 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
dATP Sigma Aldrich, Germany  11934511001 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
CTP Sigma Aldrich, Germany  C1506 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
GTP Sigma Aldrich, Germany  G8877 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Monolith NT.115  NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-G008 Blue/Red Channel
MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-K002
Eppendorf PCR tubes Eppendorf, Germany 30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1 NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2 Synergy Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Linke, P., et al. An Automated Microscale Thermophoresis Screening Approach for Fragment-Based Lead Discovery. J Biomol Screen. 21 (4), 414-421 (2015).
  2. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
  3. Zillner, K., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol Biol. 815, 241-252 (2012).
  4. Zhang, W., Duhr, S., Baaske, P., Laue, E. Microscale thermophoresis for the assessment of nuclear protein-binding affinities. Methods Mol Biol. 1094, 269-276 (2014).
  5. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat Commun. 1, 100 (2010).
  6. Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10656-10659 (2012).
  7. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
  8. Schubert, T., et al. Df31 protein and snoRNAs maintain accessible higher-order structures of chromatin. Mol Cell. 48 (3), 434-444 (2012).
  9. McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
  10. Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-Molecule Binding Aptamers: Selection Strategies, Characterization, and Applications. Front Chem. 4, 14 (2016).
  11. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Anal Chem. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  12. Chang, A. L., McKeague, M., Smolke, C. D. Facile characterization of aptamer kinetic and equilibrium binding properties using surface plasmon resonance. Methods Enzymol. 549, 451-466 (2014).
  13. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  14. Sokoloski, J. E., Dombrowski, S. E., Bevilacqua, P. C. Thermodynamics of ligand binding to a heterogeneous RNA population in the malachite green aptamer. Biochemistry. 51 (1), 565-572 (2012).
  15. Burnouf, D., et al. kinITC: a new method for obtaining joint thermodynamic and kinetic data by isothermal titration calorimetry. J Am Chem Soc. 134 (1), 559-565 (2012).
  16. Mannironi, C., Scerch, C., Fruscoloni, P., Tocchini-Valentini, G. P. Molecular recognition of amino acids by RNA aptamers: the evolution into an L-tyrosine binder of a dopamine-binding RNA motif. RNA. 6 (4), 520-527 (2000).
  17. Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
  18. Huizenga, D. E., Szostak, J. W. A DNA aptamer that binds adenosine and ATP. Biochemistry. 34 (2), 656-665 (1995).
  19. Lee, E. R., Baker, J. L., Weinberg, Z., Sudarsan, N., Breaker, R. R. An allosteric self-splicing ribozyme triggered by a bacterial second messenger. Science. 329 (5993), 845-848 (2010).
  20. Wickiser, J. K., Cheah, M. T., Breaker, R. R., Crothers, D. M. The kinetics of ligand binding by an adenine-sensing riboswitch. Biochemistry. 44 (40), 13404-13414 (2005).
  21. Jucker, F. M., Phillips, R. M., McCallum, S. A., Pardi, A. Role of a heterogeneous free state in the formation of a specific RNA-theophylline complex. Biochemistry. 42 (9), 2560-2567 (2003).
  22. Zhao, Q., Lv, Q., Wang, H. Aptamer fluorescence anisotropy sensors for adenosine triphosphate by comprehensive screening tetramethylrhodamine labeled nucleotides. Biosens Bioelectron. 70, 188-193 (2015).
  23. Zhang, D., et al. A sensitive fluorescence anisotropy method for detection of lead (II) ion by a G-quadruplex-inducible DNA aptamer. Anal Chim Acta. 812, 161-167 (2014).
  24. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule imaging of an in vitro-evolved RNA aptamer reveals homogeneous ligand binding kinetics. J Am Chem Soc. 131 (29), 9866-9867 (2009).
  25. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev Sci Instrum. 81 (8), 083705 (2010).
  26. Zichel, R., Chearwae, W., Pandey, G. S., Golding, B., Sauna, Z. E. Aptamers as a sensitive tool to detect subtle modifications in therapeutic proteins. PLoS One. 7 (2), 31948 (2012).
  27. Baaske, P., Wienken, C. J., Reineck, P., Duhr, S., Braun, D. Optical thermophoresis for quantifying the buffer dependence of aptamer binding. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (12), 2238-2241 (2010).
  28. Entzian, C., Schubert, T. Studying small molecule-aptamer interactions using MicroScale Thermophoresis (MST). Methods. 97, 27-34 (2016).
  29. Valenzano, S., et al. Screening and Identification of DNA Aptamers to Tyramine Using in Vitro Selection and High-Throughput Sequencing. ACS Comb Sci. 18 (6), 302-313 (2016).
  30. Jauset Rubio, M., et al. beta-Conglutin dual aptamers binding distinct aptatopes. Anal Bioanal Chem. 408 (3), 875-884 (2016).
  31. Breitsprecher, D., et al. Aptamer Binding Studies Using MicroScale Thermophoresis. Methods Mol Biol. 1380, 99-111 (2016).
  32. Stoltenburg, R., Schubert, T., Strehlitz, B. In vitro Selection and Interaction Studies of a DNA Aptamer Targeting Protein A. PLoS One. 10 (7), 0134403 (2015).
  33. Kinghorn, A. B., et al. Aptamer Affinity Maturation by Resampling and Microarray Selection. Anal Chem. 88 (14), 6981-6985 (2016).
  34. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (52), 19678-19682 (2006).
  35. Braun, D., Libchaber, A. Trapping of DNA by thermophoretic depletion and convection. Phys Rev Lett. 89 (18), 188103 (2002).
  36. Duhr, S., Arduini, S., Braun, D. Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence. Eur Phys J E Soft Matter. 15 (3), 277-286 (2004).
  37. Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay Drug Dev Technol. 9 (4), 342-353 (2011).
  38. He, K., Dragnea, V., Bauer, C. E. Adenylate Charge Regulates Sensor Kinase CheS3 To Control Cyst Formation in Rhodospirillum centenum. MBio. 6 (3), 00546 (2015).
  39. Brvar, M., et al. Structure-based discovery of substituted 4,5'-bithiazoles as novel DNA gyrase inhibitors. J Med Chem. 55 (14), 6413-6426 (2012).
  40. Pogorelcnik, B., et al. 4,6-Substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as monocyclic catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIalpha targeting the ATP binding site. Bioorg Med Chem. 23 (15), 4218-4229 (2015).
  41. Jhaveri, S., Rajendran, M., Ellington, A. D. In vitro selection of signaling aptamers. Nat Biotechnol. 18 (12), 1293-1297 (2000).
  42. Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. J Vis Exp. (78), (2013).
  43. Ramakrishnan, M., et al. Probing cocaine-antibody interactions in buffer and human serum. PLoS One. 7 (7), 40518 (2012).
  44. Chen, M., et al. Antiviral activity and interaction mechanisms study of novel glucopyranoside derivatives. Bioorg Med Chem Lett. 25 (18), 3840-3844 (2015).
  45. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186 (4,5), 61-67 (2015).
  46. Harazi, A., et al. The Interaction of UDP-N-Acetylglucosamine 2-Epimerase/N-Acetylmannosamine Kinase (GNE) and Alpha-Actinin 2 Is Altered in GNE Myopathy M743T Mutant. Mol Neurobiol. , (2016).

Tags

Biochemie kleine molecule-aptameer interactie bindende parameters microschaal Thermophoresis bindingaffiniteit stoichiometrie thermodynamica nucleïnezuren bindingsplaats in kaart brengen
In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Entzian, C., Schubert, T. Mapping… More

Entzian, C., Schubert, T. Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (119), e55070, doi:10.3791/55070 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter