Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מיפוי אתר הקישור של Aptamer על ATP שימוש microscale Thermophoresis

Published: January 7, 2017 doi: 10.3791/55070
Automatic Translation
1, 1
12bind GmbH

Introduction

אינטראקציה בין המולקולות היא הבסיס של הטבע. לפיכך, מדענים בתחומים רבים של מחקר בסיסי ויישומים לנסות להבין את עקרונות היסוד של אינטראקציות מולקולריות מסוגים שונים. Microscale Thermophoresis (MST) מאפשרת למדענים לבצע את מהירה מדויקת, יעילה וחסכונית, ואיכות שבשליטת אפיון של אינטראקציות מולקולריות בתמיסה, עם בחירה חופשית של מאגרים. יש כבר יותר מ -1,000 פרסומים באמצעות MST, משנת 2016 בלבד, המתאר סוגים שונים של ניתוחים, כוללים סריקות ספרייה, מחייב אימותי אירוע, מבחני תחרות, וניסויים עם שותפים מחייבים מספר 1-8. באופן כללי, MST מתיר חקר הפרמטרים המחייבים הקלסיים, כגון זיקה מחייבת (PM כדי מ"מ), ורכב, ותרמודינאמיקה, מכל סוג של אינטראקציה מולקולרית. יתרון גדול של MST הוא היכולת ללמוד אירועים מחייבים תלות בגודל של שותפי האינטראקציה. אפילו chalאינטראקציות lenging בין aptamers חומצות גרעין קטן (15-30 NT) ויעדים כגון מולקולות קטנות, תרופות, אנטיביוטיקה, או מטבוליטים ניתן לכמת.

נוכח המדינה- of-the-art טכנולוגיות לאפיין אינטראקציות aptamer-היעד הם או מעבדה קשות ומורכבות מאוד או להיכשל לכמת aptamer-מולקולה קטנה קשרי גומלין 9,10. Surface Plasmon תהודה (SPR) מבוססי מבחני 11,12 וגישות קלוריות ללא תווית באמת, כגון Calorimetry טיטרציה איזו תרמים (ITC) 13-15, elution isocratic 16, ltration fi שיווי משקל 17,18, ב-קו חיטוט 19, ג'ל משמרת מבחנים, והשתתק fl זרימת uorescence ספקטרוסקופיה 20,21, אנאיזוטרופיה קרינה (FA) 22,23, uorescence ההדמיה fl מולקולה בודדת 24,25, ו interferometry ביו השכבתי (BLI) 26 גם אם לא מדויקים או לא תואמים עם מולקולת aptamer-קטן יחסי גומלין. principa אחרסוגיות l של שיטות אלו רגישות נמוכה, צריכת דגימה גבוהה, חוסר תנועה, מגבלות להסעת המונים על משטחים, ו / או הגבלות חיץ. רק מעטי טכנולוגיות אלה מספקים בקרות משולבות אפקטי צבירת ספיחה.

MST מהווה כלי רב עוצמה עבור המדענים להתגבר על מגבלה זו כדי לחקור את יחסי הגומלין בין aptamers ומולקולות קטנות 27-29, כמו גם מטרות אחרות כגון חלבונים 30-33. הטכנולוגיה מתבססת על תנועת מולקולות באמצעות הדרגתיים טמפרטורה. התנועה מכוונת זו, המכונה "thermophoresis," תלוי בגודל, פריצה, ופצצת הידרציה של המולקולה 34,35. עקידת ליגנד למולקולה תשנה במישרין לפחות אחד הפרמטרים האלה, וכתוצאה מכך ניידות thermophoretic השתנה. הליגנדים עם מידות קטנות לא שיכולים להשפיע בצורה מהותית מבחינת שינוי הגודל מתוך המאוגד אל המדינה הנכנסת, אבל הם יכולים להיות dr תופעות amatic על הקליפה הידרציה ו / או תשלום. השינויים בתנועה thermophoretic של מולקולות לאחר אינטראקציות עם שותף מחייב מאפשרת כימות של פרמטרים מחייבים בסיסיים 2,7,34,36,37.

כפי שמתואר באיור 1A, מכשיר MST מורכב ליזר אינפרא אדום הממוקד על המדגם בתוך נימי הזכוכית באמצעות אותו אופטיקה ובאשר גילוי קרינה. התנועה thermophoretic של חלבונים באמצעות uorescence fl הפנימי של tryptophans 6 או של 3,8 שותף אינטראקציה שכותרתו fluorescently ניתן לנטר בזמן הלייזר קובע שיפוע הטמפרטורה (ΔT של 2-6 מעלות צלזיוס). הבדל הטמפרטורה והתוצאה הוא יותר שטח, ΔT, מוביל הדלדול או ההצטברות של מולקולות בתחום הטמפרטורה גבוהה, אשר ניתן לכמת ידי Soret COEF fi יעיל (S T):

ז "/>

ג חם מייצג את הריכוז באזור המחומם, וקרת c היא הריכוז באזור הקר הראשוני.

כפי שניתן לראות בתרשים 1B, תוצאות ניסוי MST טיפוסיות פרופיל תנועת MST (זכר זמן), מורכב שלבים שונים, אשר יכול להיות מופרד על ידי לוחות הזמנים שלהם. הקרינה הראשונית נמדדה ב -5 s הראשונה בהיעדרו של שיפוע הטמפרטורה כדי להגדיר את הקרינה החל מדויקת כדי לבדוק photobleaching או photoenhancement. קפיצת הטמפרטורה (T-Jump) מייצגת את השלב שבו שינויי הקרינה לפני תנועת thermophoretic. ירידה ראשונית זו קרינה תלויה בשינויים חומים תלויה של fl uorophore תשואת קוונטים. שלב thermophoresis כדלקמן, שבו ירידות הקרינה (או עליות) עקב תנועת thermophoretic של המולקולות עד החלוקה היציבה הוא הגיע.TJump הפוכה דיפוזיה בחזרה קשורה של מולקולות uorescent fl ניתן לצפות כמצוין באיור 1B לאחר הלייזר מכובה. כדי לגשת פרמטרים מחייבים בסיסיים, יחסי טוחנת שונים של השותפים באינטראקציה מנותחים ומשווים. בדרך כלל, 16 יחסים שונים נלמדים בניסוי אחד MST, ואילו מולקולת הגלוי האופטית נשמרה קבועה מסופקת עם כמות הולכת וגדלה של ליגנד ללא תווית. האינטראקציה בין שני השותפים מחייבים גורמת לשינויי thermophoresis, ומכאן גם uorescence fl המנורמל, נורמת F, אשר מחושבת כדלקמן:

משוואה

F חם וקר F מייצג ממוצעי עוצמות fl uorescence ב דה fi מועד לפי שעון נד של עקבות MST. זיקות מחייבות (ד K או EC 50 ערכים) יכולות להיות מחושבות על ידי הכמתמ"כהולם דואר (תרשים 1C).

בסך הכל, MST הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור אינטראקציות מולקולריות מכל סוג שהוא. כתב יד זה מציע פרוטוקול לאפיין את האינטראקציה המאתגרת בין אדנוזין אדנוזין המולקולה הקטן (ATP; 0.5 KDA) ואת 25-NT הקצר ssDNA aptamer DH25.42 (7.9 KDA). במהלך של כתב היד, אתר הקישור של aptamer על מולקולת ATP ממופה אל קבוצת אדנין של ATP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה של Stock עבודת Aptamer

  1. פעל על פי הוראות היצרן ו לפזר את oligonucleotide (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, רצף בהפניה 18) במים, להגיע לריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
  2. הכן את הפתרון עובד aptamer ידי דילול המניות oligonucleotide 200 ננומטר עם חיץ מחייב (20 מ"מ טריס, pH 7.6; 300 מ"מ NaCl; 5 מ"מ MgCl 2; 0.01% Tween20).
  3. דגירה את התערובת במשך 2 דקות ב 90 מעלות צלזיוס, בואו המדגם מיד להתקרר על קרח, ולהשתמש מדגם בטמפרטורת החדר.

2. הכנת סדרת הדילול ליגנד

  1. עבור כל ליגנד (אדנוזין אדנוזין (ATP), diphosphate אדנוזין (ADP), monophosphate אדנוזין (AMP), אדנין, אדנוזין guanosine (GTP), אדנוזין ציטוזין (CTP), אדנוזין deoxyadenosine (dATP), ומתיונין S-adenosyl (SAM) ; 10 מ"מ מניות כל אחת), להכין diluti סדר 16 שלביםעל ב 200 צינורות התגובה מיקרו μl.
    הערה: צנטריפוגה של מניות ליגנד במשך 5 דקות ב 14,000 XG עשוי לעזור כדי להסיר אגרגטים. נפח נמוך, צינורות תגובה מחייבת נמוכים מומלצים להימנע ספיחה של מולקולות על קירות הצינור.
  2. התחל עם ריכוז מרבי של לפחות 50 פעמים גבוהות יותר מאשר הזיקה המוערכת ולהפחית את הריכוז ליגנד ב -50% בכל שלב דילול.
    הערה: הכלי מאתר הריכוז מיושם תוכנות שליטת מדמת נתונים מחייבים ועוזרת במציאת טווח הריכוז הנכון עבור סדרת הדילול.
  3. מלאו 20 μl של המניה ליגנד (10 מ"מ) צינור 1. הוסף 10 μl של חיץ מחייב aptamer לתוך צינורות התגובה מיקרו 2 עד 16.
  4. העברת 10 μl של צינור 1 צינור 2 ומערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. העבר 10 μL אל הצינור הבא וחזרו דילול זה עבור הצינורות הנותרים.
  5. מחק את עודף 10 μl מהצינור האחרון. הימנע מכל bתופעות דילול uffer. המאגר בצינור 1 ו צינורות 2-16 חייב להיות זהה.

3. הכנה של מיקס התגובה האחרון

  1. הכן את התגובות מחייבות אדם עם נפח של 20 μl (10 μl של פתרון עובד aptamer + 10 μl של הדילול ליגנד בהתאמה) כדי למזער שגיאות pipetting. נפח של רק 4 μl הוא יעיל fi סוף ל- Fi ll הנימים.
  2. הוסף 10 μl של הפתרון עובד aptamer 200 ננומטר עד 10 μl של דילול כל ליגנד ומערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
  3. דגירת הדגימות במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר וסיבי ll הדגימות מתפצלות לנימים סטנדרטיים על ידי טבילת הנימים לתוך המדגם. פעמי דגירה כבר עשויות להיות נחוצות עבור אינטראקציות כמה; עם זאת, 5 דקות הוא מתאים ביותר. גע הנימים רק בצדדים, לא על החלק האמצעי, שבו המדידה האופטית תילקח.
  4. מניחים את הנימים על הדואר נימי מגש ולהתחיל מכשיר MST.

4. הפעלת התקן MST

הערה: המכשיר מספק שתי חבילות תוכנה שהותקנה מראש, ה ' "תוכנה עבור ההגדרות הטכניות של תנאי הניסוי ואת השליטה' 'ניתוח" "תוכנה עבור הפרשנות של הנתונים המיוצר.

  1. לפני הצבת מגש הנימים לתוך מכשיר MST, להפעיל את התוכנה מלאה להתאים את הטמפרטורה הכללית רצויה על ידי הבחירה ב '' לאפשר בקרת טמפרטורה ידנית "ב '' בקרת טמפרטורה" התפריט הנפתח. כוונו את הטמפרטורה ל 25 מעלות צלזיוס בדרך זו.
    הערה: מכשירי MST יכולים להיות מבוקר טמפרטורה מ 22 עד 45 ° C.
  2. חכה הטמפרטורה להגיע לרמה הצפויה ולאחר מכן למקם את מגש הנימים לתוך מכשיר MST.
  3. הגדר את ערוץ LED כדי '' אדום "עבור צבע Cy5 ולהתאים את כוח LED להשיג fl uorescencאות e של 300 עד 1,000 יחידות קרינה במכשיר MST עם חיישן רגיל. 25% כוח LED משמש במחקר זה.
    הערה: 6,000 עד 18,000 יחידות קרינה מומלצות לשימוש MST עם חיישן רגישות גבוהה.

5. נימי סריקה

  1. לבצע סריקת נימים לבדוק היבטים שונים באיכות של המדגם על ידי בחירת מיקום הנימים על תוכנת "שליטה" ולחיצה על "התחל סריקת כובע" לפני תחילת מדידת MST.
  2. בדוק את הסריקה נימי להגברת קרינה / מרווה ואפקטים דבקים (בצורת U או נמחצה על פסגות) בתוכנה.
    הערה: פרטים נוספים על זיהוי והטיפול של קרינה ותופעות דבקות ניתן למצוא בדיון.

6. מדידת MST

הערה: לפני שמתחיל את מדידת MST, הקפד לכלול דבק אפקטים, שיפור / אפקטים מרווים, אוטעויות pipetting, ולהבטיח כי סריקת הנימים מציינת כי אות fl uorescence היא הסוף יעיל fi. לפרטים נוספים, ראה דיון.

  1. הקצה את ריכוז ליגנד מסדרת הדילול לתפקיד נימי בהתאמה בתוכנת '' השליטה "לשקול את צעד הדילול של ערבוב aptamer ליגנד. (1: 1).
  2. הזן את הריכוז הגבוה ביותר של ליגנד (5 המ"מ) עבור נימי # 1, בחר את סוג הדילול הנכון (כאן, 1: 1), לחץ על הריכוז המרבי, ולהשתמש בפונקציית גרור להקצות הריכוזים הנותרים באופן אוטומטי נימים # 2 16. הריכוז הנמוך ביותר הוא 152.6 ננומטר.
  3. הזן את הריכוז של aptamer uorescent fl (כאן, 100 ננומטר) בסעיף בהתאמה של תוכנות שליטה.
  4. השתמש בהגדרות ברירת המחדל, אשר לזהות את uorescence fl למשך 5 שניות, להקליט את MST למשך 30 שניות, ולהקליט את הקרינה במשך שניות 5 נוספות לאחר האיון של t הליזר o לפקח על דיפוזיה האחורי של מולקולות.
  5. התאם את כוח לייזר עד 20% בגזרה בהתאמה של תוכנות שליטה.
    הערה: כדי לקבל את יחס אות לרעש הטוב ביותר ועל מנת למנוע תופעות נוקבות, כוח ליזר של 20-40% מומלץ. במקרים מסוימים, כוח ליזר גבוה יותר עשוי להידרש לקבל הפרדה טובה של מולקולות מאוגדות וכרוכות.
  6. שמור את הניסוי לאחר בחירת תיקיית היעד ולהתחיל מדידת MST ידי לחיצה על כפתור '' התחל MST המדידה ".
    הערה: קובץ .ntp יופק בתיקיית היעד. באמצעות התקנה זו, מדידה אחת נמשכת 10-15 דקות.
  7. חזור על ההליך הניסיוני לפחות פעמים לשם קביעה מדויקת יותר של הערך 50 EC.
    הערה: על מנת לבחון את השחזור הטכני, באותה הנימים ניתן לסרוק מספר פעמים (חזרות טכניות).

7. MST ניתוח נתונים

NT "> הערה: תוכנת הניתוח מאפשרת ניתוח של נתונים על y fl במהלך מדידת תוכנת ניתוח מגרשי עקבות MST הזמן ושינויי uorescence fl המנורמל (נורמת F) לעומת הריכוז ליגנד 37..

  1. הפעל את תוכנת ניתוח MST (ניתוח MO.Affinity) ולטעון את הקובץ .ntp מתיקיית היעד. בחר "MST" כסוג ניתוח בתפריט מבחר נתונים.
    הערה: במקרה של תופעות קרינה תלויה ליגנד, הקרינה הראשונית ניתן לבחור לניתוח.
  2. מוסיף את הריצה טכנית או ביולוגית בהתאמה (ים) ניתוח חדש על ידי גרירה ושחרור או על ידי לחיצה על הכפתור "+" להלן בטווח הניסיון בהתאמה.
  3. לחץ על לחצן המידע שלהלן בטווח הניסיון בהתאמה כדי להשיג מידע על המאפיינים של הניסוי, עקבות MST, סריקת נימים, צורה נימי, קרינה ראשונית, וקצב לבן.
    הערה: נתונים גולמיים אלה יכולים אלכך להיבדק, בשלבים מאוחרים יותר של ניתוח.
  4. ראייה לבדוק את עקבות MST לתופעות צבירה משקעים, נראה כמו בליטות קוצים.
    הערה: לקבלת מידע נוסף על זיהוי וטיפול של תופעות צבירה, לקרוא את הדיון.
  5. ראייה לבדוק את הסריקה נימי ואת שכבת צורה נימי עבור אפקטי ספיחה, גלויה כמו פסגות שטוחות או בצורת U. ראייה לבדוק את הסריקה נימי ואת הקרינה הראשונית לתופעות הקרינה. ראייה לבדוק את שיעור ההלבנה עבור photobleaching אפקטים.
  6. למעבר למצב מנת התגובה ולשנות את הגדרת הניתוח למצב "מומחה" על ידי לחיצה על הכפתור בהתאמה. בחר "T-קפיצה" כאסטרטגית הערכת MST.
  7. בחר את הדגם "היל" עבור tting fi העקומה. הפרמטרים מחייבים יחושבו אוטומטית. לנרמל את הנתונים על ידי בחירת בהתאמה לסוג של נורמליזציה בתפריט "להשוות את התוצאות". יצואנתונים אם במסגרת .xls או pdf.
    הערה: הטבלה מתחת לגרף המחייב מסכמת את הפרמטרים מחייבים המחושבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במחקר זה, MST יושמה לאפיין את אתר הקישור של aptamer DH25.42 DNA 18 על ATP. בניגוד למחקרים אחרים המאפיינים את האינטראקציה של ATP או ה- ATP-מחק מולקולות קטנות עם חלבונים שכותרתו אקראית עם fluorophores אחד או יותר 38-40, מחקר זה כולל גרסה שכותרתו של aptamer 7.9 kDa ssDNA עם מולקולת Cy5 אחת בקצה 5' . נגזר ATP שונה ומולקולות קשורות, כל משתנה בין ATP בתפקידים שונים, שמשו כדי למפות את אתר הקישור על מולקולת ATP. סדרת דילול (ב -16 שלבים, צמצום הריכוזיות ליגנד ב -50% כל אחת) של ליגנדים שונים הוכנו מעורבב עם כמות קבועה של aptamer Cy5 שכותרתו. דוגמאות נותחו נימים סטנדרטיות ב -25% LED וכוח ליזר 20%. פרופילי תנועה (עקבות זמן MST) הוקלטו יחידות קרינה, נגזרות מתוך הפאזה T-הקפיצה, היו זממו מול concentr ליגנדation (השוו תרשים 1C). הולם Curve בוצע יישום המשוואה היל, וכתוצאה מכך ערכי 50 EC. ב 5 חזרות ביולוגיות עצמאיות (4 מפעילים שונים, 2 מניות aptamer שונות, 2 מניות ATP שונות), אינטראקצית aptamer-ATP מציגה משרעת מחייב שלילי של 6 עד 13 יחידות וערך 50 EC ממוצעים של 52.3 ± 5.0 מיקרומטר (איור 2 א ). ברי שגיאה בגרפים המחייבים "±" שהוצג נתוני הזיקה מייצגים את סטיית ההתקן של 5 חזרות ביולוגיות (5 מדידות עצמאיות בתוך נימים שונות). בעבר זיקות דיווחו על האינטראקציה של aptamer DH25.42 עם [2,8,5'- 3 ח] -adenosine ו agarose ATP היו דומות. האינטראקציה של אדנוזין radiolabeled עם aptamer היה לכמת ידי assay מסנן צנטריפוגלי, ועל זיקה (K ד) של 6 ± 3 מיקרומטר נקבע. ניסויים elution Isocratic עם immobil ATPized כדי agarose הביא (ד K) זיקה של 13 מיקרומטר 18,41.

עבור Side-by-side השוואה טובה יותר, הנתונים יכולים להיות מנורמלים את החלק היחסי של מולקולות complexed (חלק כבול, FB) באמצעות המשוואה הבאה:
משוואה
שם הערך (ג) הוא ערך MST נמדד למחשבי הריכוז, חינם הוא ערך MST עבור המדינה המאוגדת (הריכוז הנמוך ביותר), ומורכב הוא ערך MST עבור המדינה המחויבת לחלוטין (התרשים 2B). נורמליזציה זה אידיאלי כדי להשוות את התוצאות של ליגנדים שונים בגרף אחד, כפי שמוצג באיור 2C. Nities fi af המזוהה של ADP (63.6 ± 5.9 מיקרומטר כפילויות ביולוגיות), AMP (91.6 ± 9.1 מיקרומטר כפילויות ביולוגיות), ו SAM (44.4 ± 3.2 מיקרומטר כפילויות ביולוגיות), אשר נבדלים ATP ב נוmber של קבוצות פוספט, לרמוז כי עמדה זו אין או קטין רק להשפעה fl על התנהגות מחייבים של aptamer (איור 2 ג ו-ד). קבוצת OH על פחמן C2 של ריבוז של ATP יכולה גם להיות שלילית מלהיות אתר הקישור הגדול, כמו dATP היה חלה עליהם aptamer עם nity fi af מופחת במעט (64.4 ± 6.1 מיקרומטר כפילויות ביולוגיות). שינוי בקבוצה purine של ATP לקבוצת pyrimidine CTP הביא בלתי מחייב של aptamer, הממחיש את חשיבותה של קבוצה זו לאינטראקציה. Aptamer כבול אדנין עם זיקה של 141.7 ± 9.4 מיקרומטר (ב כפילויות ביולוגיות), מראה כי אתר הקישור חייב להיות בחלק זה של מולקולת ה- ATP. מולקולות purine GTP ו- ATP שונות באזור הירוק המוצל המיוצג באיור 2D, המייצג את אתר הקישור המרכזי של aptamer על ATP. מחקר נוסף המשמש ניסויים elution שאינם כמותיים עם נגזרים ATP שוניםelute aptamer רדיואקטיבי מן agarose ATP, אשר הראה תוצאות שווות ערך למחקר MST זה 18.

איור 2
איור 1: microscale Thermophoresis. (א) ההגדרה הטכנית של טכנולוגית MST מוצגת. אופטיקה להתמקד במרכז נימי זכוכית, ובכך לזהות את אותות הקרינה של המולקולה האופטית הגלויה. ליזר מסוג IR הוא מנוצל כדי ליצור שיפוע טמפרטורה בחלון התצפית של המערכת האופטית. שינויי קרינה יכולים להיות מנוצלים כדי לפקח על תנועת thermophoretic של המולקולות בתמיסה (B) MST זמן-תנועת עקבות פרו fi le מולקולות שיפוע טמפרטורה. הקרינה הראשונית נמדדה במשך 5 שניות בעוד הליזר כבוי. מיתוג על לייזר יוצרת גרדיאנט הטמפרטורה. לאחר p T-הקפיצה המיידיתhase, שבו הצבע uorescent fl יורד תשואת האות שלה על אינדוקציה, תנועת thermophoretic מתרחשת והוא נצפה למשך 30 שניות. לאחר הליזר כבוי, המולקולות מפוזרות בחזרה. תוצאות (C) של ניסוי MST טיפוסי: (שמאל) 16 נימים המכילים ריכוז זהה של מולקולה ניאון ריכוז גדל והולך של ליגנד ללא תווית; עקבות הזמן MST נרשמות מנורמל הקרינה הראשונית שלהם. (מימין) uorescence fl המנורמלת; ההבדל בין F קר F חם זמם נגד הריכוז ליגנד. התאמת עקומת תשואות נתונים זה מחייבים פרמטרים, כגון nity fi af מחייב. מחדש להדפיס באישור Elsevier, שיטות 28; מספר רישיון 3890230800113. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: ניתוח נתונים MST. קו הבסיס (א) תיקן fl מנורמל uorescence הנורמה ΔF (‰), נגזר אות MST TJump, זממו נגד ריכוז ATP (ב מיקרומטר). משוואת היל (EC 50) נתבקשה הולם עקום. ברי השגיאה מייצגים את סטיית התקן מחמש חזרות ביולוגיות. (ב) עלילה הנכנס חלק של הנתונים המוצגים א ערכות נתוני בהתאמה היו מנורמל השבר הכבול, וממוצע הנתונים המנורמלים אלה מוצגים בגרף המחייב. ברי השגיאה מצביעים סטיית ההתקן של 5 חזרות ביולוגיות. (ג) גרף הנכנס שבריר מציג השוואה כמותית (בכושר היל) של הליגנדים שונה aptamer. ברי השגיאה מייצגים את devia התקןtion של שתי חזרות ביולוגיות. (ד) nities af fi עקידת (EC 50) של הליגנדים שונה aptamer. האזור המוצלל הירוק מציין אתר הקישור של aptamer על הקבוצה אדנין של ATP. נתון זה שונה מן Elsevier, שיטות 28; מספר רישיון 3890230800113. ערכות נתונים מהמחקר הקודם reanalyzed והרחיבו בתוך במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: אופטימיזציה Assay עבור ניסויים MST. (א) ספיחת חלבון ואפקטים דבקים ניתן לאתר את הסריקה נימי. צורות שיא לא סדירות, כמו פסגות שטוחות או בצורת U, מצביעות על הדבק של החומר מדגם אל משטח הזכוכית. Cתלוי בסוג הנימים (רגיל, נבחר או הידרופובי) יכול למנוע ספיחת מולקולה, וכתוצאה מכך צורת שיא דרך קבעה. (ב) עקבות הזמן MST גם לשמש בקרת איכות, מאז אגרגטים ניתן לאתר שם בליטות קוצים. תנאי הניסוי יכול להיות מותאם על ידי שיפור מסיסות של מולקולות (למשל, כולל דטרגנטים כגון Pluronic F-127 או ערכים משתנים pH או ריכוזי מלח). צנטריפוגה עשוי לעזור להסיר אגרגטים גדולים. כדי להבטיח איכות נתונים אופטימלית, עקבות MST הזמן צריכות להידמות הדוגמא שניתנה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בקרות איכות:

דבק נוקבים / ספיחה של חומר מדגם למשטחים, וכן תופעות צבירה, יש השפעה דרמטית על איכות נתוני הזיקה. עם זאת, רק המדינה- of-the-art כמה טכנולוגיות מציעות אפשרויות מדויקות ומהירות לפקח למנוע את ההשפעות הללו. MST מציעה בקרת איכות משולבת המאתרות לעזור להתגבר על בעיות אלה, המאפשרים אופטימיזציה בשלבים של ההגדרות הטכניות. מידע חשוב על תופעות דבקות קרינה יכול להיות מופק סריקת הנימים והצורה נימי (שלבי 5.2 ו -7.5), ואילו צבירה / אפקטים ממטרים (שלב 7.7) ניתן לנטר את פרופילי התנועה. בקרות אלה מאפשרים עבור שיפור מתמיד של איכות הנתונים מייצגים שלבים קריטיים בפרוטוקול.

איתור של תופעות ספיחה ופתרון בעיות:

סריקת הנימים מתנהלת בעיקר בתור iniצעד tial כדי לקבוע את המיקום של נימים על בעל מגש ידי סריקת הקרינה לאורך אותו. כל שיא מייצג נימים אחד, המציין את נקודת ההתחלה למדידת MST. בדיקה ויזואלית של צורת השיא מאפשרת לקבוע הספיחה של מולקולות על משטח הזכוכית, אשר מהווה בקרת איכות חיונית כי צריכה להתבצע לפני תחילת ניסוי MST. השכבה-העל של הצורה נימי מאפשרת זיהוי הקל של בברוטליות, צורות שיא מהמורות, או אפילו של פסגות הדומות פניית טופס, וציין את הספיחה / הדבק של מולקולות על משטח הזכוכית הפנימי של הנימים (איור 3 א, פנל עליון). שונה מצופה סוגים נימי (רגיל, נבחר הידרופובי) מסייעים להבטיח מסיסות ספיחה מינימאלית של המולקולות כדי הנימים. נימים צריכים להיבדק על התאמת לפני הניסויים המחייבים. דטרגנטים כגון Tween (.005-.1%) או F127 Pluronic (0.01-0.1%) may גם למנוע תופעות ספיחה נוקבות. אופטימיזציה בשלב זה של הניסוי חיוני לאיכות נתונים גבוהה (השווה איור 3 א, פנל תחתון).

איתור של שפעות קרינה ופתרון בעיות:

וריאציות גובה השיא של הנימים הסרוקות להציע שכבה נוספת של מידע על מאפייני מדגם. הבדלים אקראיים קרינת נימים עשויים, מחד גיסא, לנבוע pipetting שגיאות או, מצד השני, מקורן אגרגטים מדגם גדולים באזור הסריקה שעלול להעלות את הקרינה בצורה דרסטית. דיוק pipetting גבוה הוא חובה כדי למנוע תופעות דילול. ערבוב כל הפתרונות על ידי pipetting למעלה ולמטה מגדילה את הדיוק נוספת. בנוסף, זה חיוני כדי לשמור על החיץ עקבי בכל נימים. אסטרטגיות להתמודד עם תופעות צבירה מוצגות בפסקה מאוחר יותר.

שינויים מערכתיים של קרינה עם increaלשיר ריכוז ליגנד לעתים קרובות מצביע על השפעת שיפור מרווה / ליגנד תלוי. "מבחן SD" מתבצע על מנת להיפלות שינויי קרינה נגרמות מחייבים מנשירת קרינה נוקבת; בדיקה זו מנטרת עוצמות קרינה בתנאי denaturing. במקרה של תופעות קרינה תלויה ליגנד, את עוצמות הקרינה בתנאי denaturing צריכות להיות זהות, ללא תלות בריכוז של titrant. אם פרש עוצמות קרינה עדיין קיים בתנאים אלה, חומר אבד או עקב ספיחה נוקב על קירות צינור או עקב צבירת צנטריפוגה שלאחר מכן.

על מנת לבצע את הבדיקה SD, 10 μl של הראשון ו -10 μl של הצעד דילול ליגנד האחרון הם כל מועברים בקפידה אל צינור טרי המכיל 10 μl של מיקס SD 2x (SDS 4% ו -40 מ"מ DTT). הדגימות הן מעורבות המולקולות הם מפוגלות במשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס. After ממלא את הדגימות לתוך נימים, את עוצמות הקרינה נמדדות. אם אפקט קרינה תלוי ליגנד מזוהה, הנתונים ניתן לנתח באופן ישיר על ידי המידע מחייב להסיק את השינויים בעוצמת הקרינה.

איתור של השפעות צבירה ופתרון בעיות:

באמפי, עקבות MST זמן אחידות מצביעות על השפעות צבירה ו / או משקעים (איור 3B, פנל עליון). חומר מדגם שאינו מצטבר מציג פרופיל תנועה thermophoretic נקי וחלק (איור 3B, פנל תחתון). צנטריפוגה של החומר מדגם לפני השימוש (5-10 דקות ב 14,000 XG), תוספת של דטרגנטים (0.005-.1% Tween-20, 0.01-0.1% Pluronic F-127, או דומה), השימוש BSA ( > 0.5 מ"ג / מ"ל), או שינוי של תנאי חיץ (pH וכוח יוניים) מומלץ כדי למזער את ההשפעות צבירה כדי לייעל את איכות הנתונים. על מנת לקבל נתונים באיכות גבוהה, זההוא חיוני כדי למזער את השפעות הצבירה.

ניתוח נתונים עקום הולם:

פרופיל תנועת thermophoretic מחולק שלבים שונים, אשר יכול להיבדק בנפרד או במקביל. ה- T-הקפיצה מתארת ​​את השינוי הפתאומי תשואת קרינה על שינוי טמפרטורה, מייצג מאפיין של fluorophores. ישיר מחייב בסביבה הקרובה של שינויי fluorophore או קונפורמציה על מחייב מאוד להשפיע על קפיצת T. Thermophoresis האיטי מתייחס לתנועה של מולקולות בתחום הטמפרטורה, המציע מידע על המבנה הכללי של המתחם שנוצר. סוג ברירת המחדל של ניתוח נתונים מעסיק את הגדרת "Thermophoresis + T-קפיצה", ונצל את שניהם התופעות מנת לקבוע את הפרמטרים המחייבים. במקרה שני השלבים יש בכיוונים מנוגדים, מומלץ לנתח את השלבים בנפרד. שים לב: אפקטים בזמן ומינים שונים של Molecules עלול להוביל להבדלים הזיקה של thermophoresis ו- T-קפיצה. סוג נוסף של אפשרות לניתוח הוא ההגדרה הידנית, המאפשרת החקירה של אזורים הספציפיים של פרופיל התנועה. הפרעות עקב צבירה או הסעה ניתן לשלול בדרך זו. על מנת לשפר את איכות נתונים, סמנים ניתן להגדיר לפני אותות צבירה. בחינת thermophoresis מוקדם מייצרת נתונים בדרך כלל עם פחות רעש, מאז הסעה היא תהליך תלוי-זמן. הגדרה ידנית מוקדם זה מומלץ מאוד עבור ניסויים עם כוח ליזר גבוה (80%). לאחר בחירת הגדרת ניתוח נתונים, שני דגמים הולמים משולבים בתוכנת הניתוח ניתן ליישם כדי להתאים את עקומת המחייב. הפונקציה כ"י K ד מהחוק של פעולה המונית היא מתאים 1: 1 מצבי מחייב או עבור אתרי קישור מרובים בעל אותן הזיקה. ד K קבוע דיסוציאציה עצמאית ריכוז מתאר את שיווי המשקל בין Bound ומדינה מאוגדת; וכך, את הזיקה של אתר מחייב ליגנד נמדדה. שווי הריכוז תלוי 50 EC נגזר ממשוואת היל מייצג את המינון האפקטיבי של ליגנד שבו מחצית המולקולות שכותרתו הם במדינת הכבול. התאמת היל צריך להיות מוחל רב-ערכית מודלים מחייב, במיוחד אם הם מאורגנים על בסיס שיתופי.

פקדי האיכות המשולבות לייצג יתרון אחד גדול של MST פני טכנולוגיות כגון SPR או ITC. בקרות אלו מאפשרים אופטימיזציה מהירה וקלה של ההגדרות הטכניות כדי להבטיח איכות נתונים אופטימלית. בנוסף מדידות הזמן יעיל (K ד ב -15 דק ') ואת ההתקנה והקיבוע ללא, MST מציעה הבחירה החופשית של מאגרים, מתיר הערכת אינטראקציות מולקולריות, אפילו lysates וסר 5,42,43. בשל העובדה כי thermophoresis מולקולרי תלוי בגודל, פריצה, ופצצת הידרציה של מולקולות, אין מגבלותבגודל של השותפים באינטראקציה נמדדו במהלך מדידות MST. טווח nity fi af הדינמי, מן בערב עד מ"מ, יחד עם צריכת המדגם הנמוכה, משלים את החוזקות של טכנולוגית MST. ראוי להזכיר כי MST מייצר נתונים מדויקים על פרמטרים מחייבים בסיסיים, כגון זיקה מחייבת, ורכב, ותרמודינאמיקה. עם זאת, MST אינו מאפשר מדידת k על ו k את שיעורים. בנוסף, יש להביא בחשבון כי עבור רוב הניסויים MST, שינוי ניאון יש להוסיף אחד מבני הזוג אינטראקציה. הנתונים שנוצרו הם בהסכם טוב עם טכנולוגיות המדינה- of-the-art, כגון SPR ו- ITC 32,43-46. עם זאת, נתונים אלה הם שבשליטת איכות, הניסויים הם מהירים יותר, והם צורכים פחות חומר. בסך הכל, MST מייצג מאונך טכנולוגיה חזק המדינה- of-the-art טכנולוגיות, עם כמה יתרונות נוספים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CE ו- TS הם עובדי 2bind GmbH, המספקת שירותים אנליטיים biophysical. עמלות פרסום עבור מאמר וידאו זה משולמות על ידי 2bind GmbH.

Acknowledgments

יש המחברים לא בתודות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aptamer binding buffer 20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer IDT, Leuven, Belgium sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-
ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP Sigma Aldrich, Germany  A2383 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
ADP Sigma Aldrich, Germany  A2754 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
AMP Sigma Aldrich, Germany  A2252 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Adenine Sigma Aldrich, Germany  A8626 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
SAM Sigma Aldrich, Germany  A7007 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
dATP Sigma Aldrich, Germany  11934511001 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
CTP Sigma Aldrich, Germany  C1506 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
GTP Sigma Aldrich, Germany  G8877 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Monolith NT.115  NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-G008 Blue/Red Channel
MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-K002
Eppendorf PCR tubes Eppendorf, Germany 30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1 NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2 Synergy Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Linke, P., et al. An Automated Microscale Thermophoresis Screening Approach for Fragment-Based Lead Discovery. J Biomol Screen. 21 (4), 414-421 (2015).
  2. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
  3. Zillner, K., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol Biol. 815, 241-252 (2012).
  4. Zhang, W., Duhr, S., Baaske, P., Laue, E. Microscale thermophoresis for the assessment of nuclear protein-binding affinities. Methods Mol Biol. 1094, 269-276 (2014).
  5. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat Commun. 1, 100 (2010).
  6. Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10656-10659 (2012).
  7. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
  8. Schubert, T., et al. Df31 protein and snoRNAs maintain accessible higher-order structures of chromatin. Mol Cell. 48 (3), 434-444 (2012).
  9. McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
  10. Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-Molecule Binding Aptamers: Selection Strategies, Characterization, and Applications. Front Chem. 4, 14 (2016).
  11. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Anal Chem. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  12. Chang, A. L., McKeague, M., Smolke, C. D. Facile characterization of aptamer kinetic and equilibrium binding properties using surface plasmon resonance. Methods Enzymol. 549, 451-466 (2014).
  13. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  14. Sokoloski, J. E., Dombrowski, S. E., Bevilacqua, P. C. Thermodynamics of ligand binding to a heterogeneous RNA population in the malachite green aptamer. Biochemistry. 51 (1), 565-572 (2012).
  15. Burnouf, D., et al. kinITC: a new method for obtaining joint thermodynamic and kinetic data by isothermal titration calorimetry. J Am Chem Soc. 134 (1), 559-565 (2012).
  16. Mannironi, C., Scerch, C., Fruscoloni, P., Tocchini-Valentini, G. P. Molecular recognition of amino acids by RNA aptamers: the evolution into an L-tyrosine binder of a dopamine-binding RNA motif. RNA. 6 (4), 520-527 (2000).
  17. Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
  18. Huizenga, D. E., Szostak, J. W. A DNA aptamer that binds adenosine and ATP. Biochemistry. 34 (2), 656-665 (1995).
  19. Lee, E. R., Baker, J. L., Weinberg, Z., Sudarsan, N., Breaker, R. R. An allosteric self-splicing ribozyme triggered by a bacterial second messenger. Science. 329 (5993), 845-848 (2010).
  20. Wickiser, J. K., Cheah, M. T., Breaker, R. R., Crothers, D. M. The kinetics of ligand binding by an adenine-sensing riboswitch. Biochemistry. 44 (40), 13404-13414 (2005).
  21. Jucker, F. M., Phillips, R. M., McCallum, S. A., Pardi, A. Role of a heterogeneous free state in the formation of a specific RNA-theophylline complex. Biochemistry. 42 (9), 2560-2567 (2003).
  22. Zhao, Q., Lv, Q., Wang, H. Aptamer fluorescence anisotropy sensors for adenosine triphosphate by comprehensive screening tetramethylrhodamine labeled nucleotides. Biosens Bioelectron. 70, 188-193 (2015).
  23. Zhang, D., et al. A sensitive fluorescence anisotropy method for detection of lead (II) ion by a G-quadruplex-inducible DNA aptamer. Anal Chim Acta. 812, 161-167 (2014).
  24. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule imaging of an in vitro-evolved RNA aptamer reveals homogeneous ligand binding kinetics. J Am Chem Soc. 131 (29), 9866-9867 (2009).
  25. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev Sci Instrum. 81 (8), 083705 (2010).
  26. Zichel, R., Chearwae, W., Pandey, G. S., Golding, B., Sauna, Z. E. Aptamers as a sensitive tool to detect subtle modifications in therapeutic proteins. PLoS One. 7 (2), 31948 (2012).
  27. Baaske, P., Wienken, C. J., Reineck, P., Duhr, S., Braun, D. Optical thermophoresis for quantifying the buffer dependence of aptamer binding. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (12), 2238-2241 (2010).
  28. Entzian, C., Schubert, T. Studying small molecule-aptamer interactions using MicroScale Thermophoresis (MST). Methods. 97, 27-34 (2016).
  29. Valenzano, S., et al. Screening and Identification of DNA Aptamers to Tyramine Using in Vitro Selection and High-Throughput Sequencing. ACS Comb Sci. 18 (6), 302-313 (2016).
  30. Jauset Rubio, M., et al. beta-Conglutin dual aptamers binding distinct aptatopes. Anal Bioanal Chem. 408 (3), 875-884 (2016).
  31. Breitsprecher, D., et al. Aptamer Binding Studies Using MicroScale Thermophoresis. Methods Mol Biol. 1380, 99-111 (2016).
  32. Stoltenburg, R., Schubert, T., Strehlitz, B. In vitro Selection and Interaction Studies of a DNA Aptamer Targeting Protein A. PLoS One. 10 (7), 0134403 (2015).
  33. Kinghorn, A. B., et al. Aptamer Affinity Maturation by Resampling and Microarray Selection. Anal Chem. 88 (14), 6981-6985 (2016).
  34. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (52), 19678-19682 (2006).
  35. Braun, D., Libchaber, A. Trapping of DNA by thermophoretic depletion and convection. Phys Rev Lett. 89 (18), 188103 (2002).
  36. Duhr, S., Arduini, S., Braun, D. Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence. Eur Phys J E Soft Matter. 15 (3), 277-286 (2004).
  37. Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay Drug Dev Technol. 9 (4), 342-353 (2011).
  38. He, K., Dragnea, V., Bauer, C. E. Adenylate Charge Regulates Sensor Kinase CheS3 To Control Cyst Formation in Rhodospirillum centenum. MBio. 6 (3), 00546 (2015).
  39. Brvar, M., et al. Structure-based discovery of substituted 4,5'-bithiazoles as novel DNA gyrase inhibitors. J Med Chem. 55 (14), 6413-6426 (2012).
  40. Pogorelcnik, B., et al. 4,6-Substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as monocyclic catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIalpha targeting the ATP binding site. Bioorg Med Chem. 23 (15), 4218-4229 (2015).
  41. Jhaveri, S., Rajendran, M., Ellington, A. D. In vitro selection of signaling aptamers. Nat Biotechnol. 18 (12), 1293-1297 (2000).
  42. Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. J Vis Exp. (78), (2013).
  43. Ramakrishnan, M., et al. Probing cocaine-antibody interactions in buffer and human serum. PLoS One. 7 (7), 40518 (2012).
  44. Chen, M., et al. Antiviral activity and interaction mechanisms study of novel glucopyranoside derivatives. Bioorg Med Chem Lett. 25 (18), 3840-3844 (2015).
  45. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186 (4,5), 61-67 (2015).
  46. Harazi, A., et al. The Interaction of UDP-N-Acetylglucosamine 2-Epimerase/N-Acetylmannosamine Kinase (GNE) and Alpha-Actinin 2 Is Altered in GNE Myopathy M743T Mutant. Mol Neurobiol. , (2016).

Tags

מיפוי ביוכימיה גיליון 119 אינטראקצית מולקולה-aptamer קטן פרמטרים חייב microscale Thermophoresis מחייב זיקה ורכב תרמודינאמיקה חומצות גרעין אתר קישור
מיפוי אתר הקישור של Aptamer על ATP שימוש microscale Thermophoresis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Entzian, C., Schubert, T. Mapping… More

Entzian, C., Schubert, T. Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (119), e55070, doi:10.3791/55070 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter