Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kartlegging av bindingssetet på en Aptamer på ATP Bruke mikro termodiffusjon

Published: January 7, 2017 doi: 10.3791/55070
Automatic Translation
1, 1
12bind GmbH

Introduction

Interaksjon mellom molekylene er grunnlaget for naturen. Derfor forskere i mange felt av grunnleggende og anvendt forskning prøve å forstå de grunnleggende prinsippene i molekylære interaksjoner av ulike slag. Mikro termodiffusjon (MST) gjør det mulig for forskere å utføre raske, presise, kostnadseffektive og kvalitetssikret karakterisering av molekylære interaksjoner i løsning, med et fritt valg av buffere. Det er allerede mer enn 1000 publikasjoner bruke MST, fra 2016 alene, som beskriver ulike typer analyser, inkludert bibliotek screenings, bindende event valideringer, konkurranseanalyser, og eksperimenter med flere bindingspartnere 1-8. Generelt tillater MST studiet av de klassiske bindende parametere, slik som bindingsaffinitet (pM til mM), støkiometri, og termodynamikk, av en hvilken som helst form for molekylær interaksjon. En stor fordel med MST er evnen til å studere bindings hendelser uavhengig av størrelsen på interaksjonspartnere. selv utfordrende interaksjoner mellom små nukleinsyre aptamerer (15-30 nt) og mål som små molekyler, narkotika, antibiotika, eller metabolitter kan kvantifiseres.

Nåværende state-of-the-art teknologi for å karakterisere aptamer-målet interaksjoner er enten lab-intens og svært komplekse eller unnlater å kvantifisere aptamer-lite molekyl interaksjoner 9,10. Surface plasmonresonans (SPR) -baserte analyser 11,12 og virkelig label-free kalori tilnærminger, for eksempel Isoterm Titrering kalorimetri (ITC) 13-15, isokratisk eluering 16, likevekt fi filtrering 17,18, in-line sondering 19, gel- skifte analyser, stopped- fl ow fl uorescence spektroskopi 20,21, fluorescens anisotropi (FA) 22,23, single-molekyl fl uorescence bildebehandling 24,25, og Bio-lag interferometri (BLI) 26 er også enten upresis eller uforenlig med aptamer-lite molekyl interaksjoner. andre Principal utgaver av disse metodene er lav følsomhet, høy prøven forbruk, immobilisering, massetransportbegrensninger på overflater, og / eller buffer restriksjoner. Bare et fåtall av disse teknologiene gir integrerte kontroller for aggregering og adsorpsjon effekter.

MST representerer et kraftig verktøy for forskere å overvinne denne begrensningen for å studere interaksjoner mellom aptamerer og små molekyler 27-29, samt andre mål, for eksempel proteiner 30-33. Teknologien baserer seg på bevegelse av molekyler gjennom temperaturgradienter. Dette rettet bevegelse, kalt "termodiffusjon", avhenger av størrelse, ladning, og hydrering skall av molekylet 34,35. Binding av en ligand til molekylet vil direkte endre i det minste én av disse parametre, noe som resulterer i en endret termoforetiske mobilitet. Ligander med små størrelser kan ikke ha store konsekvenser i forhold til størrelse endring fra ubundet til bundet tilstand, men de kan ha dr amatic effekter på hydrering skall og / eller kostnad. Endringene i den termoforetiske bevegelighet av molekylene etter interaksjon med bindingspartneren muliggjør kvantifisering av grunnleggende bindingsparametere 2,7,34,36,37.

Som vist i figur 1A, MST enheten består av en infrarød laser fokusert på prøven innenfor glasskapillærer ved hjelp av de samme optikk som for fluorescensdeteksjon. Den termo bevegelse av proteiner via den iboende fl uorescence av tryptofaner 6 eller av et fluorescensmerket interaksjon partner 3,8 kan overvåkes mens laseren etablerer en temperaturgradient (aT på 2-6 ° C). Den resulterende temperaturforskjell på plass, AT, fører til uttømming, eller oppsamling av molekyler i området av forhøyet temperatur, som kan kvantifiseres ved Soret COEF fi sient (S T):

g "/>

c varm utgjør den konsentrasjon i det oppvarmede område, og c kulde er konsentrasjonen i den innledende kald region.

Som vist i figur 1B, en typisk MST eksperimentresultatene i en MST bevegelse profil (tid kurve), som består av forskjellige faser, som kan separeres ved deres respektive tidsrammer. Den innledende fluorescensen måles i de første 5 s i fravær av temperaturgradienten for å definere den nøyaktige utgangs fluorescensen og for å se etter fotobleking eller photoenhancement. Temperatur Jump (T-Jump) representerer den fasen hvor fluorescens endringene før termo bevegelse. Denne første nedgang i fluorescens er avhengig av varmeavhengige endringer av fl uorophore kvanteutbytte. Den termodiffusjon fase følger, hvor fluorescens-lavere (eller høyere) på grunn av den termoforetiske bevegelighet av molekylene inntil steady-state fordeling er oppnådd.Det motsatte TJump og samtidig tilbakediffusjon av fl uorescent molekyler kan observeres som vist i figur 1B etter at laseren er skrudd av. For å få tilgang til basisbindingsparametere, blir forskjellige molare forhold av interaksjonspartnere analysert og sammenlignet. Vanligvis er 16 forskjellige forhold studert i en MST eksperiment, mens den optiske synlig molekylet holdes konstant og er utstyrt med en økende mengde av umerket ligand. Samspillet mellom de to bindingspartnere induserer endringer i termodiffusjon, og således i den normaliserte fl uorescence, F norm, som beregnes som følger:

ligning

F varm og F kald representerer gjennomsnitt fl uorescence intensiteter på de fi nert tidspunkter av MST spor. Bindingsaffiniteter (K d eller EC 50 verdier) kan beregnes ved curve montering (figur 1C).

Samlet er MST et kraftig verktøy for å studere molekylære interaksjoner av noe slag. Dette manuskriptet har en protokoll for å karakterisere utfordrende samspill mellom den lille molekylet adenosintrifosfat (ATP, 0,5 kDa) og 25-nt kort ssDNA aptamer DH25.42 (7,9 kDa). I løpet av manuskriptet er bindingssetet for aptamer på den ATP-molekylet tilordnet ned til adenin gruppen av ATP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Klargjøring av Aptamer Working Stock

  1. Følg produsentens instruksjoner og oppløse oligonukleotid (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sekvens fra referanse 18) i vann, og nådde en 100-mikrometer endelig konsentrasjon.
  2. Klargjør aptamer arbeidsløsning ved å fortynne oligonukleotid lager til 200 nM med bindingsbuffer (20 mM Tris, pH 7,6, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,01% Tween 20).
  3. Inkuber blandingen i 2 minutter ved 90 ° C, la prøven umiddelbart avkjølt på is, og bruk prøven ved romtemperatur.

2. Fremstilling av liganden Fortynning Series

  1. For hver ligand (adenosin trifosfat (ATP), adenosindifosfat (ADP), adenosin-monofosfat (AMP), adenin, guanosin trifosfat (GTP), cytosin-trifosfat (CTP), deoksyadenosin-trifosfat (dATP), og S-adenosylmethionin (SAM) ; 10 mM lager hver), utarbeide en 16-trinns serie fortynningenepå i 200 mL mikroreaksjonsrørene.
    MERK: sentrifugering av ligand aksjer for 5 min ved 14 000 xg kan bidra til å fjerne aggregater. Lavt volum, er lav binding reaksjonsrørene anbefales å unngå adsorpsjon av molekyler til rørveggene.
  2. Begynn med en maksimal konsentrasjon på minst 50 ganger høyere enn den estimerte affinitet og redusere ligandkonsentrasjonen med 50% på hver fortynning trinn.
    MERK: Konsentrasjonen finder verktøy implementert i styringsprogramvaren simulerer bindende data og hjelper til med å finne den rette konsentrasjonsområde for fortynning serien.
  3. Fyll 20 ul av liganden lager (10 mM) i røret 1. Tilsett 10 ul bindingsbuffer aptamer inn i mikroreaksjonsrørene 2 til 16.
  4. Overfør 10 mL av rør 1 til rør 2 og bland godt ved å pipettere opp og ned flere ganger. Overfør 10 ul til det neste røret, og gjenta denne fortynning for de resterende rør.
  5. Kast 10 pl skytende fra det siste røret. Unngå enhver bUffer utvanningseffekter. Bufferen i røret 1 og i rørene 2-16, må være identisk.

3. Utarbeidelse av Final Reaction Mix

  1. Fremstille de individuelle bindende reaksjoner med et volum på 20 ul (10 ul aptamer arbeidsløsning + 10 ul av de respektive ligand fortynning) for å minimalisere feil pipettering. Et volum på bare 4 pl er SUF fi lig å fi ll kapillær.
  2. Tilsett 10 ul av 200 nM aptamer arbeidsoppløsning til 10 ul av hver fortynning ligand og bland godt ved å pipettere opp og ned flere ganger.
  3. Inkuber prøvene i 5 min ved romtemperatur og fi ll prøvene til standardkapillærer ved å dyppe kapillærene inn i prøven. Lengre inkubasjonstider kan være nødvendig for noen interaksjoner; men er 5 min tilstrekkelig for de fleste. Trykk kapillærene bare på sidene, ikke på den midterste delen, der optisk måling vil bli tatt.
  4. Plasser kapillærer bort på the kapillær skuffen og starte MST-enheten.

4. Starte MST Device

MERK: Enheten gir to forhåndsinstallerte programvarepakker, den '' kontroll "programvare for det tekniske oppsettet av de eksperimentelle forhold og '' analyse" programvare for tolkningen av de produserte data.

  1. Før du setter kapillær skuffen inn i MST-enheten, start kontroll programvare og justere den generelle ønsket temperatur ved å velge '' aktivere manuell temperaturkontroll "i '' temperaturkontroll" rullegardinmenyen. Juster temperaturen til 25 ° C på denne måten.
    MERK: MST instrumenter kan være temperert 22-45 ° C.
  2. Vent til temperaturen å nå forventet nivå og deretter plassere kapillær skuffen inn i MST-enheten.
  3. Sett LED kanalen til '' røde "for Cy5 fargestoffer og justere LED makt til å få en fl uorescence signal fra 300 til 1000 fluorescens enheter ved MST-enheten med en standard sensor. 25% LED-strømmen blir anvendt i denne studien.
    MERK: 6000 til 18.000 fluorescens enheter er anbefalt for MST med høy følsomhet sensor.

5. Capillary Scan

  1. Gjennomføre en kapillær scan for å sjekke ulike kvalitetsaspekter av utvalget ved å velge kapillær posisjon på "kontroll" software og klikke på "start cap scan" før start MST målingen.
  2. Inspiser kapillær scan for fluorescens forbedring / leskende og stikker effekter (U-formet eller flat topper) i programvaren.
    MERK: Flere detaljer om deteksjon og håndtering av fluorescens og stikker effekter kan bli funnet i diskusjonen.

6. MST Måling

MERK: Før du starter MST måling, sørg for å utelukke stikker effekter, forbedring / leskende effekter, ellerpipettering feil, og sørge for at kapillær skanningen viser at fl uorescence signalet er SUF fi ektiv. For flere detaljer, se diskusjonen.

  1. Tildele ligandkonsentrasjoner fra fortynningsserie til den respektive kapillar-stilling i '' kontroll "software Betrakt fortynningen trinnet med å blande aptamer og ligand. (1: 1).
  2. Oppgi den høyeste konsentrasjonen av ligand (5 mm) for kapillær # 1, velger du riktig fortynning type (her, 1: 1), klikk på den maksimale konsentrasjonen, og bruke dra-funksjon for å automatisk tildele de resterende konsentrasjoner i kapillærer # 2 16. Den laveste konsentrasjon er 152,6 nM.
  3. Angi konsentrasjonen av fl uorescent aptamer (her, 100 nM) i den respektive seksjon i styringsprogramvaren.
  4. Bruk standardinnstillingene, som oppdager fl uorescence i 5 sek, registrere MST i 30 sekunder, og ta opp fluorescens i ytterligere 5 sek etter inaktivering av laser t o overvåke tilbake diffusjon av molekyler.
  5. Juster lasereffekt til 20% i den respektive seksjon i styringsprogramvaren.
    NB: For å få den beste signal-til-støy-forholdet og for å unngå uspesifikke effekter, er en lasereffekt på 20-40% anbefales. I spesielle tilfeller kan en høyere lasereffekt være nødvendig for å få en god separasjon av ubundet og bundet molekyler.
  6. Lagre forsøket etter å ha valgt målmappen og starte MST målingen ved å trykke på '' Start MST måling "-knappen.
    MERK: .ntp filen vil bli generert i målmappen. Ved hjelp av dette oppsettet, varer en måling 10-15 min.
  7. Gjenta den eksperimentelle fremgangsmåte i det minste to ganger for en mer nøyaktig bestemmelse av EC 50 verdi.
    MERK: For å teste den tekniske reproduserbarhet, kan de samme kapillærer skal skannes flere ganger (teknisk repetisjoner).

7. MST Data Analysis

nt "> MERK: analyse programvare muliggjør analyse av data på fl y under målingen Analysen programvare plotter MST tids spor og endringer i normaliserte fl uorescence (F norm) versus ligandkonsentrasjonen 37..

  1. Start MST analyseprogramvare (MO.Affinity Analysis) og laste .ntp filen fra målmappen. Velg "MST" som analysetypen i datavalgmenyen.
    MERK: I tilfelle av ligand-avhengige fluorescens effekter, kan den innledende fluorescens bli valgt for analyse.
  2. Legg den respektive tekniske eller biologiske run (e) til en ny analyse av dra-og-slipp eller ved å trykke på "+" knappen under respektive eksperimentelle løp.
  3. Trykk på informasjonsknappen under den respektive eksperimentelle løp for å innhente informasjon om egenskapene til forsøket, MST spor, kapillær scan, kapillær form, innledende fluorescens, og bleking rate.
    MERK: Disse rådata kan alså skal inspiseres i senere trinn av analysen.
  4. Inspiser visuelt MST spor for aggregering og nedbør effekter, synlig som humper og pigger.
    MERK: For mer informasjon om deteksjon og håndtering av aggregering effekter, lese diskusjonen.
  5. Inspiser kapillær skanning og kapillær form overlegg for adsorpsjon effekter, synlig som flatet eller U-formede topper. Inspiser kapillær scan og den innledende fluorescens for fluorescens-effekter. Inspiser bleking sats for fotobleking effekter.
  6. Bytt til dose-responsmodus og endre analysen innstillingen til "ekspert" modus ved å trykke på den respektive knappen. Velg "T-Jump" som MST evaluering strategi.
  7. Velg "Hill" modell for kurve sittende. Bindingsparametere vil automatisk bli beregnet. Normalisere data ved å velge den aktuelle type normalisering i "sammenlign resultatene" -menyen. eksporteredata enten som en .xls eller PDF.
    MERK: Tabellen under bindingen grafen oppsummerer de beregnede bindende parametere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne studien ble MST brukt for å karakterisere bindingssetet av DH25.42 DNA aptamer 18 på ATP. I motsetning til andre studier som karakteriserer interaksjonen av ATP eller ATP-ligne små molekyler med proteiner tilfeldig merket med en eller flere fluoroforer 38-40, omfatter denne studien en merket versjon av det 7,9 kDa ssDNA aptamer med en Cy5 molekyl på 5 'enden . Forskjellige ATP-derivater og beslektede molekyler, som alle er forskjellig fra ATP i ulike posisjoner, ble brukt til å kartlegge bindingssetet på den ATP-molekylet. Fortynningsserie (i 16 trinn, noe som reduserer ligandkonsentrasjonen med 50% hver) av de forskjellige ligander ble fremstilt og blandet med en konstant mengde av Cy5-merket aptamer. Prøvene ble analysert på standard-kapillarer på 25% LED og 20% ​​lasereffekt. Bevegelsesprofiler (MST tidstraser) ble registrert og fluorescens-enheter, avledet fra T-Jump fase, ble plottet mot liganden konsentrasjonerasjon (sammenlign figur 1C). Kurvetilpasning ble foretatt anvendelse av Hill-ligningen, noe som resulterer i EC50-verdier. I 5 uavhengige biologiske repetisjoner (4 forskjellige operatører, 2 forskjellige aptamer aksjer, 2 forskjellige ATP aksjer), viser ATP-aptamer interaksjon en negativ binding amplitude på 6 til 13 enheter og en gjennomsnittlig EC 50 verdi på 52,3 ± 5,0 mikrometer (Figur 2A ). Feilfelt i bindingen grafer og "±" presentert i interesse dataene representerer standardavviket av 5 biologiske repetisjoner (5 uavhengige målinger i en annen kapillar). Tidligere rapporterte slektskap for samspillet av DH25.42 aptamer med [2,8,5'- 3 H] adenosin og ATP agarose var sammenlignbare. Interaksjonen mellom radioaktivt merkede adenosin med aptamer ble kvantifisert ved en sentrifugal filteranalyse, og en affinitet (Kd) 6 ± 3 pM ble bestemt. Isokratisk eluering eksperimenter med ATP immobiliseringsert til agarose resulterte i en affinitetskonstant (Kd) av 13 uM 18,41.

For en bedre side-ved-side-sammenligning, kan dataene normalisert til brøkdel av kompleksmolekyler (fraksjon bundet, FB) ved hjelp av følgende ligning:
ligning
hvor verdien (c) er den MST målte verdien for konsentrasjonen c, fritt er den MST verdi for den ikke-bundne tilstand (laveste konsentrasjon), og kompleks er MST verdien for fullstendig bundet tilstand (figur 2B). Denne normaliseringen gjør det enkelt å sammenlikne resultatene fra forskjellige ligander i en graf, som vist i figur 2C. De påviste af fi miljøene av ADP (63,6 ± 5,9 mikrometer i biologiske duplikater), AMP (91,6 ± 9,1 mikrometer i biologiske duplikater) og Sam (44,4 ± 3,2 mikrometer i biologiske duplikater), som skiller seg fra ATP i number av fosfatgrupper, innebærer at denne posisjonen har ingen eller bare mindre innflytelse på binding oppførselen til aptamer (figur 2C og D). OH-gruppen ved C2-karbonet i ribose av ATP kan også utelukkes fra å være den store bindingssetet, som dATP ble også bundet av aptamer med en noe redusert af fi nity (64,4 ± 6,1 uM i biologiske duplikater). Endring av purin gruppe av ATP til den pyrimidin gruppen CTP resulterte i ikke-binding av aptamer, noe som viser viktigheten av denne gruppen for interaksjonen. Den aptamer bundet til adenin med en affinitet på 141,7 ± 9,4 uM (i biologiske duplikater), som viser at bindingsstedet må være i denne del av ATP-molekylet. De purin-molekyler GTP og ATP skiller seg i det grønne skraverte område vist på figur 2D, som representerer den viktigste bindingssetet av det aptamer på ATP. En annen studie brukt ikke-kvantitative elusjonstester eksperimenter med ulike ATP derivatereluere en radiomerket aptamer fra ATP agarose, som viste sammenlignbare resultater til denne MST studien 18.

Figur 2
Figur 1: mikro termodiffusjon. (A) Den tekniske oppsettet av MST-teknologi vises. Optikken fokuserer på midten av glasskapillærer, for derved å detektere fluorescens-signalet av det optisk synlige molekylet. Et IR-laser anvendes for å etablere en temperaturgradient i den observasjonsvindu av det optiske systemet. Endringer i fluorescens kan benyttes til å overvåke den termoforetiske bevegelighet av molekylene i oppløsning (B) MST tids trase-bevegelsen fi l av molekyler i en temperaturgradient. Den innledende fluorescensen måles i 5 sekunder mens laseren er slått av. Innkopling av laseren frembringer en temperaturgradient. Etter den umiddelbare T-Jump phase, hvori fl uorescent fargestoff avtar dens signal utbytte ved varmeinduksjon, tar den termoforetiske bevegelighet sted og observeres i 30 sekunder. Etter at laseren er skrudd av, molekylene diffunderer tilbake. (C) Resultater fra en typisk MST eksperiment: (venstre) 16 kapillærer som inneholder samme konsentrasjon av fluorescerende molekyl og en økende konsentrasjon av umerket ligand; MST tids spor blir registrert og normalisert til sin opprinnelige fluorescens. (Høyre) Normalisert fl uorescence; differansen mellom F kald og varm F er plottet mot konsentrasjonen av liganden. En kurve av disse dataene gir bindende parametere, slik som bindende af fi fellesskapet. Re-print med tillatelse fra Elsevier, Methods 28; lisensnummer 3890230800113. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: MST dataanalyse. (A) Referanse korrigerte normaliserte fl uorescence AF norm (‰), avledet fra MST TJump signal, er plottet mot den ATP-konsentrasjonen (i uM). The Hill ligning (EC50) ble påført for kurvetilpasning. Feilstolpene representerer standardavvik fra fem biologiske gjentas. (B) Fraksjon-bundet plot av dataene som er vist i A. De respektive datasettene ble normalisert til den fraksjon bundet, og gjennomsnittet av disse normaliserte data blir presentert i grafen binding. De feilfelt indikerer standardavviket av 5 biologiske gjentas. (C) Den fraksjon-bundet graf viser en kvantitativ sammenligning (Hill passe) av de forskjellige ligander til aptamer. De feilfelt representerer standard avviketsjon av to biologiske gjentas. (D) Bindende af fi miljøene (EC 50) forskjellige ligander til aptamer. Den grønne skraverte området indikerer bindingssetet av aptamer på adenin gruppen av ATP. Dette tallet er endret fra Elsevier, Methods 28; lisensnummer 3890230800113. datasett fra forrige undersøkelse er reanalysert og utvidet i denne studien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Analyse optimalisering for MST eksperimenter. (A) Protein adsorpsjon og stikkende virkninger kan påvises i kapillaren skanningen. Uregelmessig toppenes form, for eksempel flate eller U-formede topper, indikerer klebing av prøvematerialet til glassoverflaten. Chengende kapillar-type (standard, premie, eller hydrofobe) kan forhindre molekyl adsorpsjon, noe som resulterer i en vanlig topp form. (B) MST tids spor også fungere som en kvalitetskontroll, ettersom aggregater kan oppdages det som humper og pigger. De eksperimentelle betingelser kan optimaliseres ved å forbedre løseligheten av molekyler (f.eks, inkludert vaskemidler så som Pluronic F-127 eller varierende pH-verdier eller saltkonsentrasjon). Sentrifugering kan bidra til å fjerne større aggregater. For å sikre optimal datakvalitet, bør MST tids spor ligne den gitte eksempel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvalitetskontroller:

Uspesifikke klebing / adsorpsjon av prøvemateriale til overflatene, i tillegg til aggregering effekter, ha en dramatisk innvirkning på kvaliteten av de data affinitet. Men bare noen få state-of-the-art teknologi tilbyr nøyaktige og raske alternativer for å overvåke og unngå disse effektene. MST tilbyr integrerte kvalitetskontroller som gjenkjenner og bidrar til å overvinne disse problemene, slik at for trinnvis optimalisering av tekniske oppsettet. Viktig informasjon om stikker og fluorescens effekter kan utvinnes fra kapillær skanning og kapillær formen (trinn 5.2 og 7.5), mens aggregering / nedbørs effekter (trinn 7.7) kan overvåkes i bevegelsesprofiler. Disse kontrollene gjør det mulig for konstant forbedring av datakvalitet og representerer kritiske trinn i protokollen.

Påvisning av adsorpsjon effekter og feilsøking:

Den kapillære skanningen er primært gjennomført som en initial trinn for å bestemme posisjonen av kapillarene på brettholderen ved å skanne fluorescens over den. Hver topp representerer en kapillar, som indikerer startpunktet for MST målingen. Visuell inspeksjon av toppen form muliggjør bestemmelse av adsorpsjon av molekyler med glassoverflaten, som er et viktig kvalitetskontrollen som skal utføres før MST eksperimentet. Den kapillære form overlegg tillater enkel påvisning av flate, humpete toppenes form, eller til og med av topper som ligner en U-form, noe som indikerer at adsorpsjonen / klebing av molekylene til den indre glassoverflaten av kapillaren (figur 3A, øvre panel). Annerledes belagt kapillær typer (standard, premium og hydrofobe) bidrar til å sikre løselighet og minimal adsorpsjon av molekyler til kapillærene. Kapillærer bør testes for deres egnethet før bindende eksperimenter. Detergenter så som Tween (0,005 til 0,1%) eller Pluronic F127 (0,01-0,1%) may også hindre uspesifikke adsorpsjon effekter. Optimalisering på dette trinn av forsøket er vesentlig for høy datakvalitet (sammenlign figur 3A, nedre panel).

Påvisning av fluorescens effekter og feilsøking:

Variasjoner i topphøyde for de skannede kapillærene tilby et annet lag av informasjon på eksempel egenskaper. Tilfeldige forskjeller i kapillar fluorescens kan på den ene side skyldes pipettering feil eller, på den annen side stammer fra store prøvestørrelser i skanne region som kan øke fluorescensen drastisk. Høy pipettering nøyaktighet er obligatorisk å unngå utvanningseffekten. Blanding alle løsninger ved å pipettere opp og ned øker nøyaktigheten ytterligere. I tillegg er det viktig å holde buffer konsekvent i hver kapillar. Strategier for å håndtere aggregering effekter er presentert i et senere avsnitt.

Systemiske endringer av fluorescens med økt selvtilsynge ligand konsentrasjon ofte indikere ligand avhengige leskende / ekstrautstyr effekter. Den "SD Test" er utført for å diskriminere bindende-indusert fluorescens endringer fra uspesifikke fluorescens tap; denne testen overvåker fluorescensstyrkene henhold denaturerende forhold. I tilfelle av ligand-avhengige fluorescens effekter, bør fluorescensstyrkene henhold denaturerende betingelse være identisk, uavhengig av konsentrasjonen av titrant. Hvis forskjellen i fluorescens intensitet fremdeles er tilstede under disse betingelser, ble materialet enten tapt på grunn av uspesifikk adsorpsjon til rørveggene eller på grunn av aggregering og påfølgende sentrifugering.

For å kunne utføre SD Test, blir 10 ul av den første og 10 pl av den siste liganden fortynningstrinnet hver forsiktig overført til et friskt rør inneholdende 10 ul av en 2 x SD Bland (4% SDS og 40 mM DTT). Prøvene blandes og molekylene er denaturert i 5 minutter ved 95 ° C. after fylling av prøvene inn i kapillærene, blir fluorescensstyrkene målt. Dersom en ligand-avhengig fluorescens effekt er oppdaget, kan dataene bli analysert direkte ved binding informasjon utledet fra fluorescensintensiteten endringer.

Påvisning av aggregering effekter og feilsøking:

Humpete, ujevn MST tids spor indikerer aggregering og / eller nedbør effekter (figur 3B, øvre panel). Non-aggregert prøvematerialet viser en ren og glatt termo bevegelse profil (figur 3B, nedre panel). Den sentrifugering av prøvemateriale før bruk (5-10 minutter ved 14 000 x g), tilsetning av detergenter (0,005 til 0,1% Tween-20, 0,01-0,1% Pluronic F-127, eller lignende), bruk av BSA ( > 0,5 mg / ml), eller endringen av bufferbetingelsene (pH og ionestyrke) anbefales for å unngå aggregering effekter og for å optimalisere datakvalitet. For å oppnå data av høy kvalitet, deter viktig for å minimalisere virkningene aggregering.

Dataanalyse og kurvetilpasning:

En termo bevegelse profilen er delt inn i forskjellige faser, som kan inspiseres, enten separat eller samtidig. T-Jump beskriver den plutselige endringen i fluorescens utbytte på temperaturendringer, som representerer et karakteristisk trekk fluorophores. Direkte binding i de nære omgivelser av fluoroforen eller eksteriør endringer ved å binde sterkt påvirke T-Jump. Jo saktere termodiffusjon refererer til bevegelse av molekyler i temperaturen feltet, og tilbyr informasjon om den overordnede strukturen av den dannede kompleks. Standard type dataanalyse benytter "termodiffusjon + T-Jump" setting, utnytte begge fenomener å bestemme bindende parametere. I tilfelle de to faser har motsatte retninger, er det anbefalt å analysere fasene hver for seg. Vær oppmerksom på at tids effekter og ulike arter av Molecules kan føre til forskjeller i affinitet av termodiffusjon og T-Jump. En annen type analyse alternativ er den manuelle innstilling som muliggjør undersøkelse av spesifikke regioner av bevegelsesprofilen. Forstyrrelser på grunn av aggregering eller konveksjon kan utelukkes på denne måten. For å bedre datakvaliteten, kan pekere settes før aggregering signaler. Undersøkelse av den tidlige termodiffusjon som vanligvis frembringer data med mindre støy, siden konveksjon er en tidsavhengig prosess. Denne tidlige manuelle innstillingen anbefales for eksperimenter med høy lasereffekt (80%). Ved å velge de dataanalyse innstillingen kan to sluttende modeller som er integrert i analyseprogramvare anvendes for å passe til bindingskurve. Passformen funksjon for K d fra massevirkningsloven er egnet for 1: 1 innbindingsmodi eller for flere bindingsseter som innehar samme affinitet. Konsentrasjonen uavhengige dissosiasjonskonstanten K d beskriver likevekten mellom bound og ubundet tilstand; således, er affiniteten av et bindingssete for en ligand målt. Den konsentrasjonsavhengig EC50 verdi utledet fra den Hill ligningen representerer den effektive dose av en ligand ved hvilken halvparten av de merkede molekyler er i bundet tilstand. The Hill fit skal brukes til flerverdige bindende modeller, spesielt hvis de er samarbeidsvillige.

De integrerte kvalitetskontroller representerer en stor fordel av MST i løpet av teknologier som SPR eller ITC. Disse kontrollene kan for rask og enkel optimalisering av tekniske oppsettet for å sikre optimal datakvalitet. I tillegg til de tidseffektive målinger (K D i 15 min) og immobilisering fritt oppsett, tilbyr MST fritt valg av buffere, tillater vurdering av molekylære interaksjoner, selv i lysatene og sera 5,42,43. På grunn av det faktum at molekyl termodiffusjon avhenger av størrelse, ladning, og hydrering skall av molekyler, er det ingen begrensningeri størrelsen av de målte interaksjonspartnere under MST målinger. Den dynamiske af fi NITY utvalg, fra PM til mM, sammen med det lave utvalget forbruk, fullfører styrkene til MST teknologi. Det er verdt å nevne at MST genererer presise data for grunnleggende bindingsparametere, som for eksempel bindingsaffinitet, støkiometri, og termodynamikk. Imidlertid, MST ikke tillater måling av k i og k av priser. I tillegg må man tenke på at for de fleste eksperimenter MST, må en fluorescerende modifikasjon legges til en av interaksjonspartnere. De genererte data er i god overensstemmelse med state-of-the-art teknologi, som SPR og ITC 32,43-46. Disse data er kvalitetssikret, forsøkene er raskere, og de bruker mindre materiale. Samlet sett representerer MST en kraftig teknologi vinkelrett på state-of-the-art teknologi, med noen ekstra fordeler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CE og TS er ansatte i 2bind GmbH, som gir biofysiske analysetjenester. Publiserings avgifter for denne video-artikkelen er betalt av 2bind GmbH.

Acknowledgments

Forfatterne har ingen bekreftelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aptamer binding buffer 20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer IDT, Leuven, Belgium sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-
ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP Sigma Aldrich, Germany  A2383 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
ADP Sigma Aldrich, Germany  A2754 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
AMP Sigma Aldrich, Germany  A2252 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Adenine Sigma Aldrich, Germany  A8626 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
SAM Sigma Aldrich, Germany  A7007 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
dATP Sigma Aldrich, Germany  11934511001 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
CTP Sigma Aldrich, Germany  C1506 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
GTP Sigma Aldrich, Germany  G8877 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Monolith NT.115  NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-G008 Blue/Red Channel
MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-K002
Eppendorf PCR tubes Eppendorf, Germany 30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1 NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2 Synergy Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Linke, P., et al. An Automated Microscale Thermophoresis Screening Approach for Fragment-Based Lead Discovery. J Biomol Screen. 21 (4), 414-421 (2015).
  2. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
  3. Zillner, K., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol Biol. 815, 241-252 (2012).
  4. Zhang, W., Duhr, S., Baaske, P., Laue, E. Microscale thermophoresis for the assessment of nuclear protein-binding affinities. Methods Mol Biol. 1094, 269-276 (2014).
  5. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat Commun. 1, 100 (2010).
  6. Seidel, S. A., et al. Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10656-10659 (2012).
  7. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
  8. Schubert, T., et al. Df31 protein and snoRNAs maintain accessible higher-order structures of chromatin. Mol Cell. 48 (3), 434-444 (2012).
  9. McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
  10. Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-Molecule Binding Aptamers: Selection Strategies, Characterization, and Applications. Front Chem. 4, 14 (2016).
  11. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Anal Chem. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  12. Chang, A. L., McKeague, M., Smolke, C. D. Facile characterization of aptamer kinetic and equilibrium binding properties using surface plasmon resonance. Methods Enzymol. 549, 451-466 (2014).
  13. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  14. Sokoloski, J. E., Dombrowski, S. E., Bevilacqua, P. C. Thermodynamics of ligand binding to a heterogeneous RNA population in the malachite green aptamer. Biochemistry. 51 (1), 565-572 (2012).
  15. Burnouf, D., et al. kinITC: a new method for obtaining joint thermodynamic and kinetic data by isothermal titration calorimetry. J Am Chem Soc. 134 (1), 559-565 (2012).
  16. Mannironi, C., Scerch, C., Fruscoloni, P., Tocchini-Valentini, G. P. Molecular recognition of amino acids by RNA aptamers: the evolution into an L-tyrosine binder of a dopamine-binding RNA motif. RNA. 6 (4), 520-527 (2000).
  17. Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
  18. Huizenga, D. E., Szostak, J. W. A DNA aptamer that binds adenosine and ATP. Biochemistry. 34 (2), 656-665 (1995).
  19. Lee, E. R., Baker, J. L., Weinberg, Z., Sudarsan, N., Breaker, R. R. An allosteric self-splicing ribozyme triggered by a bacterial second messenger. Science. 329 (5993), 845-848 (2010).
  20. Wickiser, J. K., Cheah, M. T., Breaker, R. R., Crothers, D. M. The kinetics of ligand binding by an adenine-sensing riboswitch. Biochemistry. 44 (40), 13404-13414 (2005).
  21. Jucker, F. M., Phillips, R. M., McCallum, S. A., Pardi, A. Role of a heterogeneous free state in the formation of a specific RNA-theophylline complex. Biochemistry. 42 (9), 2560-2567 (2003).
  22. Zhao, Q., Lv, Q., Wang, H. Aptamer fluorescence anisotropy sensors for adenosine triphosphate by comprehensive screening tetramethylrhodamine labeled nucleotides. Biosens Bioelectron. 70, 188-193 (2015).
  23. Zhang, D., et al. A sensitive fluorescence anisotropy method for detection of lead (II) ion by a G-quadruplex-inducible DNA aptamer. Anal Chim Acta. 812, 161-167 (2014).
  24. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule imaging of an in vitro-evolved RNA aptamer reveals homogeneous ligand binding kinetics. J Am Chem Soc. 131 (29), 9866-9867 (2009).
  25. Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev Sci Instrum. 81 (8), 083705 (2010).
  26. Zichel, R., Chearwae, W., Pandey, G. S., Golding, B., Sauna, Z. E. Aptamers as a sensitive tool to detect subtle modifications in therapeutic proteins. PLoS One. 7 (2), 31948 (2012).
  27. Baaske, P., Wienken, C. J., Reineck, P., Duhr, S., Braun, D. Optical thermophoresis for quantifying the buffer dependence of aptamer binding. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (12), 2238-2241 (2010).
  28. Entzian, C., Schubert, T. Studying small molecule-aptamer interactions using MicroScale Thermophoresis (MST). Methods. 97, 27-34 (2016).
  29. Valenzano, S., et al. Screening and Identification of DNA Aptamers to Tyramine Using in Vitro Selection and High-Throughput Sequencing. ACS Comb Sci. 18 (6), 302-313 (2016).
  30. Jauset Rubio, M., et al. beta-Conglutin dual aptamers binding distinct aptatopes. Anal Bioanal Chem. 408 (3), 875-884 (2016).
  31. Breitsprecher, D., et al. Aptamer Binding Studies Using MicroScale Thermophoresis. Methods Mol Biol. 1380, 99-111 (2016).
  32. Stoltenburg, R., Schubert, T., Strehlitz, B. In vitro Selection and Interaction Studies of a DNA Aptamer Targeting Protein A. PLoS One. 10 (7), 0134403 (2015).
  33. Kinghorn, A. B., et al. Aptamer Affinity Maturation by Resampling and Microarray Selection. Anal Chem. 88 (14), 6981-6985 (2016).
  34. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (52), 19678-19682 (2006).
  35. Braun, D., Libchaber, A. Trapping of DNA by thermophoretic depletion and convection. Phys Rev Lett. 89 (18), 188103 (2002).
  36. Duhr, S., Arduini, S., Braun, D. Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence. Eur Phys J E Soft Matter. 15 (3), 277-286 (2004).
  37. Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay Drug Dev Technol. 9 (4), 342-353 (2011).
  38. He, K., Dragnea, V., Bauer, C. E. Adenylate Charge Regulates Sensor Kinase CheS3 To Control Cyst Formation in Rhodospirillum centenum. MBio. 6 (3), 00546 (2015).
  39. Brvar, M., et al. Structure-based discovery of substituted 4,5'-bithiazoles as novel DNA gyrase inhibitors. J Med Chem. 55 (14), 6413-6426 (2012).
  40. Pogorelcnik, B., et al. 4,6-Substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as monocyclic catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIalpha targeting the ATP binding site. Bioorg Med Chem. 23 (15), 4218-4229 (2015).
  41. Jhaveri, S., Rajendran, M., Ellington, A. D. In vitro selection of signaling aptamers. Nat Biotechnol. 18 (12), 1293-1297 (2000).
  42. Khavrutskii, L., et al. Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis. J Vis Exp. (78), (2013).
  43. Ramakrishnan, M., et al. Probing cocaine-antibody interactions in buffer and human serum. PLoS One. 7 (7), 40518 (2012).
  44. Chen, M., et al. Antiviral activity and interaction mechanisms study of novel glucopyranoside derivatives. Bioorg Med Chem Lett. 25 (18), 3840-3844 (2015).
  45. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186 (4,5), 61-67 (2015).
  46. Harazi, A., et al. The Interaction of UDP-N-Acetylglucosamine 2-Epimerase/N-Acetylmannosamine Kinase (GNE) and Alpha-Actinin 2 Is Altered in GNE Myopathy M743T Mutant. Mol Neurobiol. , (2016).

Tags

Biokjemi Små molekyl-aptamer interaksjons bindende parametere mikro termodiffusjon bindende affinitet støkiometri termodynamikk nukleinsyrer bindingssetet kartlegging
Kartlegging av bindingssetet på en Aptamer på ATP Bruke mikro termodiffusjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Entzian, C., Schubert, T. Mapping… More

Entzian, C., Schubert, T. Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (119), e55070, doi:10.3791/55070 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter