Introduction
A interacção entre as moléculas é a base da natureza. Assim, os cientistas em diversas áreas de pesquisa básica e aplicada tentar entender os princípios fundamentais de interacções moleculares de diferentes tipos. MicroScale termoforese (MST) permite aos cientistas realizar a caracterização rápida, precisa e de custo eficiente e de qualidade controlada de interações moleculares em solução, com uma livre escolha de buffers. Já existem mais de 1.000 publicações utilizando MST, a partir de 2016 sozinho, descrevendo diferentes tipos de análises, incluindo rastreios de bibliotecas, a ligação validações de eventos, ensaios de competição, e experimentos com múltiplos parceiros de ligação 1-8. Em geral, o MST permite o estudo dos parâmetros de ligação clássicos, tais como a afinidade de ligação (pM para mM), estequiometria, e termodinâmica, de qualquer tipo de interacção molecular. Uma grande vantagem de MST é a possibilidade de estudar eventos de ligação independentes do tamanho dos parceiros de interacção. mesmo chalinteracções entre lenging aptâmeros de ácidos nucleicos pequenos (15-30 nt) e alvos, tais como pequenas moléculas, drogas, antibióticos, ou metabolitos podem ser quantificados.
Atuais tecnologias state-of-the-art para caracterizar as interações aptâmero-alvo são ou lab-intenso e altamente complexa ou não quantificar aptâmero-pequena molécula interações 9,10. Superfície Plasmon Resonance (SPR) à base de ensaios de 11,12 e abordagens calorimétricos verdadeiramente livre de rótulo, como Calorimetria isotérmica de titulação (ITC) 13-15, eluição isocrática 16, o equilíbrio infiltração 17,18, em linha sondagem 19, distribuição do gel mudar ensaios, stopped- fluxo de fluorescência espectroscopia 20,21, anisotropia de fluorescência (FA) 22,23, uma única molécula de fluorescência de imagem 24,25, e Bio-camada de interferometria (BLI) 26 também são ou imprecisa ou incompatível com a molécula do aptâmero-small interacções. Outros principal questões de estes métodos são de baixa sensibilidade, o consumo elevado de amostras, imobilização, as limitações de transporte de massa em superfícies, e / ou restrições de buffer. Apenas algumas destas tecnologias oferecem controles integrados para efeitos de agregação e de adsorção.
MST representa uma ferramenta poderosa para os cientistas para superar esta limitação para estudar as interacções entre os aptâmeros e pequenas moléculas 27-29, bem como outros objectivos, tais como proteínas de 30-33. A tecnologia baseia-se no movimento de moléculas através de gradientes de temperatura. Este movimento dirigido, chamado "termoforese," depende do tamanho, carga, e camada de hidratação da molécula 34,35. A ligação de um ligando para a molécula irá alterar directamente, pelo menos, um destes parâmetros, o que resulta em uma mobilidade alterada thermophoretic. Ligantes com tamanhos pequenos podem não ter um impacto considerável em termos de mudança de tamanho do não ligado ao estado ligado, mas eles podem ter dr efeitos AMATIC sobre a camada de hidratação e / ou carga. As mudanças no movimento das moléculas após thermophoretic interacções com o parceiro de ligação permite a quantificação dos parâmetros de ligação de base 2,7,34,36,37.
Tal como representado na Figura 1A, o dispositivo consiste MST de um laser infravermelho focalizada sobre a amostra, dentro dos capilares de vidro utilizando a mesma óptica como para a detecção de fluorescência. O movimento thermophoretic de proteínas através da fluorescência intrínseca dos resíduos de triptofano 6 ou de um parceiro de interacção 3,8 marcado por fluorescência podem ser monitorizadas enquanto o laser estabelece um gradiente de temperatura (AT de 2-6 ° C). A diferença de temperatura, resultando em espaço, AT, conduz à depleção ou da acumulação de moléculas na zona de temperatura elevada, que pode ser quantificado pelo coeficiente Soret (S T):
g "/>
c representa quente a concentração na região aquecida, e c frio é a concentração na região fria inicial.
Como mostrado na Figura 1B, uma típica MST os resultados da experiência em um perfil de movimento MST (traço do tempo), que consiste em diferentes fases, que podem ser separadas pelos respectivos prazos. A fluorescência é medida inicial nos primeiros 5 s na ausência do gradiente de temperatura para definir a fluorescência a partir preciso e para verificar a fotobranqueamento ou photoenhancement. O salto de temperatura (T-Jump) representa a fase em que a fluorescência mudanças antes do movimento thermophoretic. Essa redução inicial na fluorescência depende de mudanças dependentes do calor de fl uorophore rendimento quântico. A fase termoforese segue, em que as reduções de fluorescência (ou aumento), devido ao movimento das moléculas de thermophoretic até que a distribuição em estado estacionário é atingido.O TJump reversa e concomitante difusão de moléculas de volta uorescent fl pode ser observado como indicado na figura 1B após o laser é desligado. De modo a aceder aos parâmetros de ligação de base, diferentes razões molares dos parceiros de interacção são analisados e comparados. Tipicamente, 16 diferentes proporções são estudadas numa experiência MST, enquanto que a molécula visível óptico é mantido constante e é fornecido com uma quantidade crescente de ligando não marcado. A interacção entre os dois parceiros de ligação induz alterações na termoforese, e, assim, na fluorescência normalizada, F norma, que é calculada como se segue:
F quente e fria F representam em média intensidades fluorescência na de fi nidas pontos no tempo dos traços do MST. As afinidades de ligação (Kd ou valores de EC50) pode ser calculada por Curve encaixe (Figura 1C).
No geral, o MST é uma ferramenta poderosa para estudar interações moleculares de qualquer tipo. Este manuscrito oferece um protocolo para caracterizar a interação desafio entre a pequena molécula de trifosfato de adenosina (ATP; 0,5 kDa) e do 25-nt curta ssDNA aptâmero DH25.42 (7,9 kDa). Ao longo do manuscrito, o local de ligação do aptâmero na molécula de ATP é mapeado para baixo para o grupo de adenina do ATP.
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Protocol
1. Preparação de Trabalho Aptamer a Bolsa
- Seguir as instruções do fabricante e dissolve-se o oligonucleótido (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, a sequência de referência 18) em água, alcançando uma concentração final de 100 uM.
- Preparar a solução de aptâmero de trabalho por diluição da oligonucleótido a 200 nm com tampão de ligação (Tris 20 mM, pH 7,6; NaCl 300 mM; MgCl2 5 mM; 0,01% Tween 20).
- Incubar a mistura durante 2 min a 90 ° C, deixar a amostra arrefecer imediatamente para baixo sobre o gelo, e usar a amostra à temperatura ambiente.
2. Preparação da série de diluição Ligand
- Para cada ligando (trifosfato de adenosina (ATP), difosfato de adenosina (ADP), monofosfato de adenosina (AMP), adenina, guanosina trifosfato (GTP), trifosfato de citosina (CTP), desoxiadenosina-trifosfato (dATP), e s-adenosilmetionina (SAM) ; estoque 10 mM cada), preparar uma diluti série de 16 passosem em 200 ul tubos micro reação.
NOTA: A centrifugação de ações ligando por 5 min a 14.000 xg pode ajudar a remover agregados. Baixo volume, tubos de reacção de ligação baixas são recomendadas para evitar a adsorção de moléculas com as paredes do tubo. - Comece com uma concentração máxima de, pelo menos, 50 vezes mais elevada do que a afinidade estimada e reduzir a concentração do ligando em 50% em cada passo de diluição.
NOTA: A ferramenta concentração localizador implementado no software de controle simula dados de ligação e ajuda a encontrar o intervalo de concentração correta para a série de diluição. - Encher 20 ul de estoque o ligando (10 mM) no tubo 1. Adicionar 10 uL de tampão de ligação em tubos de reacção aptâmero micro 2-16.
- Transferência de 10 ml de tubo 1 para o tubo 2 e misturar bem, pipetando para cima e para baixo várias vezes. Transferir 10 mL para o próximo tubo e repetir esta diluição para os tubos restantes.
- Descartar o excesso de 10 ul a partir do último tubo. Evitar qualquer befeitos de diluição pode ser prejudicado. O tampão no tubo 1 e em tubos de 2-16 deve ser idêntica.
3. Preparação da Mistura final Reacção
- Preparar as reacções de ligação individuais com um volume de 20 ul (10 ul de solução de trabalho do aptâmero + 10 ul de diluição do respectivo ligando) para minimizar erros de pipetagem. Um volume de apenas 4 l é su fi ciente para encher o capilar.
- Adicionar 10 ul da solução de trabalho de 200 nM de aptâmero de 10 ul de cada diluição de ligando e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo várias vezes.
- Incubar as amostras durante 5 minutos a temperatura ambiente e encher as amostras padrão em capilares por meio de imersão dos capilares para a amostra. tempos de incubação mais longos podem ser necessários para algumas interacções; no entanto, 5 minutos é adequado para a maioria. Toque os capilares apenas sobre os lados, não na parte do meio, em que a medição óptica irá ser feita.
- Coloque os capilares Onto thbandeja capilar e e iniciar o dispositivo MST.
4. Iniciar o dispositivo MST
NOTA: O aparelho oferece dois pacotes de software pré-instalado, o '' "software para a configuração técnica das condições experimentais e de controle '' análise de" software para a interpretação dos dados produzidos.
- Antes de colocar a bandeja do capilar para o dispositivo MST, inicie o software de controle e ajustar a temperatura desejada geral, selecionando '' permitem controle de temperatura manual "no '' controle de temperatura" menu suspenso. Ajustar a temperatura para 25 ° C no presente modo.
NOTA: Os instrumentos MST pode ser 22 a 45 ° C de temperatura controlada. - Aguarde até que a temperatura para atingir o nível esperado e, em seguida, colocar a bandeja do capilar para o dispositivo MST.
- Ajuste o canal de LED para '' vermelho "para corantes Cy5 e ajustar a potência de LED para ganhar uma fl uorescence sinal de 300 a 1000 unidades de fluorescência a do dispositivo com um sensor de MST padrão. 25% de energia LED é utilizado neste estudo.
NOTA: 6.000 a 18.000 unidades de fluorescência são recomendados para o MST com um sensor de alta sensibilidade.
5. Capilar de digitalização
- Realize uma verificação capilar para verificar aspectos diferentes de qualidade da amostra, escolhendo a posição capilar no software "Control" e clicar em "Start Scan cap" antes de iniciar a medição MST.
- Inspecione a varredura capilar para fluorescência realce / têmpera e efeitos degola (em forma de U ou achatadas picos) no software.
NOTA: Mais detalhes sobre a detecção e tratamento de fluorescência e efeitos degola pode ser encontrada na discussão.
6. Medição MST
NOTA: Antes de iniciar a medição MST, certifique-se de excluir degola efeitos, realce / efeitos de têmpera, ouerros de pipetagem, e garantir que a digitalização capilar indica que o sinal de fluorescência é su fi ciente. Para mais detalhes, veja a discussão.
- Atribuir os concentrações de ligando a partir da série de diluição para a respectiva posição capilar no software "" controle "Considere o passo de diluição da mistura do aptâmero e o ligando. (1: 1).
- Digite a maior concentração de ligando (5 mM) para capilar # 1, selecione o tipo de diluição correta (aqui, 1: 1), clique sobre a concentração máxima e use a função arrastar para atribuir automaticamente as concentrações restantes capilares # 2- 16. A concentração mais baixa é de 152,6 nm.
- Introduza a concentração de aptâmero uorescente FL (aqui, 100 nM) na respectiva secção do software de controlo.
- Use as configurações padrão, que detectam a fluorescência durante 5 segundos, registrar o MST durante 30 segundos, e registrar a fluorescência por mais 5 segundos após a inativação do laser t o monitorar a difusão volta das moléculas.
- Ajustar a potência do laser para 20% na respectiva secção do software de controlo.
NOTA: A fim de receber a melhor relação sinal-ruído e para evitar os efeitos não específicos, uma potência de laser de 20-40% é recomendada. Em casos específicos, a potência do laser maior pode ser necessária para obter uma boa separação de moléculas não ligadas e ligados. - Salve o experimento depois de selecionar a pasta de destino e iniciar a medição do MST, premindo o botão '' de medição Iniciar MST ".
NOTA: O arquivo .ntp será gerado na pasta de destino. Usando esta configuração, uma medida dura 10-15 min. - Repetir o procedimento experimental pelo menos duas vezes para uma determinação mais precisa do valor de CE 50.
NOTA: Para testar a reprodutibilidade técnica, os mesmos capilares podem ser digitalizados várias vezes (repete técnicas).
7. Análise de Dados MST
nt "> NOTA: O software de análise permite a análise de dados sobre a fl y durante a medição O software de análise de traça os traços de tempo MST e mudanças no normalizada fluorescência (norma F) versus a concentração do ligando 37..- Inicie o software de análise de MST (Análise MO.Affinity) e carregar o arquivo .ntp da pasta de destino. Selecione "MST" como o tipo de análise no menu de seleção de dados.
Nota: Em caso de efeitos de fluorescência dependente do ligando, a fluorescência inicial pode ser escolhida para análise. - Adicionar o respectivo prazo (s) técnica ou biológica com uma nova análise por arrastar-e-soltar ou pressionando o botão "+" abaixo do respectivo prazo experimental.
- Pressione o botão informações abaixo do respectivo prazo experimental para obter informações sobre as propriedades do experimento, os traços do MST, varredura capilar, forma capilar, fluorescência inicial e taxa de branqueamento.
Nota: Estes dados brutos podem alpor isso ser inspecionados em etapas posteriores da análise. - Inspecione visualmente os vestígios do MST para efeitos de agregação e precipitação, visível como colisões e picos.
NOTA: Para mais informações sobre a detecção e tratamento dos efeitos de agregação, leia a discussão. - inspecionar visualmente a varredura capilar e a sobreposição de forma capilar para efeitos de adsorção, visível como picos achatadas ou em forma de U. inspecionar visualmente a varredura capilar e a fluorescência inicial para efeitos de fluorescência. inspecionar visualmente a taxa de branqueamento para efeitos fotodegradação.
- Alternar para o modo de dose-resposta e altere a configuração de análise para o modo "expert" pressionando o respectivo botão. Selecione "T-Jump", como a estratégia de avaliação MST.
- Selecione o modelo de "Hill" para a curva fi tting. Os parâmetros de ligação será automaticamente calculado. Normalizar os dados, escolhendo o respectivo tipo de normalização no menu "comparar os resultados". exportar odados tanto como um .xls ou .pdf.
NOTA: A tabela abaixo do gráfico de ligação resume os parâmetros obrigatórios calculados.
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Representative Results
Neste estudo, o MST foi aplicado para caracterizar o local de ligação do aptâmero ADN DH25.42 18 em ATP. Em contraste com outros estudos que caracterizam a interacção de ATP ou ATP-imitando as moléculas pequenas com as proteínas marcadas aleatoriamente com um ou mais fluoróforos 38-40, este estudo inclui uma versão marcada do aptâmero 7,9 kDa ADNcs com uma molécula de Cy5 na extremidade 5' . Diferentes derivados de ATP e de moléculas relacionadas, todos diferindo a partir de ATP em várias posições, foram utilizados para mapear o local de ligação na molécula ATP. série de diluição (em 16 passos, reduzindo a concentração do ligando em 50% cada) dos diferentes ligandos foram preparados e misturados com uma quantidade constante de aptâmero marcado com Cy5. As amostras foram analisadas em capilares padrão no LED 25% e 20% de potência de laser. perfis (MST vestígios de tempo) foram gravadas e unidades de fluorescência, derivadas da fase T-Jump, foram plotados versus a concentr liganteção (comparar com a figura 1C). De ajuste de curva foi realizada aplicando a equação de Hill, resultando em valores de EC 50. Em 5 repetições independentes biológicos (4 operadores diferentes, 2 stocks de aptâmeros diferentes, 2 estoques ATP diferentes), a interação ATP-aptâmero mostra uma amplitude vinculativo negativo de 6 a 13 unidades e um valor médio de EC50 de 52,3 ± 5,0 mM (Figura 2A ). As barras de erro nos gráficos de ligação e "±" apresentado nos dados de afinidade representam o desvio padrão de 5 repetições biológicas (5 medições independentes num capilar diferente). Afinidades anteriormente para a interacção do aptâmero DH25.42 com adenosina [2,8,5'- 3H] ATP e de agarose foram comparáveis. A interacção da adenosina com o aptâmero radiomarcado foi quantificada por um ensaio de filtração centrífuga, e foi determinada uma afinidade (K d) de 6 ± 3 uM. experiências de eluição isocrática com IMMOBIL ATPzada a agarose resultou numa afinidade (K d) de 13 uM 18,41.
Para uma melhor comparação lado-a-lado, os dados podem ser normalizadas para a fracção de moléculas complexadas (fracção ligada, FB) usando a seguinte equação: 
onde o valor (c) é o valor MST medida para a concentração c, livre é o valor MST para o estado desacoplado (concentração mais baixa) e complexada é o valor MST para o estado totalmente ligado (Figura 2B). Esta normalização é ideal para comparar os resultados de diferentes ligandos de um gráfico, como mostrado na Figura 2C. Os detectados peias af fi de ADP (63,6 ± 5,9 uM em duplicado biológicos), AMP (91,6 ± 9,1 uM em duplicado biológicos) e SAM (44,4 ± 3,2 uM em duplicado biológicos), que diferem a partir de ATP na Number de grupos fosfato, implica que esta posição não tem nenhuma ou apenas pequenas em uência fl sobre o comportamento de ligação do aptâmero (Figura 2C e D). O grupo OH no carbono C2 da ribose de ATP também pode ser excluído de ser o principal local de ligação, como dATP também estava vinculado pela aptâmero com uma ligeira redução Comunidade fi af (64,4 ± 6,1 M em duplicatas biológicos). Mudando o grupo purina de ATP para o grupo pirimidina CTP resultou em não-ligação do aptâmero, demonstrando a importância deste grupo para a interacção. O aptâmero obrigado a adenina com uma afinidade de 141,7 ± 9,4 uM (em duplicados biológicos), que mostra que o local de ligação deve ser nesta parte da molécula de ATP. As moléculas de purina de GTP e ATP diferir em área sombreada a verde representada na Figura 2D, o que representa o principal sítio de ligação do aptâmero em ATP. Outro estudo usou experiências de eluição não quantitativos com diferentes derivados ATP paraeluir um aptâmero a partir de ATP marcado radioactivamente de agarose, que apresentaram resultados comparáveis para este estudo 18 MST.
Figura 1: MicroScale termoforese. (A) A configuração técnica da tecnologia MST é mostrado. As ópticas de focagem sobre o centro de capilares de vidro, detectando-se assim o sinal de fluorescência da molécula opticamente visível. Um laser de infravermelhos é utilizado para estabelecer um gradiente de temperatura na janela de observação do sistema óptico. Alterações na fluorescência pode ser utilizado para monitorizar o movimento thermophoretic das moléculas em solução (B) MST tempo traço-Pro movimento fi l de moléculas em um gradiente de temperatura. A fluorescência inicial é medida durante 5 segundos, enquanto o laser é desligado. Ligar o laser gera um gradiente de temperatura. Após a T-salto imediato pHase, em que o corante uorescente fl diminui o seu rendimento de sinal após indução de calor, o movimento thermophoretic ocorre e é observado durante 30 segundos. Após o laser é desligado, as moléculas difundem de volta. (C) Os resultados de uma experiência típica: MST (esquerda) 16 capilares contendo a mesma concentração de molécula fluorescente e uma concentração crescente de ligando não marcado a; os vestígios de tempo são registadas MST e normalizada para a sua fluorescência inicial. (Direito) A fluorescência normalizada; a diferença entre F F frio e quente é representada graficamente contra a concentração do ligando. Um ajuste de curva de rendimentos de dados esta parâmetros, tais como a ligação AF infinito de ligação. Re-imprimir com permissão de Elsevier, Métodos 28; número de licença 3890230800113. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: análise de dados MST. (A) A linha de base corrigido fl normalizada uorescência Af norma (‰), derivado do sinal de MST TJump, é representada graficamente contra a concentração de ATP (em uM). A equação de Hill (EC50) foi aplicada para a curva de ajuste. As barras de erro representam o desvio padrão de cinco repetições biológicas. (B) ligados a trama fracção dos dados mostrados em A. Os respectivos conjuntos de dados foram normalizados para a fracção ligada, e a média destes dados normalizada é apresentada no gráfico de ligação. As barras de erro indicam o desvio padrão de 5 repetições biológicas. (C) O gráfico ligado à fracção mostra uma comparação quantitativa (Hill ajuste) dos diferentes ligandos para o aptâmero. As barras de erro representam o padrão Deviação de duas repetições biológicas. (D) ligação af nidades fi (EC 50) de diferentes ligantes para o aptâmero. A área a sombreado verde indica o sítio de ligação do aptâmero no grupo de adenina do ATP. Esta figura é modificada a partir Elsevier, Métodos 28; número de licença 3890230800113. conjuntos de dados do estudo anterior são novamente analisadas e expandido dentro deste estudo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: otimização de ensaio para experiências do MST. (A) A adsorção de proteínas e efeitos que furam pode ser detectado na verificação capilar. formas dos picos irregulares, tais como picos achatadas ou em forma de L, indicam a aderência do material da amostra para a superfície de vidro. Cpendurado do tipo capilar (standard, premium, ou hidrofóbico) pode impedir a adsorção molécula, resultando em uma forma regular de pico. (B) Os traços de tempo MST também servem como um controle de qualidade, uma vez que os agregados podem ser detectados há como colisões e picos. As condições experimentais pode ser optimizada através da melhoria da solubilidade das moléculas (por exemplo, incluindo detergentes, tais como Pluronic F-127 ou variação de pH ou concentração de sal). Centrifugação pode ajudar a remover agregados maiores. Para garantir a qualidade dos dados ideal, os traços de tempo MST deve se parecer com o exemplo dado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
controles de qualidade:
Inespecífica colagem / adsorção do material da amostra para as superfícies, bem como os efeitos de agregação, ter uma influência dramática na qualidade dos dados de afinidade. No entanto, apenas algumas tecnologias state-of-the-art oferecem opções precisas e rápidas para monitorar e evitar esses efeitos. MST oferece controlos de qualidade integrados que detectam e ajudar a ultrapassar estes problemas, permitindo a optimização gradual da configuração técnica. informações importantes sobre os efeitos de atrito e de fluorescência pode ser extraído da verificação capilar e forma capilar (passos 5.2 e 7.5), enquanto que a agregação / efeitos de precipitação (passo 7.7) pode ser monitorado nos perfis de movimento. Esses controles permitem para a melhoria constante da qualidade dos dados e representam passos críticos no protocolo.
Detecção de efeitos de adsorção e solução de problemas:
A varredura capilar é realizada principalmente como uma inicial passo para determinar a posição dos capilares sobre o suporte do tabuleiro pela varredura da fluorescência ao longo dela. Cada pico representa um capilar, indicando o ponto de partida para a medição MST. A inspecção visual da forma do pico permite a determinação da adsorção de moléculas para a superfície do vidro, o qual é um controle de qualidade essencial que deve ser executada antes do início da experiência MST. A sobreposição de forma capilar permite a detecção fácil de achatados, formas dos picos irregulares, ou mesmo de picos que se assemelham a uma forma-L, indicando a adsorção / aderência das moléculas à superfície de vidro interior do capilar (Figura 3A, painel superior). Diferentemente revestido tipos capilares (Standard, Premium e hidrofóbico) ajudam a assegurar a solubilidade e adsorção mínima das moléculas para os capilares. Os capilares devem ser testados quanto à sua adequação antes das experiências de ligação. Detergentes tais como Tween (0,005-0,1%) ou Pluronic F127 (0,01-0,1%) MAy também prevenir os efeitos de adsorção não específicos. Optimização nesta fase da experiência é essencial para a alta qualidade de dados (comparar com a figura 3A, painel inferior).
Detecção de efeitos de fluorescência e solução de problemas:
Variações na altura do pico dos capilares digitalizados oferecem mais uma camada de informações sobre as características da amostra. diferenças aleatórias na fluorescência capilar pode, por um lado, ser devido a erros de pipetagem ou, por outro lado, originam grandes agregados da amostra na região de varrimento que pode aumentar drasticamente a fluorescência. Alta precisão de pipetagem é obrigatória para evitar os efeitos de diluição. Misturando todas as soluções por pipetagem cima e para baixo aumenta a precisão ainda. Além disso, é essencial para manter o tampão consistente em cada capilar. Estratégias para lidar com os efeitos de agregação são apresentados em um parágrafo mais tarde.
mudanças sistêmicas de fluorescência com aumencantar concentração do ligando muitas vezes indicam dependente do ligando efeitos têmpera / realce. O "Teste de SD" é levada a cabo a fim de discriminar alterações de fluorescência induzida por ligação de perda de fluorescência inespecífica; Neste teste monitoriza intensidades de fluorescência sob condições desnaturantes. No caso de efeitos de fluorescência dependente do ligando, as intensidades de fluorescência sob condições de desnaturação deve ser idêntico, independente da concentração de titulante. Se a diferença de intensidades de fluorescência ainda está presente sob estas condições, o material foi perdida devido a adsorção inespecífica para paredes do tubo ou devido a agregação e a subsequente centrifugação.
Para realizar o Teste de SD, 10 ul da primeira e 10 ul da última etapa de diluição ligando são cada cuidadosamente transferido para um novo tubo contendo 10 ul de uma mistura de 2 x SD (4% de SDS e DTT 40 mM). As amostras são misturadas e as moléculas são desnaturadas durante 5 min a 95 ° C. afteR enchendo as amostras para os vasos capilares, as intensidades de fluorescência são medidos. Se um efeito de fluorescência dependente do ligando é detectado, os dados podem ser analisados directamente por as informações de ligação deduzidas a partir das mudanças de intensidade de fluorescência.
Detecção de efeitos de agregação e solução de problemas:
Irregular, irregulares vestígios tempo MST indicam efeitos de agregação e / ou precipitação (Figura 3B, painel superior). Material de amostra não agregada mostra um perfil limpo e suave thermophoretic movimento (Figura 3B, painel inferior). A centrifugação do material de amostra, antes da utilização (5-10 min a 14.000 x g), a adição de detergentes (0,005-0,1% de Tween-20, 0,01-0,1% de Pluronic F-127, ou semelhante), a utilização de BSA ( > 0,5 mg / ml), ou a mudança de condições de tampão (pH e força iónica) são recomendados para minimizar os efeitos de agregação e de optimizar a qualidade dos dados. A fim de se obter dados de elevada qualidade, istoé essencial para minimizar os efeitos de agregação.
análise de dados e ajuste de curva:
Um perfil de movimento thermophoretic está dividido em diferentes fases, que podem ser controlados separadamente ou concomitantemente. O T-Jump descreve a mudança repentina no rendimento de fluorescência após a mudança de temperatura, o que representa uma característica intrínseca de fluoróforos. A ligação directa nos arredores perto do fluoróforo ou conformação mudanças após ligação altamente afetar o T-Jump. O termoforese mais lento refere-se ao movimento das moléculas no domínio de temperatura, que oferecem informação sobre a estrutura geral do complexo formado. O tipo padrão de análise de dados emprega a definição "termoforese + T-Jump", explorando ambos os fenômenos para determinar os parâmetros de ligação. No caso de as duas fases têm sentidos opostos, recomenda-se analisar as fases separadamente. Observe que o tempo de efeitos e diferentes espécies de Molecules pode levar a diferenças na afinidade do termoforese e T-Jump. Outro tipo de opção de análise é a configuração manual, que permite a investigação de regiões específicas do perfil de movimento. Perturbações devidas a agregação ou de convecção podem ser excluídos desta forma. A fim de melhorar a qualidade dos dados, os cursores podem ser definidas antes dos sinais de agregação. Examinando o termoforese início comumente produz dados com menos ruído, uma vez que a convecção é um processo dependente do tempo. Este ajuste manual precoce é altamente recomendado para experimentos com potência de laser de alta (80%). Depois de escolher a configuração de análise de dados, dois modelos de encaixe integrados no software de análise pode ser aplicada para se ajustar a curva de ligação. A função de ajuste para K d da lei da ação das massas é adequado para 1: 1 modos de ligação ou para a ligação vários sites que possuam a mesma afinidade. A constante de dissociação K d independente da concentração descreve o equilíbrio entre o bound eo estado não ligado; Assim, a afinidade de um local de ligação a um ligando é medido. O valor EC50 dependente da concentração, derivada da equação de Hill representa a dose eficaz de um ligando em que metade das moléculas marcadas são no estado ligado. O ajuste do monte deve ser aplicada a multivalente modelos de ligação, especialmente se eles são cooperativos.
Os controles de qualidade integrados representam uma grande vantagem do MST sobre tecnologias como SPR ou ITC. Estes controles permitem a optimização fácil e rápido da configuração técnica para garantir a qualidade dos dados ideal. Além das medições de tempo-eficiente (KD em 15 min) e a instalação livre de imobilização, MST oferece a livre escolha de buffers, permitindo a avaliação de interações moleculares, mesmo em lisados e soros 5,42,43. Devido ao facto de termoforese molecular depende do tamanho, carga, e camada de hidratação de moléculas, não existem limitaçõesno tamanho dos parceiros de interacção medido durante as medições MST. A af gama infinito dinâmico, de PM para mM, juntamente com o baixo consumo de amostra, completa os pontos fortes da tecnologia MST. Vale ressaltar que MST gera dados precisos sobre os parâmetros de ligação básicas, tais como a afinidade de ligação, estequiometria, e termodinâmica. No entanto, o MST não permite a medição de k on e k off taxas. Além disso, tem de se considerar que, para a maioria das experiências de MST, uma modificação fluorescente deve ser adicionado a um dos parceiros de interacção. Os dados gerados estão de acordo com as tecnologias state-of-the-art, como a SPR e ITC 32,43-46. No entanto, estes dados são de qualidade controlada, as experiências são mais rapidamente, e que consomem menos material. No geral, MST representa uma poderosa ortogonal tecnologia para tecnologias state-of-the-art, com algumas vantagens adicionais.
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Disclosures
CE e TS são funcionários da 2bind GmbH, que fornece serviços de análise biofísicos. taxas de publicação do video-artigo são pagos por 2bind GmbH.
Acknowledgments
Os autores não têm confirmações.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aptamer binding buffer | 20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20 | ||
| Fluorescently labeled ATP aptamer | IDT, Leuven, Belgium | sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3 |
|
| ATP | Sigma Aldrich, Germany | A2383 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| ADP | Sigma Aldrich, Germany | A2754 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| AMP | Sigma Aldrich, Germany | A2252 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| Adenine | Sigma Aldrich, Germany | A8626 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| SAM | Sigma Aldrich, Germany | A7007 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| dATP | Sigma Aldrich, Germany | 11934511001 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| CTP | Sigma Aldrich, Germany | C1506 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| GTP | Sigma Aldrich, Germany | G8877 | 10 mM stock solutions stored at - 20 °C |
| Monolith NT.115 | NanoTemper Technologies, Munich, Germany | MO-G008 | Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector |
| Monolith NT.115 capillaries Standard | NanoTemper Technologies, Munich, Germany | MO-K002 | |
| Eppendorf PCR tubes | Eppendorf, Germany | 30124537 | |
| Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device | NanoTemper Technologies, Munich, Germany | ||
| MO.affinity analysis v2.1.1 | NanoTemper Technologies, Munich, Germany | ||
| Kaleidagraph 4.5.2 | Synergy Software |
References
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