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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Mapear el sitio de unión de un aptámero de ATP utilizando MicroScale termoforesis

Published: January 7, 2017 doi: 10.3791/55070
Automatic Translation
1, 1
12bind GmbH

Introduction

La interacción entre las moléculas es la base de la naturaleza. Por lo tanto, los científicos en muchos campos de la investigación básica y aplicada tratan de comprender los principios fundamentales de las interacciones moleculares de diferentes tipos. MicroScale termoforesis (MST) permite a los científicos para llevar a cabo la caracterización rápida, precisa y rentable, y con control de calidad de las interacciones moleculares en solución, con una libre elección de tampones. Ya hay más de 1.000 publicaciones utilizando MST, a partir de 2016 solo, que describe diferentes tipos de análisis, incluyendo proyecciones de la biblioteca, validaciones de eventos, ensayos de competición, y los experimentos de unión con múltiples parejas de unión 1-8. En general, MST permite el estudio de los parámetros de unión clásicos, tales como la afinidad de unión (pM ​​a mM), estequiometría, y la termodinámica, de cualquier tipo de interacción molecular. Una gran ventaja de MST es la capacidad para estudiar eventos de unión independientes del tamaño de las parejas de interacción. incluso chalinteracciones lenging entre pequeños aptámeros de ácido nucleico (15-30 nt) y objetivos tales como moléculas pequeñas, fármacos, antibióticos, o metabolitos pueden ser cuantificados.

Las tecnologías actuales del estado de la técnica para caracterizar las interacciones aptámero-objetivo son ya sea en laboratorio intensa y de gran complejidad o no se cuantifica aptámero-molécula pequeña Interacciones de 9,10. Surface Plasmon Resonance (SPR) a base de ensayos colorimétricos 11,12 y enfoques verdaderamente libre de marca, tales como calorimetría de titulación isotérmica (ITC) 13-15, elución isocrática 16, el equilibrio filtración 17,18, el sondeo en línea 19, de gel cambiar ensayos, stopped- flujo espectroscopía de fluorescencia 20,21, anisotropía de fluorescencia (FA) 22,23, de una sola molécula de fluorescencia de imagen 24,25, y Bio-capa de interferometría (BLI) 26 también son bien imprecisa o incompatible con la molécula del aptámero microcítico interacciones. otros principal problemas de estos métodos son de baja sensibilidad, alto consumo de ejemplo, la inmovilización, las limitaciones de transporte de masa en las superficies, y / o restricciones de amortiguamiento. Sólo unas pocas de estas tecnologías proporcionan controles integrados para la agregación y adsorción efectos.

MST representa una poderosa herramienta para los científicos para superar esta limitación para estudiar las interacciones entre los aptámeros y moléculas pequeñas 27-29, así como otros objetivos, tales como proteínas 30-33. La tecnología se basa en el movimiento de moléculas a través de gradientes de temperatura. Este movimiento dirigido, llamado "termoforesis," depende del tamaño, la carga, y la capa de hidratación de la molécula 34,35. La unión de un ligando a la molécula alterará directamente al menos uno de estos parámetros, lo que resulta en una movilidad termoforético cambiado. Ligandos con tamaños pequeños pueden no tener un impacto considerable en términos de cambio de tamaño de la independiente al estado ligado, pero pueden tener dr Amatic efectos sobre la capa de hidratación y / o carga. Los cambios en el movimiento termoforético de moléculas después de la interacción con la pareja de unión permite la cuantificación de los parámetros de unión básicas 2,7,34,36,37.

Como se muestra en la Figura 1A, el dispositivo MST consta de un láser infrarrojo enfocado sobre la muestra dentro de los capilares de vidrio utilizando la misma óptica como para la detección de fluorescencia. El movimiento termoforético de las proteínas a través de la fluorescencia intrínseca de triptófanos 6 o de un 3,8 pareja de interacción marcado con fluorescencia se puede monitorizar mientras el láser se establece un gradiente de temperatura (? T de 2-6 ° C). La diferencia de temperatura resultante en el espacio,? T, conduce al agotamiento o la acumulación de moléculas en el área de temperatura elevada, que se puede cuantificar por el Soret coeficiente (S T):

g "/>

c caliente representa la concentración en la región calentada, y c es la concentración de frío en la región en frío inicial.

Como se muestra en la Figura 1B, un típico experimento MST produce un perfil de movimiento MST (traza el tiempo), que consta de diferentes fases, que pueden separarse por sus respectivas escalas de tiempo. La fluorescencia inicial se mide en los primeros 5 s en ausencia del gradiente de temperatura para definir la fluorescencia a partir preciso y para comprobar si hay photobleaching o photoenhancement. El salto de temperatura (T-Jump) representa la fase en la que los cambios de fluorescencia antes del movimiento termoforético. Esta disminución inicial de la fluorescencia depende de cambios dependientes de calor de fluoróforo rendimiento cuántico. La fase termoforesis sigue, en el que se alcanza la disminución de fluorescencia (o aumenta) debido al movimiento de las moléculas termoforético hasta la distribución en el estado estacionario.El TJump inversa y retrodifusión concomitante de moléculas fluorescentes fl se pueden observar como se indica en la figura 1B después de que el láser está apagado. Con el fin de acceder a los parámetros básicos de unión, diferentes relaciones molares de los compañeros de interacción son analizados y comparados. Típicamente, 16 relaciones diferentes se estudian en un experimento MST, mientras que la molécula visible óptico se mantiene constante y se suministra con una cantidad creciente de ligando no marcado. La interacción entre las dos parejas de unión induce cambios en la termoforesis, y así en la fluorescencia normalizada, F norma, que se calcula de la siguiente manera:

Ecuación

F caliente y fría F representan un promedio de intensidades de fluorescencia en puntos de tiempo de fi nido de las huellas del MST. Las afinidades de unión (Kd o valores de EC50) se pueden calcular por curve apropiado (Figura 1C).

En general, el MST es una poderosa herramienta para estudiar las interacciones moleculares de ningún tipo. Este manuscrito ofrece un protocolo para caracterizar la interacción entre el reto pequeña molécula de trifosfato de adenosina (ATP; 0,5 kDa) y el 25-nt corto ssDNA aptámero DH25.42 (7,9 kDa). En el transcurso del manuscrito, el sitio de unión del aptámero en la molécula de ATP se mapea hasta el grupo adenina del ATP.

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Protocol

1. Preparación del aptámero de Trabajo de la

  1. Siga las instrucciones del fabricante y se disuelve el oligonucleótido (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, la secuencia de referencia 18) en agua, alcanzando una concentración final de 100 mM.
  2. Preparar la solución de aptámero de trabajo diluyendo la solución madre oligonucleótido a 200 nm con tampón de unión (Tris 20 mM, pH 7,6; NaCl 300 mM; MgCl2 5 mM, Tween 20 al 0,01%).
  3. Incubar la mezcla durante 2 min a 90 ° C, permita que la muestra se enfríe inmediatamente en hielo, y el uso de la muestra a temperatura ambiente.

2. Preparación de la serie de diluciones de ligandos

  1. Para cada ligando (adenosina trifosfato (ATP), difosfato de adenosina (ADP), monofosfato de adenosina (AMP), adenina, guanosina trifosfato (GTP), trifosfato de citosina (CTP), desoxiadenosina trifosfato (dATP), y S-adenosil metionina (SAM) ; 10 mM cada uno), preparar una diluti serie de 16 pasosen en 200 l tubos de reacción Micro.
    NOTA: La centrifugación de las poblaciones de ligando durante 5 min a 14.000 xg puede ayudar a eliminar los agregados. Bajo volumen, se recomienda a los tubos de reacción de unión bajas para evitar la adsorción de moléculas a las paredes del tubo.
  2. Comienza con una concentración máxima de al menos 50 veces mayor que la afinidad estimada y reducir la concentración de ligando en un 50% en cada etapa de dilución.
    NOTA: La herramienta de búsqueda de concentración llevada a cabo en el software de control simula los datos de unión y ayuda a encontrar el rango de concentración adecuado para la serie de dilución.
  3. Llenar 20 l de ligando de stock (10 mM) en el tubo 1. Añadir 10 l de tampón de unión de aptámeros en tubos de reacción micro 2-16.
  4. Transferencia de 10 l de tubo 1 al tubo 2 y mezclar bien pipeteando arriba y abajo varias veces. Transferir 10 l al siguiente tubo y repetir esta dilución para los tubos restantes.
  5. Descartar el exceso de 10 l del último tubo. B evitar cualquierUffer efectos de dilución. El tampón en el tubo 1 y en los tubos de 2-16 debe ser idéntica.

3. Preparación de la mezcla final de reacción

  1. Preparar las reacciones de unión individuales con un volumen de 20 l (10 l de solución de trabajo de aptámero + 10 l de la dilución ligando respectivo) para minimizar los errores de pipeteado. Un volumen de sólo 4 l es su fi ciente para llenar el capilar.
  2. Añadir 10 l de la solución de trabajo 200 nM de aptámero a 10 l de cada dilución ligando y mezclar adecuadamente pipeteando arriba y abajo varias veces.
  3. Se incuban las muestras durante 5 min a temperatura ambiente y fi ll las muestras en tubos capilares estándar por inmersión de los capilares en la muestra. tiempos de incubación más largos pueden ser necesarios para algunas interacciones; sin embargo, 5 min es adecuada para la mayoría. Toca los capilares sólo en los lados, no en la parte media, donde se toma la medición óptica.
  4. Colocar los capilares a la sabandeja de correo capilar e iniciar el dispositivo MST.

4. Puesta en marcha del dispositivo MST

NOTA: El dispositivo ofrece dos paquetes de software pre-instalado, el "software para la configuración técnica de las condiciones experimentales y el control '' análisis" 'software para la interpretación de los datos producidos.

  1. Antes de colocar la bandeja capilar en el dispositivo MST, inicie el software de control y ajuste la temperatura global deseada seleccionando '' permitir el control manual de temperatura "en el '' control de la temperatura" menú desplegable. Ajustar la temperatura a 25 ° C de esta manera.
    NOTA: Los instrumentos MST pueden ser de temperatura controlada 22 a 45 ° C.
  2. Espere a que la temperatura alcance el nivel esperado y luego colocar la bandeja capilar en el dispositivo MST.
  3. Ajuste el canal de LED para '' roja "para los colorantes Cy5 y ajustar la potencia de LED para obtener una fl uorescence señal de 300 a 1000 unidades de fluorescencia en el dispositivo MST con un sensor estándar. de energía del LED 25% se utiliza en este estudio.
    NOTA: Se recomienda a entre 6.000 y 18.000 unidades de fluorescencia para el MST con un sensor de alta sensibilidad.

5. capilar Scan

  1. Realizar un análisis capilar para comprobar aspectos diferentes de calidad de la muestra por la elección de la posición capilar sobre el software de "control" y hacer clic en "iniciar la exploración de tope" antes de iniciar la medición MST.
  2. Inspeccionar el análisis capilar para la mejora de la fluorescencia / temple y efectos que se pegan (en forma de U o aplanado picos) en el software.
    NOTA: Más detalles sobre la detección y manejo de fluorescencia y se pegan efectos se pueden encontrar en la discusión.

6. Medición MST

NOTA: Antes de iniciar la medición MST, asegúrese de excluir a pegarse efectos, el realce / efectos de temple, olos errores de pipeteo, y asegurar que la exploración capilar indica que la señal de fluorescencia es su fi ciente. Para más detalles, véase la discusión.

  1. Asignar las concentraciones de ligando de la serie de diluciones a la posición respectiva en el capilar software '' de control de "Considere la etapa de dilución de la mezcla del aptámero y el ligando. (1: 1).
  2. Introduce la mayor concentración de ligando (5 mM) durante capilar # 1, seleccione el tipo de dilución correcta (en este caso, 1: 1), haga clic en la concentración máxima, y ​​utilizar la función de arrastrar para asignar automáticamente las concentraciones restantes en los capilares # 2- dieciséis. La concentración más baja es de 152,6 nm.
  3. Introduzca la concentración del aptámero fluorescente fl (aquí, 100 nM) en la sección respectiva del software de control.
  4. Utilice la configuración predeterminada, que detectan la fluorescencia durante 5 segundos, el MST grabar durante 30 segundos, y registrar la fluorescencia de 5 segundos más después de la inactivación del láser t o controlar la difusión posterior de las moléculas.
  5. Ajustar la potencia del láser a 20% en la sección respectiva del software de control.
    NOTA: Para poder recibir la mejor relación señal-ruido y para evitar efectos no específicos, se recomienda una potencia de láser de 20-40%. En casos específicos, una mayor potencia del láser puede ser necesaria para obtener una buena separación de las moléculas no unidas y unidos.
  6. Guarde el experimento después de seleccionar la carpeta de destino y comenzar la medición MST pulsando el botón '' Iniciar la medición MST ".
    NOTA: El archivo .ntp se generará en la carpeta de destino. Con esta instalación, una medición tiene una duración de 10-15 minutos.
  7. Repetir el procedimiento experimental al menos dos veces para una determinación más precisa del valor CE 50.
    NOTA: Con el fin de probar la reproducibilidad técnica, los mismos capilares se pueden escanear varias veces (repeticiones técnicas).

7. Análisis de datos MST

nt "> NOTA: El software de análisis permite el análisis de los datos de la mosca durante la medición El software de análisis de traza las huellas del tiempo del MST y los cambios en la normalizado de fluorescencia (norma F) frente a la concentración de ligando 37..

  1. Iniciar el software de análisis de MST (Análisis MO.Affinity) y cargar el archivo .ntp de la carpeta de destino. Seleccione "MST" como el tipo de análisis en el menú de selección de datos.
    NOTA: En caso de efectos de fluorescencia dependientes de ligando, la fluorescencia inicial se puede elegir para su análisis.
  2. Añadir la respectiva carrera (s) técnica o biológica a un nuevo análisis de arrastrar y soltar o presionando el botón "+" por debajo de la respectiva prueba experimental.
  3. Presione el botón de información por debajo de la respectiva prueba experimental para obtener información sobre las propiedades del experimento, los rastros del MST, escaneo capilar, forma capilar, fluorescencia inicial y la tasa de blanqueo.
    Nota: Estos datos en bruto puede colpor lo que ser inspeccionados en las etapas posteriores del análisis.
  4. una inspección visual de los restos del MST para la agregación y precipitación efectos visibles, como golpes y picos.
    NOTA: Para obtener más información sobre la detección y manejo de los efectos de agregación, leer la discusión.
  5. Inspeccione visualmente el análisis capilar y la superposición de forma capilar para efectos de adsorción, visible como picos aplanados o en forma de U. Inspeccione visualmente el análisis capilar y la fluorescencia inicial para efectos de fluorescencia. una inspección visual de la tasa de blanqueo para efectos photobleaching.
  6. Cambiar al modo dosis-respuesta y cambiar la configuración de análisis para el modo "experto" pulsando el botón correspondiente. Seleccionar "T-Jump", como la estrategia de evaluación del MST.
  7. Seleccione el modelo de "Colina" para la curva fi tting. se calculará automáticamente los parámetros de unión. Normalizar los datos mediante la elección del tipo respectivo de la normalización en el menú de "comparación de resultados". exportar eldatos, ya sea como un archivo .xls o .pdf.
    NOTA: La tabla debajo del gráfico de unión se resumen los parámetros de unión calculados.

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Representative Results

En este estudio, se aplicó MST para caracterizar el sitio de unión del aptámero de ADN DH25.42 18 en ATP. En contraste con otros estudios que caracterizan la interacción de ATP o ATP que imitan moléculas pequeñas con proteínas marcadas aleatoriamente con uno o más fluoróforos 38-40, este estudio incluye una versión etiquetada del aptámero 7,9 kDa ssDNA con una molécula de Cy5 en el extremo 5 ' . Diferentes derivados de ATP y moléculas relacionadas, todas diferentes de ATP en varias posiciones, se utilizaron para mapear el sitio de unión en la molécula de ATP. serie de dilución (en 16 pasos, lo que reduce la concentración de ligando en un 50% cada uno) de los diferentes ligandos se prepararon y se mezcla con una cantidad constante de aptámero marcado con Cy5. Las muestras se analizaron en los capilares estándar a 25% LED y la potencia del láser 20%. Perfiles de desplazamiento (MST trazas de tiempo) se registraron y unidades de fluorescencia, derivados de la fase T-Jump, se representaron frente al ligando concentración (comparar Figura 1C). El ajuste de curvas se realizó la aplicación de la ecuación de Hill, resultando en valores de EC50. En 5 repeticiones independientes biológicos (4 operadores diferentes, 2 poblaciones de aptámeros diferentes, 2 stocks ATP diferentes), la interacción ATP-aptámero muestra una amplitud de unión negativo de 6 a 13 unidades y un valor medio de CE50 de 52.3 ± 5.0 M (Figura 2A ). Las barras de error en los gráficos de unión y "±" presentadas en los datos de afinidad representan la desviación estándar de 5 repeticiones biológicos (5 mediciones independientes en un capilar diferente). Afinidades previamente reportadas para la interacción del aptámero DH25.42 con adenosina [2,8,5'- 3 H] y agarosa ATP eran comparables. La interacción de la adenosina radiomarcado con el aptámero se cuantificó mediante un ensayo de filtro de centrífuga, y se determinó una afinidad (K d) de 6 ± 3 M. experimentos de elución isocrática con immobil ATPzado a agarosa dado lugar a una afinidad (K d) de 13 mM 18,41.

Para una mejor comparación lado a lado, los datos pueden normalizarse a la fracción de moléculas complejadas (fracción unida, FB) utilizando la siguiente ecuación:
Ecuación
donde el valor (c) es el valor medido MST para la concentración c, libre es el valor MST para el estado no unido (concentración más baja), y acomplejado es el valor MST para el estado completamente unido (Figura 2B). Esta normalización es ideal para comparar los resultados de diferentes ligandos en un gráfico, como se muestra en la Figura 2C. Los dades detectadas af fi de ADP (63,6 ± 5,9 mM en los duplicados biológicos), AMP (91,6 ± 9,1 mM en los duplicados biológicos) y SAM (44,4 ± 3,2 micras de duplicados biológicos), que difieren de ATP en el numbre de grupos fosfato, implicaría que esta posición no tiene o tiene poca importancia en la influencia sobre el comportamiento de unión del aptámero (Figura 2C y D). El grupo OH en el carbono C2 de la ribosa del ATP también podría ser excluido de ser el sitio de unión importante, como dATP también estaba obligado por el aptámero con una ligera reducción de afinidad (64,4 ± 6,1 mM en los duplicados biológicos). Cambio del grupo de purina de ATP al grupo pirimidina CTP dio como resultado no vinculante del aptámero, lo que demuestra la importancia de este grupo para la interacción. El aptámero unido a adenina con una afinidad de 141,7 ± 9,4 M (en los duplicados biológicos), mostrando que el sitio de unión debe estar en esta parte de la molécula de ATP. Las moléculas de purina de GTP y ATP difieren en el área sombreada verde representada en la Figura 2D, que representa el sitio principal de unión del aptámero en ATP. Otro estudio utilizó experimentos de elución no cuantitativos con diferentes derivados de ATP aeluir un aptámero radiomarcado a partir de agarosa ATP, que mostró resultados comparables a este estudio MST 18.

Figura 2
Figura 1: MicroScale termoforesis. (A) Se muestra la configuración técnica de la tecnología MST. La óptica de enfoque en el centro de capilares de vidrio, detectando de este modo la señal de fluorescencia de la molécula ópticamente visible. Un láser de IR se utiliza para establecer un gradiente de temperatura en la ventana de observación del sistema óptico. Los cambios en la fluorescencia se pueden utilizar para controlar el movimiento de las moléculas termoforético en solución (B) MST tiempo de rastreo de movimiento per fi l de las moléculas en un gradiente de temperatura. La fluorescencia inicial se mide durante 5 s mientras el láser está apagado. Encender el láser genera un gradiente de temperatura. Después de la T-salto inmediato phase, en el que el colorante fluorescente fl disminuye su rendimiento de la señal después de la inducción de calor, el movimiento termoforético se lleva a cabo y se observa durante 30 segundos. Después de que el láser está apagado, las moléculas se difunden de nuevo. (C) Los resultados de un experimento típico MST: (izquierda) 16 capilares que contienen la misma concentración de molécula fluorescente y una concentración creciente del ligando no marcado; las huellas de tiempo MST se registran y se normalizó a su fluorescencia inicial. (Derecha) La fluorescencia normalizada; la diferencia entre F fría y caliente F se representa frente a la concentración del ligando. Un ajuste de la curva de datos brindan parámetros, tales como la unión afinidad de unión. Volver a imprimir con permiso de Elsevier, Métodos 28; número de licencia 3890230800113. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: análisis de datos MST. (A) La base de referencia corregida fl normalizado fluorescencia norma Delta F (‰), derivado de la señal de MST TJump, se representa frente a la concentración de ATP (en M). Se aplicó la ecuación de Hill (CE 50) para ajuste de curvas. Las barras de error representan la desviación estándar de cinco repeticiones biológicos. (B) Fracción parcela determinada de los datos mostrados en A. Los respectivos conjuntos de datos se normalizaron a la fracción unida, y el promedio de estos datos normalizados se presenta en el gráfico de unión. Las barras de error indican la desviación estándar de 5 repeticiones biológicos. (C) El gráfico de la fracción unida a muestra una comparación cuantitativa (Hill FIT) de los diferentes ligandos al aptámero. Las barras de error representan la desviaciones estándarción de dos repeticiones biológicos. (D) que se une afinidades (CE 50) de diferentes ligandos al aptámero. El área sombreada verde indica el sitio de unión del aptámero en el grupo de adenina de ATP. Esta cifra se modificó a partir de Elsevier, Métodos 28; número de licencia 3890230800113. Los conjuntos de datos desde el estudio previo se volvieron a analizar y se expanden dentro de este estudio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Ensayo para la optimización de experimentos MST. (A) la adsorción de proteínas y los efectos que se pegan se pueden detectar en la exploración capilar. formas de los picos irregulares, tales como picos aplanados o en forma de U, indican la adherencia del material de la muestra a la superficie de vidrio. docolgar el tipo capilar (estándar, superior, o hidrófobo) puede evitar la adsorción molécula, dando como resultado una forma de pico regular. (B) Las huellas de tiempo MST también sirven como un control de calidad, dado que los agregados pueden ser detectados allí como golpes y picos. Las condiciones experimentales se pueden optimizar mediante la mejora de la solubilidad de las moléculas (por ejemplo, incluyendo detergentes tales como Pluronic F-127 o variando los valores de pH o concentraciones de sal). La centrifugación puede ayudar a eliminar los agregados más grandes. Para asegurar una calidad óptima de datos, las huellas de tiempo MST debe ser similar el ejemplo dado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los controles de calidad:

adherencia inespecífica / adsorción de material de muestra a las superficies, así como los efectos de agregación, tiene una influencia dramática en la calidad de los datos de afinidad. Sin embargo, sólo unas pocas tecnologías de última generación ofrecen opciones precisos y rápidos para controlar y evitar estos efectos. MST ofrece controles de calidad integrados que detectan y ayudan a superar estos problemas, lo que permite la optimización paso a paso de la configuración técnica. Información importante sobre los efectos de fricción y de fluorescencia se puede extraer del análisis capilar y la forma capilar (pasos 5.2 y 7.5), mientras que la agregación / efectos de la precipitación (paso 7.7) pueden ser monitoreados en los perfiles de movimiento. Estos controles permiten para la mejora constante de la calidad de los datos y representan pasos críticos en el protocolo.

La detección de los efectos de adsorción y la solución de problemas:

La exploración capilar se lleva a cabo principalmente como un inipaso cial para determinar la posición de los capilares en el soporte de la bandeja mediante el escaneo de la fluorescencia sobre él. Cada pico representa uno capilar, lo que indica el punto de partida para la medición MST. La inspección visual de la forma de los picos permite la determinación de la adsorción de las moléculas a la superficie de vidrio, que es un control de calidad esencial que se debe realizar antes de comenzar el experimento MST. La superposición forma capilar permite la fácil detección de aplanados formas, pico lleno de baches, o incluso de los picos que se asemejan a una forma de U, lo que indica la adsorción / adherencia de moléculas a la superficie de vidrio interior del capilar (Figura 3A, panel superior). Recubierto de manera diferente tipos capilares (estándar, de alta calidad, hidrófobo) ayuda a garantizar la solubilidad y adsorción mínima de las moléculas a los capilares. Los capilares deben ser probados para determinar su idoneidad antes de los experimentos de unión. Detergentes tales como Tween (0,005 a 0,1%) o Pluronic F127 (0,01-0,1%) may también a prevenir los efectos de adsorción inespecífica. Optimización en esta fase del experimento es esencial para una alta calidad de datos (comparar Figura 3A, panel inferior).

La detección de los efectos de fluorescencia y la solución de problemas:

Las variaciones en la altura del pico de los capilares escaneados ofrecen otra capa de información sobre las características de la muestra. diferencias azar en la fluorescencia capilar pueden, por una parte, ser debida a pipetear errores o, por el contrario, se originan a partir de grandes agregados de ejemplo en la región de barrido que puede aumentar la fluorescencia drásticamente. Alta precisión de pipeteo es obligatoria para evitar los efectos de dilución. La mezcla de todas las soluciones de la pipeta hacia arriba y hacia abajo aumenta aún más la precisión. Además, es esencial para mantener el tampón consistente en cada capilar. Estrategias para manejar los efectos de agregación se presentan en un párrafo posterior.

cambios sistémicos de la fluorescencia con aumencantar concentración de ligando menudo indican ligando dependiente efectos de enfriamiento / de mejora. El "Test SD" se lleva a cabo con el fin de discriminar de unión inducida por cambios de fluorescencia de la pérdida de la fluorescencia no específica; esta prueba monitoriza la intensidad de fluorescencia en condiciones de desnaturalización. En caso de efectos de fluorescencia dependientes de ligando, las intensidades de fluorescencia bajo condiciones de desnaturalización deben ser idénticos, independiente de la concentración de reactivo de valoración. Si la diferencia en las intensidades de fluorescencia está todavía presente en estas condiciones, el material se perdió ya sea debido a la adsorción no específica a las paredes del tubo o debido a la agregación y la posterior centrifugación.

Con el fin de realizar la prueba de SD, 10 l de la primera y 10 l de la última etapa de dilución ligando son cada uno transferidos cuidadosamente a un tubo fresco que contiene 10 l de una mezcla SD 2x (SDS al 4% y DTT 40 mM). Las muestras se mezclan y las moléculas se desnaturalizan durante 5 minutos a 95 ° C. After llenando las muestras en tubos capilares, se miden las intensidades de fluorescencia. Si se detecta un efecto de fluorescencia dependiente de ligando, los datos pueden ser analizados directamente por la información de enlace deducida a partir de los cambios de intensidad de fluorescencia.

La detección de los efectos de agregación y de solución de problemas:

Irregulares, con baches trazas de tiempo MST indican agregación y / o precipitación efectos (Figura 3B, panel superior). Material de la muestra no agregada muestra un perfil limpio y suave termoforético movimiento (Figura 3B, panel inferior). La centrifugación del material de muestra antes de su uso (5-10 min a 14.000 xg), la adición de detergentes (0,005 a 0,1% de Tween-20, 0,01 a 0,1% de Pluronic F-127, o similar), el uso de BSA ( se recomiendan> 0,5 mg / ml), o el cambio de condiciones de tampón (pH y fuerza iónica) para minimizar los efectos de agregación y optimizar la calidad de los datos. Con el fin de obtener datos de alta calidad, sees esencial para minimizar los efectos de agregación.

Análisis de datos y ajuste de curvas:

Un perfil de movimiento termoforético se divide en diferentes fases, que pueden ser inspeccionados por separado o de forma concomitante. El T-Jump describe el cambio repentino en el rendimiento de fluorescencia en el cambio de temperatura, lo que representa una característica intrínseca de fluoróforos. La unión directa en el entorno inmediato del fluoróforo o conformación cambios tras la unión altamente afectan a la T-Jump. La termoforesis más lento se refiere al movimiento de las moléculas en el campo de temperatura, que ofrece información sobre la estructura general del complejo formado. El tipo predeterminado de análisis de datos emplea la configuración "termoforesis + T-Jump", explotando ambos fenómenos para determinar los parámetros de unión. En caso de que las dos fases tienen direcciones opuestas, se recomienda analizar las fases por separado. Tenga en cuenta que los tiempos de efectos y diferentes especies de MolecEGLAS podría conducir a diferencias en la afinidad de la termoforesis y T-Jump. Otro tipo de opción de análisis es el ajuste manual, que permite la investigación de regiones específicas del perfil de movimiento. Las perturbaciones debido a la agregación o la convección pueden ser excluidos de esta manera. Con el fin de mejorar la calidad de los datos, los cursores se pueden establecer antes de las señales de agregación. El examen de la termoforesis principios comúnmente produce datos con menos ruido, ya que la convección es un proceso dependiente del tiempo. Este ajuste manual temprana es muy recomendable para los experimentos con láser de potencia alta (80%). Tras la elección de la configuración de análisis de datos, dos modelos de ajuste integrados en el software de análisis se pueden aplicar para adaptarse a la curva de unión. La función de ajuste de Kd de la ley de acción de masas es adecuado para 1: 1 o modos de unión para la unión de varios sitios que poseen la misma afinidad. El independiente de la concentración constante de disociación K d describe el equilibrio entre el bouND y el estado no unido; Por lo tanto, se mide la afinidad de un sitio de unión a un ligando. La CE 50 valor dependiente de la concentración derivada de la ecuación de Hill representa la dosis eficaz de un ligando a la que la mitad de las moléculas marcadas están en el estado unido. El ajuste colina debe ser aplicado a multivalente modelos de unión, especialmente si son de cooperación.

Los controles de calidad integrados representan una gran ventaja del MST sobre tecnologías tales como SPR o ITC. Estos controles permiten la optimización rápida y fácil de la configuración técnica para asegurar una calidad óptima de datos. Además de las mediciones en tiempo eficiente (Kd en 15 min) y el montaje sin necesidad de inmovilización, MST ofrece la libre elección de tampones, que permite la evaluación de las interacciones moleculares, incluso en lisados y sueros 5,42,43. Debido al hecho de que termoforesis molecular depende del tamaño, la carga, y capa de hidratación de las moléculas, no hay limitacionesen el tamaño de los compañeros de interacción medidos durante las mediciones del MST. El rango dinámico fi nidad, desde pM a mM, junto con el bajo consumo de muestra, completa los puntos fuertes de la tecnología MST. Vale la pena mencionar que la TMS genera datos precisos sobre los parámetros de encuadernación básicos, como la afinidad de unión, estequiometría, y la termodinámica. Sin embargo, el MST no permite la medición de k en k y en las tarifas. Además, hay que considerar que, para la mayoría de los experimentos del MST, una modificación fluorescente debe añadirse a uno de los compañeros de interacción. Los datos generados están en buen acuerdo con tecnologías de última generación, tales como SPR y el CCI 32,43-46. Sin embargo, estos datos son de calidad controlada, los experimentos son más rápidos, y que consumen menos material. En general, el MST representa una poderosa tecnología ortogonal a tecnologías de última generación, con algunas ventajas adicionales.

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Disclosures

CE y TS son empleados de 2bind GmbH, que ofrece servicios de análisis biofísicos. las tasas de publicación de este video-artículo son pagados por 2bind GmbH.

Acknowledgments

Los autores no tienen reconocimientos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aptamer binding buffer 20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer IDT, Leuven, Belgium sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-
ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP Sigma Aldrich, Germany  A2383 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
ADP Sigma Aldrich, Germany  A2754 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
AMP Sigma Aldrich, Germany  A2252 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Adenine Sigma Aldrich, Germany  A8626 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
SAM Sigma Aldrich, Germany  A7007 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
dATP Sigma Aldrich, Germany  11934511001 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
CTP Sigma Aldrich, Germany  C1506 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
GTP Sigma Aldrich, Germany  G8877 10 mM stock solutions stored at - 20 °C
Monolith NT.115  NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-G008 Blue/Red Channel
MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard NanoTemper Technologies, Munich, Germany MO-K002
Eppendorf PCR tubes Eppendorf, Germany 30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1 NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2 Synergy Software

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References

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Bioquímica No. 119 Pequeño interacción molécula-aptámero parámetros de unión MicroScale termoforesis afinidad estequiometría termodinámica ácidos nucleicos vinculante mapeo de sitios de unión
Mapear el sitio de unión de un aptámero de ATP utilizando MicroScale termoforesis
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Entzian, C., Schubert, T. Mapping… More

Entzian, C., Schubert, T. Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (119), e55070, doi:10.3791/55070 (2017).

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