Summary
הקמנו שיטה לטיהור של חלבונים אינטראקציה coregulatory באמצעות מערכת LC-MS / MS.
Introduction
אינטראקציות בין חלבונים ממלאים תפקיד חשוב תפקודים ביולוגיים רבים. ככזה, אינטראקציות אלה היו מעורבים הולכים אותות; תחבורה חלבון על פני קרום התא; חילוף חומרים בתא; וכמה תהליכים גרעיניים, כולל שכפול הדנ"א, לתקן נזקים ב- DNA, רקומבינציה, והתעתיק 1, 2, 3, 4. זיהוי חלבונים מעורבים באינטראקציות אלה היא אפוא קריטי לקידום הבנתנו תהליכים תאיים אלה.
Immunoprecipitation (IP) היא טכניקה תוקף להשתמש כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים. על מנת להקל על זיהוי של חלבונים-immunoprecipitated שיתוף, ספקטרומטריית מסה הוא מנוצל לעיתים קרובות 5, 6, 7, 8,9. על ידי מיקוד חבר ידוע של קומפלקס חלבון עם נוגדן, אפשר לבודד את החלבון מורכב ובהמשך לזהות מרכיביה הידועים באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסה. ARIP4 (אינטראקצית קולטן האנדרוגן חלבון 4), coregulator תעתיק, אינטראקציה עם חלבונים רצפטור גרעיניים כדי להפעיל או לדכא יזמי היעד שלה באופן תלוי קשר 9, 10. כדי להבין טוב יותר את מנגנוני ויסות תעתיק מסדירי גורמים גרעיניים אלה, אנו מתארים שיטה מקיפה לטהר לזהות חלבוני אינטראקצית ARIP4 באמצעות מערכת LC-MS / MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transfection
- זרעים HEK293 תאים צלחות תרבות 100 מ"מ (2 x 10 6 תאים / תבשיל). תרבות התאים במדיום של הנשר השונה של Dulbecco בתוספת 10% בסרום עוברי עגל, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו -100 יחידות / מיליליטר פניצילין. דגירה התאים בתוך חממה humidified ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס.
- למחרת, transfect את התאים עם 10 מיקרוגרם של פלסמיד ARIP4 מתויג FLAG באמצעות 40 μl של מגיב transfection פי הנחיות היצרן 11.
2. הפקת חלבון
- כ 36 שעות שלאחר transfection, לשטוף את התאים עם PBS קר כקרח ו לקצור את התאים באמצעות מגרד. העברת התאים לתוך 1.5 mltube צנטריפוגות זה ב 8000 XG במשך 2 דקות ב 4 °. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 5x נפח גלולה של חיץ 0.4 M KCl (חיץ מלח גבוהה: 20 מ"מ טריס- HCl (pH 8.0), 0.4 KCl M, 5 מ"מ MgCl 2, 10% גליצרול, 0.1% NP-40, 10 מ"מ ב-mercaptethanol, קוקטייל מעכב פרוטאז 1x). סובב את התערובת במשך 20 דקות ב 4 °.
- צנטריפוגה הצינור ב 17,700 XG במשך 10 דקות ב 4 °.
- מעבירים את supernatant (תמצית כל תא) לצינור 2 מ"ל חדשה ולהוסיף 3x נפח הראשונית של 0 חיץ M KCl (דילול חיץ: 20 מ"מ טריס- HCl (pH 8.0), 5 2 מ"מ MgCl, 10% גליצרול, 0.1% NP-40, 10 מ"מ β-mercaptoethanol, מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x).
- בצע צנטריפוגה אחרת (17,700 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C) ולהעביר את supernatant (תמצית התא כולו) לצינור 2 מ"ל חדש.
3. Immunoprecipitation
- במהלך צנטריפוגה (2.4), לשטוף 50 μl של חרוזים אנטי FLAG עם PBS, 0.1 מ 'גליצין-הידרוכלוריד, ולאחר מכן 1 M טריס-הידרוכלוריד, ואחריו כביסה פעמיים עם 0.1M KCl חיץ (חיץ מלח נמוכה: 20 מ"מ כמה עצוב HCl (pH 8.0), 0.1 מ 'KCl, 5 מ"מ MgCl2, 10% גליצרול, 0.1% NP-40, 10 מ'M ב-mercaptoethanol, מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x). צנטריפוגה עבור תהליך כביסה זה מבוצעת XG ב 2000 דקות 1 ב 4 ° C.
- מערבבים 50 μl של חרוזים FLAG עם תמציות כל תא בעדינות לסובב את התערובת במשך 4 שעות ב 2-4 מעלות צלזיוס (1% של תמצית כל תא משלב 2.4 צריך גם להישמר ב -80 ° C לשימוש עתידי כקלט).
- מעבירים את המדגם לעמודה ספין מיקרו (ירידה של כדור הארץ). שמור את הזרימה דרך צינור 1.5 מ"ל, להקפיא אותו באמצעות חנקן נוזלי, ולאחסן אותו ב -80 ° C (לבדוק את רמות החלבון של שני קלט זרימה דרך באמצעות ניתוח כתם המערבי).
- הוסף 1 מ"ל של 0.1 חיץ M KCl (חיץ מלח נמוכה) כדי לשטוף את החרוזים FLAG (ירידה של כדור הארץ).
- חזור על שלב 3.4 לפחות יותר ארבע פעמים (עבור סכום כולל של חמישה שוטף).
4. Elution
- מניחים את הטור לתוך צינור 1.5 מ"ל ו צנטריפוגות זה XG ב 2000 דקות 1; החרוזים יתייבשו.
- כיסוי או בתחתית הטור.
- הוסף 50 μl (שווה לנפח של חרוזים FLAG) של 0.1 מ 'גליצין-HCl (pH 2.5).
- נער בעדינות את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- מניחים את הטור לתוך צינור 1.5 מ"ל חדש צנטריפוגות זה XG ב 2000 דקות 1.
- פתרון eluted מנוטרל עם 10 μl של 1 M טריס- HCl (pH 8.0); ומערבבים היטב על ידי pipetting או באמצעות מכונה מערבולת.
5. אלקילציה ו trypsinization
- הוסף 50 μl של 100 מ"מ NH 4 HCO 3, 10 μl של CH 3 CN, ו -2 μl של dithiothreitol לתערובת (112 הנפח הכולל μl).
- דגירה המדגם במשך 30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס.
- מניחים את המדגם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- הוסף 10 μl של 333 מ"מ iodoacetamide המדגם ו דגירה אותו בחושך במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- הוסף 10 μl של טריפסין (33 ng / μl) לתערובת ו דגירה אותו לילה בשעה 37 ° C.
ילדה = "jove_title"> 6. LC-MS / MS ניתוח
- בעקבות trypsinization לילה, להעביר את המוצר הסופי למתקן LC-MS / MS או למעבדה ספקטרומטריית מסה של צד שלישי עבור ניתוח 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זיהינו אות ARIP4 חזקה סביב 160 kDa, כמו גם אלה של פקד מדגם מדומה וכמה חלבונים ידועים אחרים (איור 1). LC-MS ניתוח / MS זיהו שני פפטידים מורכבים ARIP4 ואת קו-פקטורים פפטיד הפוטנציאל בתוך שבריר של חרוזים FLAG (טבלה 1). p62 (Sequestosome1), גורם-שותף ARIP4 ידוע 11 זוהה בניתוח (טבלה 1), אשר מאשרת את היעילות של מערכת זו 11. גם זיהינו הרבה חלבונים בעבר דיווחו אחרים כי אינטראקציה עם ARIP4. בדרך זו, Sumo2 10 ו דרייק 13 אותרו באמצעות ניתוח LC-MS / MS. פפטידים ARIP4 זוהו גם באמצעות ניתוח LC-MS / MS, אשר טוען כי ה- IP היה באיכות גבוהה. בסך הכל, את הטכניקה LC-MS / MS הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש לזיהוי הקישור אירועים גרעיני ידועed כדי אינטראקציות חלבון-חלבון. תוצאות ספקטרומטריה מלאות תהיינה זמינות על פי בקשה.
איור 1: טיהור של מכלולי ARIP4. מכתים כסף של ARIP4 epitope מתויג FLAG (ARIP4-F) לידי ביטוי HEK293 תאים ו immunoprecipitation עם נוגדן FLAG ספציפי. חלבונים מטוהרים נפתרו באמצעות ג'ל אלקטרופורזה ו דמיינו עם כתם כסף. כמו שליטה, טיהור מדומה בוצעה על HEK293 תאים שלא מבטאים חלבונים אקסוגניים. סטנדרטי משקל מולקולריים מוצגים בצד השמאל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1: identification של חלבונים מחייבים הרומן ARIP4. חרוזי FLAG כבול קומפלקסי חלבונים מטוהרים היו מנותקים ידי עיכול מבוסס-טריפסין. חלבונים אלה זוהו מכן באמצעות LC-MS / MS ניתוח. נתוני LC-MS / MS נותחו באמצעות במאגר Swiss-Prot ותוכנת קמע. מספר פפטידים ואת הזהות של חלבונים אלה מוצגים. חלבונים רק עם ציוני קמע מובהקים (p <0.05) נבחרו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
transfection יעיל הוא חיוני כדי להשיג תוצאה מוצלחת עם פרוטוקול זה. בהתאם לכך, אנו ממליצים להשתמש ניתוח כתם המערבי כדי לקבוע את רמות החלבון FLAG-מתויג immunoprecipitated. שלב זה מאפשר למשתמשים לוודא חלבון העניין שלהם מבוטא ביתר כראוי, ויתר מזאת, כי ה- IP בוצע בהצלחה. רמות החלבון מתויג FLAG צריך גם להיבדק לפני הניתוח ספקטרומטריית מסה.
מדגם מדומה אמור לשמש כביקורת שלילית, כדי למנוע קבלת תוצאה חיובית כוזבת להיפלות ברקע מאינטראקציות נכונות. יתר על כן, כאשר לומדים חלבונים אנושיים, יש לבצע ניסויים בסביבה נקיה יחסית (למשל, חדר נקי) כדי למנוע זיהום. למרות חיץ מיצוי חלבון עם ריכוז מלח גבוה (0.3-0.4 מ ') ניתן להשתמש מדי פעם כדי לחלץ חלבונים גרעיניים, בופר IP עם ריכוז 0.1-0.15 M מלח הוא רובעשר מומלץ. זה מאפשר הליך IP כדי להמשיך מבלי לשבש אינטראקציות חלבון-חלבון. כדי לצמצם עוד יותר את אות הרקע, חרוזים מגנטיים יכולים לשמש עבור תהליך הטיהור. כמו כן, חשוב כדי לייעל את תנאי תמוגה תא על מנת לצמצם תוצאות חיוביות שגויות.
המשמעות של השיטה המתוארת במחקר זה ביחס טכניקות אחרות (למשל, ג'ל עיכול מבוסס זיהוי חלבון יחיד) 5, 10, 11 הוא שהיא מאפשרת למשתמשים לבצע LC-MS / MS ניתוח לזיהוי התפוקה הגבוהה של אינטראקציות חלבון בין קו-פקטורים גרעיניים ושותפי מחייבים משלה. ויסות הגנים תעתיק תלויה מאוד על שיתוף הפעולה של דנ"א וחלבונים מחייב ספציפי ברצף. לפיכך, גורמי שעתוק לעתים קרובות אינטראקציה עם מספר רב של שיתוף גורמים לשנות ביטוי גן המטרה. th erefore, להבין את האירועים הסלולר טוב מסדירי מנגנוני תעתיק אלה, זיהוי שותפי תעתיק מקדמי פעילות חלבון המטרה היא בעל חשיבות עליונה. השיטה שלנו מאפשרת למשתמשים לזהות קו-פקטורים גרעיניים המשוערת במהירות באמצעות גורם שעתוק העניין שלהם משפרת עוד יותר את הבנתנו מנגנוני ויסות תעתיק.
פפטיד FLAG עשוי לשמש גם במקום פתרון 0.1 M גליצין-HCl (pH 2.5) במהלך תהליך elution. עם זאת, אם שינוי זה הוא מועסק, ה- pH של למאגר המשמש לדילול פפטידים FLAG צריך להיות במעקב. פפטידים FLAG 3x צריך לשמש גם כדי elute החלבונים מן החרוזים FLAG. לפיכך, פתרון עם pH גבוה יחסית יש להשתמש כדי לדלל את פפטידים FLAG בתנאים אלה שעברו שינוי. כמו כן, חשוב להימנע הקפאת חוזרות הפשרה של דגימות על מנת לשמור על אינטראקציות חלבון-חלבון נאותה.
t "> בהזדמנות, אופטימיזציה של תהליך trypsinization עשוי גם להידרש שיפור הדיוק של תוצאות ההקרנה אינטראקציה חלבון. למרות שהשיטה LC-MS / MS הוא כלי שניתן להשתמש בהם כדי לזהות את יחסי הגומלין בין הגרעין חלבונים, אחת מהמגבלות שלה הוא שהיא אינה מספקת פרטים מדויקים לגבי ההרכבה של החלבון מורכב. כדי לשפר את היציבות מורכבת, כימי crosslinking טיפולים יכולים לשמש 14. כפי שיטה חלופית, נימי אלקטרופורזה-MS / MS הוא גם שימושי 15 .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) | nacalai tesque | 03969-21 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Micro Bio-Spin Columns | BIO-RAD | 732-6204 |
References
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807 (2010).
- Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
- MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
- Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
- Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
- Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
- Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
- Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430 (2013).
- ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
- Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
- Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498 (2015).
- Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
- Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
- Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
- Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).
