Summary
Biz, LC-MS / MS sistemi kullanılarak coregulatory etkileşimi proteinlerinin saflaştırılması için bir yöntem oluşturmuştur.
Introduction
Protein-protein etkileşimi, birçok biyolojik fonksiyonları çok önemli bir rol oynar. Bu nedenle, bu etkileşimler sinyal transdüksiyonunda rol oynamaktadır; hücre zarlarından protein taşıma; Hücre metabolizması; ve DNA replikasyonu, DNA hasarı tamiri, rekombinasyon ve transkripsiyon da 1, 2, 3, 4 de dahil olmak üzere çok sayıda nükleer işlemler. Bu etkileşimlerin yer alan proteinleri belirlenmesi bu hücresel süreçlerin anlayışımızı ilerleyen nedenle önemlidir.
Imüno-(IP) protein-protein etkileşimlerini analiz etmek için kullanılan bir geçerli bir tekniktir. Ko-immünopresipitasyon proteinlerin belirlenmesini kolaylaştırmak için, kütle spektrometresi, genellikle kullanılır 5, 6, 7, 8,9. bir antikor ile bir protein kompleksinin bir bilinen elemanının hedefleyerek, protein kompleksi izole etmek ve daha sonra kütle spektrometresi analizi ile de bilinmeyen bileşenleri tanımlamak mümkündür. ARIP4 (androjen reseptörü-etkileşimli protein 4), bir transkripsiyon coregulator açmak ya da bağlam-bağımlı bir şekilde 9, 10 hedef promoterleri bastırmak amacıyla nükleer reseptör proteinleri ile etkileşime girer. daha iyi bu nükleer faktörler düzenleyen transkripsiyon düzenleyici mekanizmaları anlamak için, biz arındırmak ve LC-MS / MS sistemi kullanılarak ARIP4 etkileşen proteinleri tespit için kapsamlı bir yöntem açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transfeksiyon
- 100 mM kültür plakaları (2 x 10 6 hücre / çanak) içinde HEK293 hücrelerinin tohumu. Kültür,% 10 fetal dana serumu, 100 ug / ml streptomisin ve 100 birim / ml penisilin takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı içinde hücre. % 5 CO2 ve 37 ° C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde hücreleri inkübe edin.
- Sonraki gün, FLAG-etiketli ARIP4 plazmid 10 ug üreticinin talimatlarına 11'e göre transfeksiyon reaktifi 40 ul kullanarak hücreleri transfekte.
2. Protein Ekstraksiyonu
- Yaklaşık olarak transfeksiyondan 36 saat, buz gibi soğuk PBS ile hücrelerin yıkayın ve bir kazıyıcı kullanarak hücreleri hasat edilir. 1.5 mltube içine hücreleri aktarın ve 4 ° C 'de 2 dakika boyunca 8000 x g'de santrifüj o. Aspire süpernatan ve 5x hücre pelletini 0.4 M KCI tamponu pelet hacmi (yüksek tuz tamponu: 20 mM Tris-HCI (pH 8.0), 0.4 M KCI, 5 mM MgCl2,% 10 gliserol,% 0.1 NP-40, 10 mM B-mercaptethanol, 1 x proteaz inhibitör kokteyli). 4 ° C'de 20 dakika boyunca karışımın döndürün.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 17,700 x g'de santrifüjleyin tüpü.
- (Yeni bir 2 ml'lik tüp süpernatantı (bütün hücre ekstresi) aktarın ve 0 M KCI tampon başlangıç hacminin 3x ilave seyreltme tamponu: 20 mM Tris-HCI (pH 8.0), 5 mM MgCl2,% 10 gliserol, % 0.1 NP-40, 10 mM β-merkaptoetanol, 1 x proteaz inhibitör kokteyli).
- Başka bir santrifüj (4 ° C 'de 10 dakika süre ile 17,700 x g) gerçekleştirmek ve yeni bir 2 ml tüp supernatant (bütün hücre ekstresi) aktarın.
3. Immunoprecipitation
- 20 mM Tris: santrifüj (2.4) boyunca (0.1 M KCI tamponu ile iki kez düşük tuzlu tampon yıkama, ardından PBS ile anti-FLAG, boncuk tanelerin 50 ul, 0.1 M glisin-hidroklorür, ve daha sonra 1 M Tris-hidroklorür, yıkama HCI (pH 8.0), 0.1 m KCI, 5 mM MgCI2,% 10 gliserol,% 0.1 NP-40, 10 mM B-merkaptoetanol, 1 x proteaz inhibitör kokteyli). Bu yıkama işlemi için santrifüj 4 ° C de 1 dakika boyunca 2.000 x g'de gerçekleştirilir.
- bütün hücre ekstresi ile FLAG, boncuk tanelerin 50 ul karıştırın ve yavaşça 2-4 ° C (adım 2.4 bütün hücre ekstresi% 1, ayrıca ileride kullanmak üzere, -80 ° C'de saklanmalıdır 4 st için karışımın döndürme ) bir girdi olarak.
- Bir mikro spin kolon (yerçekimi bırak) örnek aktarın. (Giriş ve akış-through Western Blot analizi kullanılarak hem protein düzeylerini kontrol), 1.5 ml tüp içinde akış yoluyla tutmak sıvı azot kullanarak dondurma ve -80 ° C'de saklayın.
- FLAG boncuk (yerçekimi damla) ilave edilmiştir 0.1 M KCI tamponu (düşük tuz tamponu) 1 ml ilave edilir.
- 3.4 En az dört kez daha (beş yıkar toplam) adımı tekrarlayın.
4. Elüsyon
- 1.5 ml tüp içine sütunu yerleştirin ve 1 dakika boyunca 2.000 x g'de olarak santrifüje tabi tutulur; boncuk kurur.
- alt Capsütun.
- 0.1 M glisin-HCl (pH 2.5) (bayrak boncukların hacmine eşit), 50 ul ekle.
- Yavaşça oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karışımın çalkalayın.
- yeni bir 1.5 ml'lik tüp içine sütunu yerleştirin ve 1 dakika boyunca 2.000 x g'de da santrifüj.
- elüt Çözelti, 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 10 ul ile nötralize edilir; pipetleme veya vorteks makinesi ile iyice karıştırın.
5. alkilasyonu ve tripsinleme
- 100 mM NH4 HCO3-, CH3CN 10 ul, ve karışım ditiotreitol 2 ul (112 ul toplam hacim) 50 ul ekle.
- 56 ° C'de 30 dakika boyunca örnek inkübe edin.
- 10 dakika boyunca oda sıcaklığında örnek yerleştirin.
- iyodoasetamid örnek 333 mM, 10 ul ilave edin ve 37 ° C'de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir.
- Karışıma tripsin 10 ul (33 ng / | il) ilave edilir ve 37 ° C'de gece boyunca inkübe.
- Gecede Tripsinizasyonu takiben LC-MS / MS tesisine veya analiz 12 için üçüncü taraf kütle spektrometresi laboratuarına son ürünü taşımak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Güçlü bir ARIP4 sinyali 160 kDa, hem de sahte bir numune kontrol ve çeşitli diğer bilinmeyen proteinleri gibi (Şekil 1) tanımlanmıştır. LC-MS / MS analizi ARIP4 kompleks peptidleri ve FLAG boncuklar (Tablo 1) fraksiyonu içinde potansiyel peptid kofaktörleri iki tespit edilmiştir. P62 (Sequestosome1), bilinen bir ARIP4 kofaktör 11, bu sistemin 11 etkinliğini teyit analizi (Tablo 1) olarak tespit edilmiştir. Ayrıca ARIP4 etkileşim diğer daha önce bildirilen proteinleri tanımlanmıştır. Bu şekilde, Sumo2 10 ve DryK 13 LC-MS / MS analizi ile tespit edildi. ARIP4 peptidler ayrıca, IP yüksek kalitede olduğunu göstermektedir LC-MS / MS analizi kullanılarak belirlenmiştir. Genel olarak, LC-MS / MS tekniği bilinmiyor nükleer olayları bağlantı tanımlamak için kullanılabilecek bir güçlü bir araçtırprotein-protein etkileşimleri için ed. Tam kitle spektrometrik sonuçları istek üzerine olacaktır.
Şekil 1: ARIP4 Komplekslerinin saflaştırılması. FLAG epitopu etiketli ARIP4 gümüş boyama (ARIP4-F) bir FLAG-spesifik antikor ile HEK293 hücreleri ve immüno olarak ifade edilmiştir. Saflaştırılmış proteinler, jel elektroforezi kullanılarak çözüldü ve gümüş boya ile görselleştirilmiştir. Bir kontrol olarak, sahte bir saflaştırma ekzojen proteinleri eksprese etmedi HEK293 hücreleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Molekül ağırlığı standartları solda gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: identificatioYeni ARIP4 bağlayıcı proteinlerin N. Saflaştırılmış protein kompleksleri bağlı FLAG boncuklar tripsin göre sindirimi ile ayrıştırılmış. Bu proteinler daha sonra LC-MS / MS analizi ile belirlendi. LC-MS / MS verileri Swiss-Prot veritabanı ve MASCOT yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. peptidlerin sayısı ve bu proteinlerin kimliği gösterilmiştir. önemli MASCOT puanları (p <0.05) ile sadece proteinleri seçildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verimli transfeksiyon bu protokol ile başarılı bir sonuç elde etmek esastır. Buna göre, imüno-FLAG etiketli proteini seviyelerini belirlemek için, Batı benek analizi kullanılarak önerilir. Bu adım, IP başarıyla gerçekleştirildi olduğunu, kendi ilgi protein düzgün dahası, aşırı ve doğrulamak için olanak sağlar. FLAG-etiketli protein seviyeleri, aynı zamanda kütle spektrometresi analizi önce kontrol edilmelidir.
Bir sahte örnek, yanlış pozitif sonuç elde bilmek ve gerçek etkileşimlerden arka ayırmak için bir negatif kontrol olarak kullanılır. İnsan proteinleri okuyan Dahası, deney kontaminasyonu önlemek için nispeten temiz bir ortamda (örneğin, temiz oda) yapılmalıdır. yüksek tuz konsantrasyonu (0.3-0.4 M) ile bir protein ekstraksiyon tamponu arada çekirdek proteinleri çıkarmak için kullanılabilir, ancak bir 0.1-0.15 M tuz konsantrasyonuna sahip bir IP tampon en çokOn önerilir. Bu IP yöntemi, protein-protein etkileşimleri bozmadan devam etmesine olanak verir. daha arka plan sinyalini en aza indirmek için, manyetik boncuk arındırma işlemi için de kullanılabilir. Yanlış pozitif sonuçları azaltmak için hücre lisis koşulları optimize etmek için de önemlidir.
Diğer tekniklere göre, bu çalışmada açıklanan yönteme önemi (jel, örneğin, sindirim bazlı tek bir protein tanımlama) 5, 10, 11 kullanıcıların yüksek verimli tanımlanması için LC-MS / MS analizi gerçekleştirmek için izin vermektedir nükleer kofaktörler ve bunların bağlayıcı ortakları arasındaki protein etkileşimleri. Transkripsiyonel gen regülasyonu sekansa spesifik DNA bağlama proteinlerinin birlikte son derece bağlıdır. Bu duruma göre, transkripsiyon faktörleri genellikle hedef gen ekspresyonunu değiştirmek için ko-faktörler çok sayıda etkileşim. th erefore, daha iyi hücresel olayları, bu transkripsiyonel mekanizmaların yöneten hedef protein aktivitesi her şeyden önemlidir teşvik transkripsiyonel ortakları belirlemek anlamak için. Bizim yöntemi kullanıcıların hızlı kendi ilgi transkripsiyon faktörü aracılığıyla varsayılan nükleer kofaktör belirlemenizi sağlar ve daha fazla transkripsiyonel düzenleyici mekanizmaların anlayışımızı artırır.
FLAG peptidi ayrıca elüsyon işlemi sırasında 0.1 M glisin-HCl çözeltisi (pH 2.5) yerine kullanılabilmektedir. Bu modifikasyon, mevcut olduğu takdirde, ancak, FLAG peptidi seyreltmek için kullanılan tampon, pH izlenmelidir. 3x FLAG peptitler de FLAG boncuklardan proteinleri elüte etmek için kullanılmalıdır. Bu duruma göre, nispeten yüksek bir pH değerine sahip bir çözelti, modifiye edilmiş bu koşullar altında FLAG peptidi seyreltmek için kullanılır. Doğru protein-protein etkileşimlerini muhafaza edilmesi amacıyla numune tekrar dondurma ve eritme önlemek için de çok önemlidir.
t "> vesileyle, tripsinizasyon işleminin optimizasyonu da protein etkileşimi tarama sonuçlarının doğruluğunu arttırmak için gerekli olabilir. LC-MS / MS yöntemi çekirdek arasındaki etkileşimleri tanımlamak için kullanılabilen bir araç olsa proteinler, kendi sınırlamaları biri protein kompleksi ile ilgili olarak tam ayrıntıları olmamasıdır. kompleksin kararlılığını geliştirmek için, kimyasal işlemlere çapraz bağlama 14 kullanılabilir. alternatif bir yöntem olarak, kapiler elektroforez-MS / MS de yararlıdır 15 .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) | nacalai tesque | 03969-21 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Micro Bio-Spin Columns | BIO-RAD | 732-6204 |
References
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807 (2010).
- Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
- MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
- Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
- Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
- Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
- Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
- Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430 (2013).
- ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
- Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
- Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498 (2015).
- Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
- Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
- Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
- Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).
