Summary
Nós estabelecemos um método para a purificação de proteínas de interacção co-regulação que utilizam o sistema de LC-MS / MS.
Introduction
interacções proteína-proteína desempenham um papel importante em muitas funções biológicas. Como tal, estas interacções têm sido implicados na transdução de sinal; transporte de proteínas através das membranas celulares; metabolismo celular; e vários processos nucleares, incluindo a replicação do ADN, reparação de danos do ADN, a recombinação e a transcrição 1, 2, 3, 4. Identificar as proteínas envolvidas nestas interacções é, portanto, fundamental para o avanço da nossa compreensão destes processos celulares.
A imunoprecipitação (IP) é uma técnica validado e utilizado para analisar interacções proteína-proteína. A fim de facilitar a identificação de proteínas co-imunoprecipitada, a espectrometria de massa é frequentemente utilizada 5, 6, 7, 8,9. Ao direccionar um membro conhecido de um complexo de proteína com um anticorpo, é possível isolar o complexo de proteína e, subsequentemente, para identificar os seus componentes desconhecidos através de análise de espectrometria de massa. ARIP4 (proteína-receptor de androgénio interagindo 4), um coregulator transcricional, interage com as proteínas nucleares do receptor, a fim de activar ou reprimir seus promotores-alvo de uma forma dependente do contexto 9, 10. Para melhor compreender os mecanismos reguladores da transcrição que regulam estes factores nucleares, nós descrevemos um método global para purificar e identificar proteínas que interagem ARIP4 usando o sistema de LC-MS / MS.
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Protocol
1. A transfecção
- Semente células HEK293 em placas de cultura de 100 mm (2 x 10 6 células / prato). Cultura das células em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, 100 ug / ml de estreptomicina, e 100 unidades / ml de penicilina. Incubam-se as células numa incubadora humidificada a 5% CO 2 e 37 ° C.
- No dia seguinte, transfectar as células com 10 ug de plasmídeo ARIP4 marcado com FLAG, utilizando 40 ul de reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante 11.
2. Extracção de Proteína
- Aproximadamente 36 h após a transfecção, lavar as células com PBS gelado e colheita das células utilizando um raspador. Transferir as células em uma mltube 1,5 e centrifuga-se que em 8000 xg durante 2 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5x o volume da pelota de tampão de KCl 0,4 (tampão de elevado teor de sal: Tris-HCl 20 (pH 8,0), 0,4 M de KCl, MgCl2 5 mM, 10% de glicerol, 0,1% de NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, cocktail inibidor de protease 1x). Girar-se a mistura durante 20 min a 4 ° C.
- Centrifuga-se o tubo a 17.700 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Transferir o sobrenadante (extracto de célula total) para um novo tubo de 2 mL e adicionar 3x o volume inicial de 0 M de tampão de KCl (tampão de diluição: Tris-HCl 20 (pH 8,0), MgCl2 5 mM, glicerol a 10%, 0,1% de NP-40, 10 mM β-mercaptoetanol, 1x mistura de inibidores de protease).
- Realizar uma outra centrifugação (17700 xg durante 10 min a 4 ° C) e transferir o sobrenadante (extracto de célula total) para um novo tubo de 2 mL.
3. Immunoprecipitation
- Durante a centrifugação (2.4), lavar 50 ul de pérolas de anti-Flag com PBS, glicina-cloridrato de 0,1 M, e em seguida, 1 M de Tris-cloridrato, seguido de lavagem duas vezes com tampão de 0,1 M de KCl (tampão de baixa salinidade: Tris 20 mM HCl (pH 8,0), 0,1 m de KCl, 5 mM de MgCl2, 10% de glicerol, 0,1% de NP-40, 10 mM b-mercaptoetanol, 1x mistura de inibidores de protease). A centrifugação durante este processo de lavagem é realizado a 2000 xg durante 1 min a 4 ° C.
- Misturar 50 ul de pérolas de FLAG com os extractos de células completas e rodar suavemente a mistura durante 4 h a 2-4 ° C (1% de extracto de células completas a partir do passo 2.4, também deve ser mantida a -80 ° C para uso futuro como uma entrada).
- Transferir a amostra a uma coluna de rotação Micro (queda de gravidade). Mantenha o flow-through em um tubo de 1,5 ml, congelá-lo usando nitrogênio líquido, e armazená-lo a -80 ° C (verificar os níveis de proteína tanto da entrada e flow-through utilizando análise de Western blot).
- Adicionar 1 ml de tampão 0,1 M KCl (tampão de baixo teor de sal) para lavar as contas Flag (gota gravidade).
- Repetir o passo 3.4, pelo menos, quatro vezes mais (para um total de cinco lavagens).
4. eluição
- Colocar a coluna em um tubo de 1,5 mL e centrifuga-se que a 2.000 xg durante 1 min; os grânulos irá secar.
- Tapar o fundo doa coluna.
- Adicionar 50 ul (igual ao volume de esferas de FLAG) de M de glicina-HCl 0,1 M (pH 2,5).
- Agitar suavemente a mistura durante 10 min à temperatura ambiente.
- Colocar a coluna para um novo tubo de 1,5 mL e centrifuga-se que a 2.000 xg durante 1 min.
- A solução eluída é neutralizada com 10 ul de Tris-HCl 1 M (pH 8,0); misturar bem por pipetagem ou utilizando uma máquina de vórtice.
5. A alquilação e tripsinização
- Adicionar 50 ul de 100 mM NH 4 HCO 3, 10 ul de CH3CN, e 2 ul de ditiotreitol à mistura (112 ul de volume total).
- Incubar a amostra durante 30 min a 56 ° C.
- Colocar a amostra à temperatura ambiente durante 10 min.
- Adicionam-se 10 ul de 333 mM de iodoacetamida à amostra e incubar no escuro durante 30 min a 37 ° C.
- Adicionar 10 ul de tripsina (33 ng / ul) à mistura e incubar durante a noite a 37 ° C.
- Seguindo tripsinização durante a noite, transportar o produto final a uma LC-MS instalação / MS ou a um laboratório de espectrometria de massa de terceiros para análise 12.
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Representative Results
Foram identificados um sinal forte ARIP4, cerca de 160 kDa, bem como aqueles de uma amostra de controlo simulado e várias outras proteínas desconhecidas (Figura 1). A análise por LC-MS / MS identificou ambos os péptidos complexos ARIP4 e os potenciais co-factores peptídicos dentro da fracção de grânulos de bandeira (Tabela 1). p62 (Sequestosome1), um cofactor ARIP4 conhecido foi 11 identificada na análise (Tabela 1), o que confirma a eficácia deste sistema 11. Também identificamos muitas outras proteínas anteriormente relatados que interagem com ARIP4. Desta forma, Sumo2 10 e 13 DryK foram detectadas através da análise por LC-MS / MS. peptídeos ARIP4 também foram identificados através da análise LC-MS / MS, o que sugere que o IP foi de alta qualidade. Em geral, a técnica de LC-MS / MS é uma ferramenta poderosa que pode ser utilizada para identificar eventos desconhecido ligação nuclearEd para interacções proteína-proteína. resultados de espectrometria de massa completos estarão disponíveis mediante solicitação.
Figura 1: Purificação de Complexos de ARIP4. A coloração com prata de FLAG ARIP4 epitopo-marcadas (ARIP4-F), expresso em células HEK293 e a imunoprecipitação com um anticorpo específico para o FLAG. As proteínas purificadas foram resolvidos utilizando electroforese em gel e visualizado com uma coloração de prata. Como um controlo, uma purificação simulada foi realizada em células HEK293 que não expressam proteínas exógenas. Os padrões de peso molecular estão apresentados à esquerda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: identification da Novel ARIP4 Proteínas de Ligação. grânulos BANDEIRA vinculados a complexos de proteínas purificadas foram dissociadas por digestão à base de tripsina. Estas proteínas foram subsequentemente identificado utilizando análise por LC-MS / MS. Os dados de LC-MS / MS foram analisados utilizando a base de dados Swiss-Prot e software de MASCOT. O número de péptidos e a identidade destas proteínas são mostradas. Foram selecionados apenas proteínas com pontuações significativas MASCOTE (p <0,05).
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Discussion
transfecção eficiente é essencial para obter um resultado bem sucedido com este protocolo. Assim, recomendamos o uso de análise de Western blot para determinar os níveis de proteína FLAG-marcadas imunoprecipitadas. Esta etapa permite que os usuários para verificar se a sua proteína de interesse é adequadamente overexpressed e, além disso, que o IP foi realizada com sucesso. Os níveis de proteína marcada com Flag também deve ser verificado antes da análise por espectrometria de massa.
Uma amostra simulada deve ser usado como um controlo negativo para evitar a obtenção de um resultado positivo falso e para discriminar o fundo dos verdadeiros interacções. Além disso, quando se estuda proteínas humanas, as experiências devem ser realizadas num ambiente relativamente limpos (por exemplo, uma sala limpa) para evitar a contaminação. Apesar de um tampão de extracção de proteína com uma concentração elevada de sal (0,3-0,4 M) pode ser ocasionalmente usado para extrair as proteínas nucleares, um tampão IP com uma concentração de 0,1-0,15 M de sal é de maisdez recomendado. Este procedimento permite que o IP para prosseguir sem perturbar interacções proteína-proteína. Para minimizar ainda mais o sinal de fundo, esferas magnéticas pode ser utilizada para o processo de purificação. Também é importante optimizar as condições de lise celular, a fim de reduzir os resultados falsos positivos.
(Identificação, por exemplo, em gel de digestão com base em única proteína) O significado do método descrito neste estudo no que se refere a outras técnicas de 5, 10, 11 é que ele permite que os utilizadores para realizar a análise / MS LC-MS para a identificação de alto rendimento das interações proteína entre cofatores nucleares e seus parceiros de ligação. regulação transcricional de genes é altamente dependente da cooperação das proteínas de ligação a ADN específica da sequência. Por conseguinte, os factores de transcrição muitas vezes interagem com um grande número de co-factores para alterar a expressão do gene alvo. º erefore, para entender melhor os eventos celulares que regem esses mecanismos de transcrição, identificação de parceiros de transcrição que promovem a atividade da proteína-alvo é primordial. Nosso método permite aos usuários identificar rapidamente cofatores nucleares putativos através do seu fator de transcrição de interesse e aumenta ainda mais a nossa compreensão dos mecanismos reguladores da transcrição.
péptido FLAG também podem ser utilizados em vez de uma solução 0,1 M de glicina-HCl (pH 2,5) durante o processo de eluição. No entanto, se esta modificação é utilizada, o pH do tampão utilizado para diluir os péptidos FLAG devem ser monitorizados. péptidos FLAG 3x também deve ser usado para eluir as proteínas das pérolas de bandeira. Assim, uma solução com um pH relativamente alto deve ser usado para diluir os péptidos FLAG sob estas condições modificadas. É também fundamental para evitar a ciclos repetidos de congelamento e descongelamento das amostras, a fim de manter as interacções proteína-proteína adequadas.
t "> Em certas ocasiões, a optimização do processo de tripsinização também podem ser necessários para melhorar a exactidão dos resultados do rastreio interacção proteína. Embora o método de LC-MS / MS é uma ferramenta que pode ser usado para identificar as interacções entre nuclear proteínas, uma das limitações é a de que ele não fornece pormenores exactos sobre a montagem do complexo de proteína. Para melhorar a estabilidade do complexo, químicos de reticulação tratamentos podem ser usados 14. Como um método alternativo, electroforese-MS capilar / MS é também útil 15 .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) | nacalai tesque | 03969-21 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Micro Bio-Spin Columns | BIO-RAD | 732-6204 |
References
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807 (2010).
- Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
- MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
- Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
- Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
- Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
- Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
- Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430 (2013).
- ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
- Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
- Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498 (2015).
- Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
- Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
- Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
- Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).
