En Protein Forberedelse Metode til High-throughput Identifikation af proteiner Samspil med en Nuclear Cofactor Brug LC-MS / MS-analyse

Summary

Vi har etableret en fremgangsmåde til oprensning af coregulatoriske interaktion proteiner ved anvendelse af LC-MS / MS-system.

Introduction

Protein-protein interaktioner spiller en vigtig rolle i mange biologiske funktioner. Som sådan er disse interaktioner blevet impliceret i signaltransduktion; protein transport over cellemembraner; cellemetabolisme; og adskillige nukleare processer, herunder DNA-replikation, DNA beskadigelse reparation, rekombination og transkription ^{1, 2, 3, 4.} Identifikation af proteiner involveret i disse interaktioner er derfor afgørende for at fremme vores forståelse af disse cellulære processer.

Immunpræcipitering (IP) er en valideret teknik, der anvendes til at analysere protein-protein-interaktioner. For at lette identifikationen af co-immunpræcipiteret proteiner, er massespektrometri ofte brugt ^{5, 6, 7, 8,9.} Ved at målrette en kendt medlem af et proteinkompleks med et antistof, er det muligt at isolere protein-kompleks og efterfølgende identificere sine ukendte komponenter via massespektrometrianalyse. ARIP4 (androgen receptor-interagerende protein 4), en transskriptionel coregulator, interagerer med nukleare receptorproteiner for at aktivere eller undertrykke sit mål initiativtagere i en kontekst-afhængig måde ^{9, 10.} For bedre at forstå de transkriptionelle reguleringsmekanismer for disse nukleare faktorer, beskriver vi en omfattende metode til at rense og identificere ARIP4 interagerende proteiner ved hjælp af LC-MS / MS-system.

Protocol

1. Transfektion

1. Seed HEK293-celler i 100 mm dyrkningsplader (2 x 10 ⁶ celler / skål). Dyrke cellerne i Dulbeccos modificerede Eagles medium suppleret med 10% føtalt kalveserum, 100 ug / ml streptomycin, og 100 enheder / ml penicillin. Inkubér cellerne i en fugtig inkubator ved _5% CO2 og 37 ° C.
2. Den næste dag, transfektion cellerne med 10 ug FLAG-mærket ARIP4 plasmid hjælp 40 pi transfektionsreagens i overensstemmelse med producentens anvisninger ^11.

2. Protein Extraction

1. Omkring 36 timer efter transfektion vaskes cellerne med iskold PBS og høste cellerne med en skraber. Overfør cellerne i et 1,5 mltube og centrifugere det ved 8000 xg i 2 min ved 4 ° C. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 5 x pellet volumen 0,4 M KCI puffer (puffer med højt saltindhold: 20 mM Tris-HCI (pH 8,0), 0,4 M KCI, 5 mM _MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1x protease inhibitor cocktail). Rotere blandingen i 20 minutter ved 4 ° C.
2. Centrifugeres røret ved 17.700 xg i 10 min ved 4 ° C.
3. Overfør supernatanten (helcelle-ekstrakt) til et nyt 2 ml rør og tilsæt 3x det oprindelige volumen af 0 M KCI puffer (Fortyndingsbuffer: 20 mM Tris-HCI (pH 8,0), 5 mM _MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM β-mercaptoethanol, 1x protease inhibitor cocktail).
4. Udføre en anden centrifugering (17.700 x g i 10 minutter ved 4 ° C) og overføre supernatanten (helcelleekstrakt) til et nyt 2 ml rør.

3. Immunpræcipitation

1. Under centrifugering (2.4), vask 50 pi anti-FLAG perler med PBS, 0,1 M glycin-hydrochlorid, og derefter 1 M Tris-hydrochlorid, efterfulgt af vask to gange med 0,1 M KCl-buffer (lav salt buffer: 20 mM Tris- HCI (pH 8,0), 0,1 m KCI, 5 mM MgCI2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptoethanol, 1x protease inhibitor cocktail). Den centrifugering i denne vaskeproces udføres ved 2.000 x g i 1 min ved 4 ° C.
2. Bland 50 pi FLAG perler med hel-celle ekstrakter og rotere forsigtigt blandingen i 4 timer ved 2-4 ° C (1% af hele celler ekstrakt fra trin 2.4, bør også holdes ved -80 ° C til fremtidig brug som input).
3. Overfør prøven til et mikro spinkolonne (tyngdekraft dråbe). Hold gennemløbet i et 1,5 ml rør, fryse den anvendelse af flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C (kontrollere protein niveauer af både input og gennemstrømning anvendelse af Western blot-analyse).
4. Der tilsættes 1 ml 0,1 M KCI-puffer (lav salt buffer) at vaske FLAG perler (tyngdekraft dråbe).
5. Gentag trin 3.4 mindst fire gange mere (i alt fem gange vask).

4. Eluering

1. Kolonnen anbringes i et 1,5 ml rør og centrifugeres den ved 2000 xg i 1 min; perlerne tørrer.
2. Cap bunden afkolonnen.
3. Tilføj 50 pi (svarende til volumen af ​​FLAG perler) 0,1 M glycin-HCl (pH 2,5).
4. Ryst forsigtigt blandingen i 10 minutter ved stuetemperatur.
5. Kolonnen anbringes i et nyt 1,5 ml rør og centrifugeres den ved 2000 xg i 1 min.
6. Den eluerede opløsning neutraliseres med 10 pi 1 M Tris-HCI (pH 8,0); bland godt ved pipettering eller ved anvendelse af en vortex-maskine.

5. Alkylering og trypsinisering

1. Tilsæt 50 pi 100 mM _NH4 HCO _3, 10 pi _CH3CN, og 2 pi af dithiothreitol til blandingen (112 pi totalvolumen).
2. Prøven inkuberes i 30 minutter ved 56 ° C.
3. Anbring prøven ved stuetemperatur i 10 min.
4. Tilsæt 10 pi 333 mM iodacetamid til prøven og inkuber det i mørke i 30 minutter ved 37 ° C.
5. Tilsæt 10 pi trypsin (33 ng / pi) til blandingen, og inkuber det natten over ved 37 ° C.

1. Efter natten trypsinisering, transportere det endelige produkt til en LC-MS / MS facilitet eller til en tredjepart massespektrometri laboratorium til analyse ^12.

Representative Results

Vi identificerede en stærk ARIP4 signal, omkring 160 KDa, såvel som dem af en mock prøve kontrol og flere andre ukendte proteiner (figur 1). LC-MS / MS-analyse identificeret både ARIP4 komplekse peptider og de potentielle peptid cofaktorer inden den del af FLAG perler (tabel 1). P62 (Sequestosome1) blev en kendt ARIP4 cofaktor ¹¹ identificeret i analysen (tabel 1), hvilket bekræfter effekten af dette system ^11. Vi identificerede også mange andre tidligere rapporterede proteiner, der interagerer med ARIP4. På denne måde blev Sumo2 ¹⁰ og DryK ¹³ detekteres via LC-MS / MS-analyse. ARIP4 peptider blev også identificeret ved anvendelse af LC-MS / MS-analyse, hvilket tyder på, at IP var af høj kvalitet. Samlet, LC-MS / MS teknik er et kraftfuldt værktøj, der kan anvendes til at identificere ukendte nukleare hændelser linked til protein-protein interaktioner. Fuld massespektrometriske resultater vil være tilgængelige efter anmodning.

Figur 1: Oprensning af ARIP4 komplekser. Sølv farvning af FLAG epitop-mærket ARIP4 (ARIP4-F), udtrykt i HEK293 celler og immunopræcipitation med en FLAG-specifikt antistof. Oprensede proteiner blev løst under anvendelse af gelelektroforese og visualiseret med en sølvfarve. Som en kontrol blev en mock oprensning udført på HEK293-celler, som ikke udtrykte eksogene proteiner. Molekylvægtstandarder er vist til venstre. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Identification af Novel ARIP4 proteiner. FLAG perler bundet til oprenset protein komplekser blev dissocieret med trypsin-baserede fordøjelse. Disse proteiner blev efterfølgende identificeret ved hjælp af LC-MS / MS-analyse. LC-MS / MS-data blev analyseret under anvendelse af Swiss-Prot database og MASCOT software. er vist antallet af peptider og identiteten af ​​disse proteiner. Kun proteiner med signifikante MASCOTs scoringer (p <0,05) blev udvalgt.

Discussion

Effektiv transfektion er afgørende for at opnå et vellykket resultat med denne protokol. Derfor anbefaler vi at bruge Western blot-analyse for at bestemme de immunopræcipiterede FLAG-mærkede protein niveauer. Dette trin giver brugerne mulighed for at kontrollere, at deres protein af interesse er korrekt overudtrykt og desuden, at IP blev udført med succes. FLAG-mærket protein niveauer bør også kontrolleres forud for massespektrometri analyse.

En mock prøve bør anvendes som en negativ kontrol for at undgå at få et falsk positivt resultat, og at skelne baggrunden fra sande interaktioner. Desuden, når studere humane proteiner, bør udføres forsøg i et relativt rent miljø (f.eks, et rent rum) for at undgå forurening. Selvom et protein ekstraktionsbuffer med en høj saltkoncentration (0,3-0,4 M) kan lejlighedsvis anvendes til at ekstrahere kerneproteiner, en IP-buffer med en koncentration 0,1-0,15 M salt er de fleste afti anbefales. Dette tillader IP fremgangsmåden for at fortsætte uden at afbryde protein-protein interaktioner. For yderligere at minimere baggrundssignalet, kan der anvendes magnetiske kugler til oprensningsprocessen. Det er også vigtigt at optimere cellelysis betingelser for at reducere falsk-positive resultater.

Betydningen af den beskrevne i denne undersøgelse i forhold til andre teknikker fremgangsmåde (fx i gel fordøjelse-baserede enkelt protein identifikation) ^{5, 10, 11} er, at det tillader brugere at udføre LC-MS / MS-analyse for højkapacitetsidentifikation af protein-interaktioner mellem nukleare cofaktorer og deres bindingspartnere. Transkriptionel genregulering er stærkt afhængig af samarbejdet mellem sekvens-specifikke DNA-bindende proteiner. Følgelig transkriptionsfaktorer ofte interagere med en lang række co-faktorer til at ændre målgenekspression. th erefore, bedre at forstå de cellulære begivenheder for disse transkriptionelle mekanismer, der identificerer transkriptionelle partnere, der fremmer målet protein aktivitet er altafgørende. Vores metode giver brugerne mulighed for hurtigt at identificere formodede nukleare cofaktorer via deres transskription faktor af interesse og yderligere forbedrer vores forståelse af transkriptionelle reguleringsmekanismer.

FLAG-peptid kan også anvendes i stedet for en 0,1 M glycin-HCI-opløsning (pH 2,5) under elueringsprocessen. Men hvis denne modifikation anvendes, bør overvåges pufferens pH anvendes til fortynding FLAG peptider. 3x FLAG peptider bør også anvendes til at eluere proteiner fra FLAG perlerne. Derfor bør en opløsning med en relativt høj pH anvendes til at fortynde FLAG peptider under disse ændrede betingelser. Det er også afgørende at undgå gentagen nedfrysning og optøning af prøverne for at opretholde de korrekte protein-protein-interaktioner.

t "> Lejlighedsvis optimering af trypsinisering proces kan også være påkrævet for at øge nøjagtigheden af ​​resultaterne af protein-interaktion screening. Selvom LC-MS / MS-metode er et værktøj, der kan anvendes til at identificere interaktioner mellem nuklear proteiner, en af sine begrænsninger er, at det ikke giver præcise detaljer om samlingen af proteinkomplekset. for at øge kompleks stabilitet, kemisk tværbinding behandlinger kan anvendes ^14. som en alternativ metode, kapillarelektroforese-MS / MS er også nyttig ¹⁵ .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x)	nacalai tesque	03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220
Micro Bio-Spin Columns	BIO-RAD	732-6204