Una proteina metodo di preparazione per l'high-throughput identificazione di proteine ​​che interagiscono con un cofattore nucleare Utilizzando LC-MS / MS Analysis

Summary

Abbiamo stabilito un metodo per la purificazione di proteine ​​di interazione coregolamentazione utilizzando il sistema LC-MS / MS.

Introduction

Le interazioni proteina-proteina svolgono un ruolo importante in molte funzioni biologiche. In quanto tali, queste interazioni sono stati implicati nella trasduzione del segnale; proteine ​​di trasporto attraverso le membrane cellulari; metabolismo cellulare; e diversi processi nucleari, tra cui la replicazione del DNA, il DNA di riparazione danni, ricombinazione, e trascrizione ^{1, 2, 3, 4.} Identificare le proteine ​​coinvolte in queste interazioni è quindi fondamentale per far progredire la nostra comprensione di questi processi cellulari.

Immunoprecipitazione (IP) è una tecnica validata utilizzato per analizzare le interazioni proteina-proteina. Per facilitare l'identificazione di proteine co-immunoprecipitazione, spettrometria di massa è spesso utilizzato ^{5, 6, 7, 8,9.} Prendendo di mira un membro noto di un complesso proteico con un anticorpo, è possibile isolare il complesso proteico e per identificare successivamente i suoi componenti sconosciuti tramite spettrometria di massa. ARIP4 (recettore androgeno-interagendo proteina 4), un coregulator trascrizionale, interagisce con le proteine dei recettori nucleari, al fine di attivare o reprimere i suoi promotori bersaglio in un modo dipendente dal contesto ^{9, 10.} Per comprendere meglio i meccanismi regolatori trascrizionali che regolano questi fattori nucleari, si descrive un metodo completo per purificare ed identificare ARIP4 proteine ​​che interagiscono con il sistema LC-MS / MS.

Protocol

1. trasfezione

1. Seed HEK293 cellule in piastre di coltura da 100 mm (2 x 10 ⁶ cellule / piatto). Cultura le cellule in mezzo di Eagle modificato di Dulbecco supplementato con 10% di siero fetale di vitello, 100 ug / ml di streptomicina e 100 unità / ml di penicillina. Incubare le cellule in un incubatore umidificato al 5% di CO ₂ e 37 ° C.
2. Il giorno successivo, trasfezione le cellule con 10 mg di FLAG-tagged ARIP4 plasmide con 40 ml di reagente di trasfezione secondo le istruzioni ¹¹ del produttore.

2. Protein Extraction

1. Circa 36 hr dopo la trasfezione, lavare le cellule con PBS ghiacciato e raccogliere le cellule con un raschietto. Trasferire le cellule in un 1,5 mltube e centrifugare è a 8000 xg per 2 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5x il volume di pellet di 0,4 tampone M KCl (buffer sale alta: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.4 M KCl, 5 mM MgCl _2, 10% glicerolo, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1x proteasi inibitore cocktail). Ruotare l'impasto per 20 minuti a 4 ° C.
2. Centrifugare la provetta a 17.700 xg per 10 minuti a 4 ° C.
3. Trasferire il surnatante (estratto whole-cell) in una nuova provetta 2 mL e aggiungere 3x il volume iniziale di 0 M KCl tampone (tampone di diluizione: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl _2, 10% glicerolo, 0,1% NP-40, 10 mM β-mercaptoetanolo, 1x inibitori della proteasi cocktail).
4. Eseguire un'altra centrifugazione (17.700 xg per 10 min a 4 ° C) e trasferire il surnatante (estratto integrale cella) in una nuova provetta 2 ml.

3. immunoprecipitazione

1. Durante la centrifugazione (2.4), lavare 50 ml di perline Anti-Flag con PBS, 0,1 M glicina-cloridrato, e poi 1 M Tris-cloridrato, seguita da lavaggio due volte con 0,1 M tampone KCl (Low buffer di sale: 20 mm Tris- HCl (pH 8,0), 0,1 m KCl, 5 mM MgCl2, 10% glicerolo, 0,1% NP-40, 10 mM B-Mercaptoethanol, 1x inibitori della proteasi cocktail). La centrifugazione per questo processo di lavaggio viene eseguito a 2.000 xg per 1 min a 4 ° C.
2. Mescolare 50 ml di perline FLAG con gli estratti di cellule intere e ruotare delicatamente la miscela per 4 ore a 2-4 ° C (1% di estratto cellule intere dal punto 2.4 deve essere mantenuta a -80 ° C per un uso futuro come ingresso).
3. Trasferire il campione ad una colonna di spin micro (caduta per gravità). Mantenere il flusso continuo in una provetta da 1,5 ml, congelare con azoto liquido, e conservarlo a -80 ° C (verificare i livelli proteici sia l'ingresso e flow-through utilizzando l'analisi Western blot).
4. Aggiungere 1 ml di 0,1 M KCl tampone (buffer Low sale) per lavare le perline FLAG (caduta di gravità).
5. Ripetere passaggio 3.4 almeno altre quattro volte (per un totale di cinque lavaggi).

4. eluizione

1. Porre la colonna in una provetta da 1,5 ml e centrifugare a 2000 xg per 1 min; le perline si asciugheranno.
2. Chiudere la parte inferiore dellala colonna.
3. Aggiungere 50 ml (pari al volume di perline FLAG) di 0,1 M glicina-HCl (pH 2,5).
4. Agitare delicatamente il composto per 10 minuti a temperatura ambiente.
5. Porre la colonna in una nuova provetta da 1,5 ml e centrifugare a 2000 xg per 1 min.
6. La soluzione eluita viene neutralizzata con 10 ml di 1 M Tris-HCl (pH 8,0); mescolare bene pipettando o utilizzando una macchina vortice.

5. Alchilazione e tripsinizzazione

1. Aggiungere 50 ml di 100 mM NH ₄ HCO _3, 10 ml di CH ₃ CN, e 2 ml di ditiotreitolo alla miscela (112 microlitri volume totale).
2. Incubare il campione per 30 minuti a 56 ° C.
3. Posizionare il campione a temperatura ambiente per 10 min.
4. Aggiungere 10 ml di 333 mM iodoacetamide al campione e incubare al buio per 30 minuti a 37 ° C.
5. Aggiungere 10 ml di tripsina (33 ng / mL) alla miscela e incubare durante la notte a 37 ° C.

1. A seguito di tripsinizzazione durante la notte, trasportare il prodotto finale di un MS LC-impianto / MS o ad un terzo laboratorio di spettrometria di massa per l'analisi ^12.

Representative Results

Abbiamo identificato un segnale forte ARIP4, circa 160 KDa, così come quelli di un controllo di esempio finto e diverse altre proteine sconosciute (Figura 1). Analisi LC-MS / MS identificato entrambi i peptidi complessi ARIP4 ei potenziali cofattori peptide all'interno della frazione di perline FLAG (Tabella 1). p62 (Sequestosome1), un noto cofattore ARIP4 ¹¹ è stato identificato nell'analisi (Tabella 1), che conferma l'efficacia di questo sistema ^11. Abbiamo anche individuato molte altre proteine ​​precedentemente segnalato che interagiscono con ARIP4. In questo modo, Sumo2 ¹⁰ e ¹³ DryK stati rilevati tramite l'analisi LC-MS / MS. peptidi ARIP4 sono state anche identificate utilizzando l'analisi LC-MS / MS, il che suggerisce che l'IP era di alta qualità. Nel complesso, la tecnica LC-MS / MS è un potente strumento che può essere utilizzato per identificare sconosciuto collegamento eventi nucleariEd alle interazioni proteina-proteina. risultati di spettrometria di massa completi saranno disponibili su richiesta.

Figura 1: Purificazione di ARIP4 Complessi. colorazione argento di FLAG ARIP4 epitope-tagged (ARIP4-F) espresso in cellule HEK293 e immunoprecipitazione con un anticorpo specifico per FLAG. proteine ​​purificate sono state risolte mediante elettroforesi su gel e visualizzati con una macchia d'argento. Come controllo, una purificazione finto è stata eseguita su cellule HEK293 che non esprimono proteine ​​esogene. standard di peso molecolare sono mostrati sulla sinistra. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: IDENTIFICAZIONEn di Novel ARIP4 proteine ​​vincolante. perline FLAG legato a complessi di proteine ​​purificate sono state dissociate dalla digestione tripsina-based. Queste proteine ​​sono stati successivamente identificati mediante analisi LC-MS / MS. I dati LC-MS / MS è stato analizzato utilizzando la banca dati Swiss-Prot e software mascotte. sono riportati il ​​numero di peptidi e l'identità di queste proteine. Sono stati selezionati solo proteine ​​con significativi punteggi Mascot (p <0.05).

Discussion

trasfezione efficiente è essenziale per ottenere un risultato di successo con questo protocollo. Di conseguenza, si consiglia di utilizzare analisi Western Blot per determinare i livelli di proteina FLAG-tagged immunoprecipitati. Questa fase permette di verificare che la proteina di interesse è correttamente sovraespresso e, inoltre, che il PI è stato eseguito con successo. livelli di proteina FLAG-tag dovrebbero essere controllati prima della spettrometria di massa.

Un campione finta dovrebbe essere usato come controllo negativo per evitare di ottenere un risultato falso positivo e di discriminare lo sfondo da veri interazioni. Inoltre, quando si studia proteine umane, esperimenti devono essere eseguiti in un ambiente relativamente pulito (ad esempio, una camera pulita) per evitare la contaminazione. Sebbene un tampone di estrazione di proteine ​​con una concentrazione di sale (0,3-0,4 M) può essere occasionalmente utilizzato per estrarre proteine ​​nucleari, un buffer IP con una concentrazione 0,1-0,15 M di sale è più didieci raccomandata. In questo modo il regime di perfezionamento attivo di procedere senza interrompere le interazioni proteina-proteina. Per ridurre ulteriormente il segnale di fondo, perline magnetiche possono essere utilizzati per il processo di purificazione. E 'anche importante per ottimizzare le condizioni di lisi cellulare per ridurre risultati falsi positivi.

Il significato del metodo descritto in questo studio rispetto ad altre tecniche (ad esempio, in gel digestione basato identificazione singola proteina) ^{5, 10, 11} è che permette agli utenti di eseguire LC-MS / MS per l'identificazione high-throughput delle interazioni proteiche tra cofattori nucleari ei loro partner di legame. regolazione genica trascrizionale è fortemente dipendente dalla collaborazione di legame al DNA delle proteine ​​sequenza-specifiche. Pertanto, fattori di trascrizione interagiscono spesso con un gran numero di cofattori per alterare l'espressione del gene bersaglio. th erefore, per comprendere meglio gli eventi cellulari che regolano questi meccanismi trascrizionali, identificando i partner di trascrizione che promuovono l'attività della proteina bersaglio è di primaria importanza. Il nostro metodo permette agli utenti di identificare rapidamente cofattori nucleari putativi tramite il loro fattore di trascrizione di interesse e migliora ulteriormente la nostra comprensione dei meccanismi di regolazione trascrizionale.

FLAG peptide può anche essere usato al posto di una soluzione 0,1 M glicina-HCl (pH 2,5) durante il processo di eluizione. Tuttavia, se questa modifica è impiegato, il pH del tampone utilizzato per diluire i peptidi FLAG deve essere monitorato. 3x peptidi FLAG dovrebbero essere utilizzati anche per eluire le proteine ​​dalle perline FLAG. Pertanto, una soluzione con un pH relativamente alto deve essere usato per diluire i peptidi FLAG in queste condizioni modificate. E 'anche fondamentale per evitare il congelamento e scongelamento ripetuti dei campioni al fine di mantenere il corretto interazioni proteina-proteina.

t "> A volte, l'ottimizzazione del processo tripsinizzazione possono essere necessarie anche per migliorare la precisione dei risultati dello screening interazione proteina. Sebbene il metodo LC-MS / MS è uno strumento che può essere utilizzato per identificare le interazioni tra nucleare proteine, uno dei suoi limiti è che non fornisce dettagli esatti riguardanti il montaggio del complesso proteico. Per migliorare la stabilità complessa, trattamenti chimici reticolante può essere utilizzato ^14. Come metodo alternativo, elettroforesi capillare-MS / MS è anche utile ¹⁵ .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x)	nacalai tesque	03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220
Micro Bio-Spin Columns	BIO-RAD	732-6204