Summary
우리는 LC-MS / MS 시스템을 사용 coregulatory 상호 작용 단백질의 정제 방법을 확립 하였다.
Introduction
단백질 - 단백질 상호 작용은 다양한 생물학적 기능에 중요한 역할을한다. 따라서, 이러한 상호 작용은 신호 전달에 연루되어왔다 세포막 단백질 수송; 세포의 신진 대사; 및 DNA 복제, DNA 손상 복구, 재조합 및 전사 1, 2, 3, 4 등 여러 핵 프로세스. 이러한 상호 작용에 관여하는 단백질을 확인하는 것은이 세포 과정에 대한 우리의 이해를 증진하는 것이 중요하다.
면역 침전 (IP)는 단백질 - 단백질 상호 작용을 분석하는데 사용되는 검증 된 기술이다. 공동 - 면역 침전 된 단백질의 동정을 용이하게하기 위하여, 질량 분석계는 종종 이용 5, 6, 7, 8,9. 항체와 단백질 복합체의 공지 부재 타겟팅함으로써, 단백질 복합체를 분리하고,이어서 질량 분광 분석을 통해 그 미지의 컴포넌트를 식별 할 수있다. ARIP4 (안드로겐 수용체 상호 작용하는 단백질 4), 전사 coregulator은 활성화 또는 상황에 의존적으로 9, 10 년 대상 발기인을 억제하기 위해 핵 수용체 단백질과 상호 작용한다. 더 이러한 핵 인자를 지배하는 전사 조절 메커니즘을 이해하기 위해 정화하고, LC-MS / MS 시스템을 사용하여 ARIP4 상호 작용 단백질을 확인하는 포괄적 인 방법을 설명한다.
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Protocol
1. 형질
- 100 mm 배양 판 (2 × 106 세포 / 접시)에 HEK293 세포 종자. 배양 10 % 소 태아 혈청, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 100 유닛 / ㎖의 페니실린으로 보충 된 둘 베코 변형 이글 배지에서 세포. 5 % CO 2 및 37 ℃로 가습 된 배양기에서 세포를 인큐베이션.
- 다음 날, FLAG-태그 ARIP4 플라스미드의 10 μg의 제조업체의 방향 (11)에 따라 형질 전환 시약의 40 μl를 이용하여 세포를 형질.
2. 단백질 추출
- 약 트랜 스펙 션 후 36 시간이 빙냉 PBS로 세포를 세척하고 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확. 1.5 mltube에 세포를 전송하고 4 ℃에서 2 분 동안 8,000 XG에 그것을 원심 분리기. 대기음 뜨는 배에서 세포 펠렛을 재현 탁 0.4 M KCl을 버퍼의 펠릿 볼륨 (높은 염 완충액 : 20 mM 트리스 -HCl (pH 8.0), 0.4 M KCl을5 밀리미터의 MgCl 2, 10 % 글리세롤, 0.1 % NP-40, 10 밀리미터 B-mercaptethanol, 1X 프로테아제 억제제 칵테일). 4 ℃에서 20 분 동안 혼합물을 돌립니다.
- 4 ℃에서 10 분 동안 17,700 XG에서 튜브를 원심 분리기.
- (새로운 2 ㎖의 튜브에 상청 (전체 세포 추출물)을 전송하고 0 M KCl을 버퍼의 초기 부피 3 배 추가 희석 완충액 : 20 mM 트리스 -HCl (pH 8.0), 5 밀리미터의 MgCl 2, 10 % 글리세롤, 0.1 % NP-40, 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 1X 프로테아제 억제제 칵테일).
- 다른 원심 분리 (4 ℃에서 10 분 동안 17,700 XG)을 수행하고, 새로운 2 ML 튜브에 뜨는 (전체 세포 추출물)를 전송합니다.
3. 면역 침전
- 20 mM의 트리스 : 원심 분리 (2.4) 중, (0.1M KCl을 완충액으로 두번 저염 완충액을 세척 한 다음 PBS로 안티 FLAG 비드 50 ㎕의 0.1 M 글리신 - 염산하고 1 M 트리스 - 히드로 클로라이드를 씻어 염산 (PH 8.0), 0.1 M의 KCl, 5 mM의 MgCl2를, 10 % 글리세롤, 0.1 % NP-40, 10mM (B) 머 캅토 에탄올, 1X 프로테아제 억제제 칵테일). 이 세척 공정의 원심 분리는 39 ° C에서 1 분 동안 2,000 × g으로 수행된다.
- 전체 세포 추출물 FLAG 비드의 50 μL를 혼합하고 가볍게 2-4 ℃로한다 (단계 2.4의 전체 세포 추출물의 1 %는 또한 나중에 사용하기 위해 -80 ℃에서 보관한다에서 4 시간 동안 혼합물을 회전 ) 입력으로.
- 마이크로 스핀 열 (중력 드롭)에 샘플을 전송합니다. (입력 및 관류 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 양자의 단백질 수준을 확인), 1.5 ㎖의 튜브에 관류 유지 액체 질소를 사용하여 동결하고, -80 ℃에서 보관.
- 국기 비즈 (중력 드롭)을 씻어 0.1 M KCl을 버퍼 (낮은 소금 버퍼)의 1 ML을 추가합니다.
- 3.4 적어도 네 번 이상 (오 세척의 총) 단계를 반복합니다.
4. 용출
- 1.5 ML 튜브에 열을 놓고 1 분 동안 2,000 XG에이를 원심 분리; 구슬 건조됩니다.
- 하단 캡열.
- 0.1 M 글리신 - 염산 (PH 2.5)의 (FLAG 구슬의 부피와 동일) 50 μl를 추가합니다.
- 부드럽게 실온에서 10 분 동안 혼합물을 흔들어.
- 새로운 1.5 ML 튜브에 열을 놓고 1 분 동안 2,000 XG에 그것을 원심 분리기.
- 용출액을 1 M Tris-HCl (pH8.0)을 10 ㎕의 중화; 피펫 또는 와류 장치를 이용하여 잘 혼합한다.
5. 알킬화 및 트립신
- 100 mM의 NH 4 HCO 3, CH 3 CN 10 μL, 혼합물에 디티 오 트레이 톨의 2 μL (112 μl의 총 부피)의 50 μl를 추가합니다.
- 56 ° C에서 30 분 동안 샘플을 인큐베이션.
- 실온에서 10 분 동안 샘플을 놓는다.
- 요오도 아세트 아미드 시료에 333 mm의 10 μl를 첨가하고 37 ℃에서 30 분 동안 어두운 데에서 부화.
- 혼합물에 트립신의 10 μL (33 NG / μL)을 추가하고 37 ° C에서 하룻밤을 품어.
- 밤새 트립신 처리 후, LC-MS / MS 시설이나 분석 12 타사 질량 분석 실험실로 최종 제품을 수송.
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Representative Results
우리는 강한 신호 ARIP4 약 160 KDa의뿐 모의 샘플 제어 및 몇몇 다른 미지의 단백질의 것과 (도 1)을 확인 하였다. LC-MS / MS 분석은 펩티드 복합체 ARIP4 FLAG 비드 (표 1)의 분획 내의 잠재적 인 펩티드 공동 인자를 모두 식별. P62 (Sequestosome1)는 공지 ARIP4 공동 인자 (11)는이 시스템 (11)의 유효성을 확인하는 분석 (표 1)에서 확인되었다. 우리는 또한 ARIP4와 상호 작용하는 많은 다른 이전에보고 된 단백질을 확인했다. 이러한 방식으로, Sumo2 10 DryK (13)는 LC-MS / MS 분석을 통해 검출 하였다. ARIP4 펩티드는 또한 IP 고품질의 것을 제안하는 LC-MS / MS 분석을 이용하여 확인 하였다. 전반적으로, LC-MS / MS 기술은 알려지지 핵 이벤트의 링크를 식별 할 수있는 강력한 도구이며단백질 - 단백질 상호 작용 에디션. 전체 질량 분석 결과는 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
그림 1 : ARIP4 단지의 정화. FLAG 에피토프 태그가 ARIP4의 실버 염색 (ARIP4-F)는 FLAG 특정 항체 HEK293 세포와 면역 표현. 정제 된 단백질을 전기 영동을 이용하여 해결하고 실버 염색으로 가시화 하였다. 대조군으로서, 모의 정제하여 외래 단백질을 발현하지 않았다 HEK293 세포에서 수행 하였다. 분자량 표준은 왼쪽에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : Identificatio소설 ARIP4 결합 단백질의 N. 정제 된 단백질 복합체에 결합 FLAG 비드 트립신 기반 절단에 의해 분해 하였다. 이러한 단백질은이어서 LC-MS / MS 분석을 이용하여 확인 하였다. 한편, LC-MS / MS 데이터는 스위스 보호 해주는 MASCOT 데이터베이스와 소프트웨어를 사용하여 분석 하였다. 펩티드의 수와 이들 단백질의 신원이 도시된다. 중요한 마스코트 점수 (P <0.05) 만 단백질이 선정되었다.
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Discussion
효율적인 형질 감염 프로토콜이 성공적인 결과를 얻는 것이 필수적이다. 따라서, 우리는 면역 FLAG 태그가 단백질 수준을 결정하는 웨스턴 블롯 분석을 사용하는 것이 좋습니다. 이 단계는 IP가 성공적으로 수행되었는지, 그들의 관심 단백질이 제대로 또한, 과발현되어 있는지 확인하려면 사용자 수 있습니다. FLAG 태그가 단백질 수준은 질량 분광 분석에 앞서 확인하여야한다.
모의 샘플 위양성 결과를 얻는 피하고 진정한 상호 작용 배경을 판별하는 음성 대조군으로 사용한다. 인간 단백질을 연구 할 때 또한, 실험은 오염을 방지하기 위해, 비교적 깨끗한 환경 (예를 들면, 클린 룸)에서 수행되어야한다. 높은 염 농도 (0.3-0.4 M)으로 단백질을 추출 버퍼 때때로 핵 단백질을 추출하기 위해 사용될 수 있지만하는 0.1 ~ 0.15 M 염 농도와 IP 버퍼가 대부분이며열 좋습니다. 이 IP 절차는 단백질 - 단백질 상호 작용을 방해하지 않고 진행 할 수 있습니다. 상기 배경 신호를 최소화하기 위해 자성 비드는 정제 공정에 사용될 수있다. 또한 위양성 결과를 줄이기 위해 세포 용해 조건을 최적화하는 것이 중요하다.
다른 기술에 대한 연구에 기술 된 방법의 중요성 (겔의 예 소화 기반 단일 단백질 식별) 5, 10, 11는 사용자가 높은 처리량 식별을 위해 LC-MS / MS 분석을 수행 할 수 있다는 핵 보조 인자와 그 결합 파트너 간의 단백질 상호 작용의. 전사 유전자 조절 시퀀스 특정 DNA 결합 단백질의 협력에 크게 의존한다. 따라서, 전사 인자들은 표적 유전자의 발현을 변경하는 공동 많은 요소와 상호 작용한다. 일 erefore 더 셀룰러 이벤트, 이러한 전사 메카니즘을 관리 대상 단백질 활성이 가장 중요 촉진 전사 파트너를 식별을 이해한다. 우리의 방법은 사용자가 신속하게 관심을 자신의 전사 인자로 추정되는 핵 보조 인자를 식별 할 수 있습니다 추가 전사 조절 메커니즘에 대한 우리의 이해를 향상시킵니다.
FLAG 펩티드는 용출 과정에서 0.1 M 글리신 - 염산 용액 (PH 2.5) 대신에 사용될 수있다. 이 변형이 사용되는 경우, 상기 FLAG 펩티드를 희석하는 데 사용되는 버퍼의 pH를 모니터링해야한다. 배의 FLAG 펩티드는 FLAG 비드로부터 용출 된 단백질을 사용한다. 따라서, 상대적으로 높은 pH를 갖는 용액이 변성 조건 FLAG 펩티드를 희석하는 데 사용되어야한다. 이는 적절한 단백질 - 단백질 상호 작용을 유지하기 위해 샘플의 반복되는 동결 융해를 방지하는 것도 중요하다.
t "> 계기로 트립신 처리의 최적화는 단백질의 상호 작용을 검사 결과의 정확성을 향상시키기위한 요구 될 수있다. LC-MS / MS 법의 핵 사이의 상호 작용을 식별하기 위해 사용될 수있는 도구이지만 단백질 한계 중 하나는 단백질 복합물의 조립에 관한 정확한 정보를 제공하지 않는다는 것이다. 착물의 안정성을 향상시키기 위해 화학적 처리 가교 14을 사용할 수있다. 다른 방법으로, 모세관 전기 영동-MS / MS는 유용 15 .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) | nacalai tesque | 03969-21 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Micro Bio-Spin Columns | BIO-RAD | 732-6204 |
References
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