Una proteína Preparación método para la identificación de alto rendimiento de proteínas que interactúan con un cofactor nuclear utilizando LC-MS / MS análisis

Summary

Hemos establecido un método para la purificación de proteínas de interacción correguladoras utilizando el sistema de LC-MS / MS.

Introduction

Las interacciones proteína-proteína desempeñan un papel importante en muchas funciones biológicas. Como tal, estas interacciones se han implicado en la transducción de señales; el transporte de proteínas a través de las membranas celulares; el metabolismo celular; y varios procesos nucleares, incluyendo la replicación del ADN, el ADN a reparar el daño, la recombinación y la transcripción ^{1, 2, 3, 4.} La identificación de las proteínas implicadas en estas interacciones tanto, es fundamental para avanzar en nuestra comprensión de estos procesos celulares.

Inmunoprecipitación (IP) es una técnica validado utilizado para analizar interacciones proteína-proteína. Con el fin de facilitar la identificación de las proteínas co-inmunoprecipitado, espectrometría de masas se utiliza a menudo ^{5, 6, 7, 8,9.} Al dirigirse a un miembro conocido de un complejo de proteínas con un anticuerpo, es posible aislar el complejo de la proteína y para identificar posteriormente sus componentes desconocidos a través de análisis de espectrometría de masas. ARIP4 (andrógeno proteína del receptor de interacción 4), una coregulator transcripcional, interactúa con las proteínas del receptor nuclear con el fin de activar o reprimir sus promotores diana de una manera dependiente del contexto ^{9, 10.} Para comprender mejor los mecanismos reguladores de la transcripción que regulan estos factores nucleares, se describe un método integral para purificar e identificar las proteínas que interactúan ARIP4 utilizando el sistema LC-MS / MS.

Protocol

1. La transfección

1. Sembrar las células HEK293 en placas de cultivo de 100 mm (2 x 10 ⁶ células / placa). Cultivar las células en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 10% de suero de ternera fetal, 100 mg / ml de estreptomicina y 100 unidades / ml de penicilina. Se incuban las células en un incubador humidificado a 5% de _CO2 y 37 ° C.
2. El día siguiente, transfectar las células con 10 g de plásmido ARIP4 marcado con FLAG utilizando 40 l de reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante ^11.

2. Extracción de proteínas

1. Aproximadamente 36 horas después de la transfección, se lavan las células con PBS enfriado con hielo y la cosecha de las células utilizando un raspador. La transferencia de las células en un 1,5 mltube y centrifugar a 8000 xg durante 2 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 5 veces el volumen de tampón de pellet M KCl 0,4 (tampón de alta sal: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M KCl, MM MgCl 5 _2, 10% de glicerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1x cóctel inhibidor de proteasa). Rotar la mezcla durante 20 minutos a 4 ° C.
2. Se centrifuga el tubo a 17.700 xg durante 10 min a 4 ° C.
3. Transferir el sobrenadante (extracto de células enteras) a un nuevo tubo de 2 ml y añadir 3 veces el volumen inicial de tampón 0 M KCl (tampón de dilución: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM de MgCl _2, 10% de glicerol, 0,1% NP-40, 10 mM β-mercaptoetanol, 1x cóctel inhibidor de proteasa).
4. Realice otra centrifugación (17.700 xg durante 10 min a 4 ° C) y transferir el sobrenadante (extracto de células enteras) a un nuevo tubo de 2 ml.

3. La inmunoprecipitación

1. Durante la centrifugación (2.4), lavar 50 l de perlas de anti-marca con PBS, 0,1 M glicina-clorhidrato, y luego 1 M Tris-hidrocloruro, seguido de lavado dos veces con 0,1 M de tampón de KCl (tampón bajo en sal: Tris 20 mM HCl (pH 8,0), 0,1 m KCl, MgCl2 5 mM, 10% de glicerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptoetanol, 1x cóctel inhibidor de la proteasa). La centrifugación durante este proceso de lavado se realiza a 2.000 xg durante 1 min a 4 ° C.
2. Mezclar 50 l de perlas de marca con los extractos de células enteras y girar suavemente la mezcla durante 4 horas a 2-4 ° C (1% del extracto de células enteras de la etapa 2.4 también debe mantenerse a -80 ° C para uso futuro como una entrada).
3. Transferir la muestra a una columna de centrifugación micro (caída de la gravedad). Mantener el flujo a través de un tubo de 1,5 ml, congelarla con nitrógeno líquido y almacenarlo a -80 ° C (comprobar los niveles de proteína de la entrada y de flujo continuo utilizando el análisis de Western blot).
4. Añadir 1 ml de tampón 0,1 M KCl (tampón bajo en sal) para lavar las perlas FLAG (caída de la gravedad).
5. Repita el paso 3.4, al menos, cuatro veces más (para un total de cinco lavados).

4. La elución

1. Colocar la columna en un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 2.000 g durante 1 min; las perlas se secan.
2. Se tapa el fondo della columna.
3. Añadir 50 l (igual al volumen de perlas de FLAG) de 0,1 M glicina-HCl (pH 2,5).
4. Agitar suavemente la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente.
5. Colocar la columna en un nuevo tubo de 1,5 ml y centrifugar a 2000 xg que para 1 min.
6. La solución eluida se neutraliza con 10 l de 1 M Tris-HCl (pH 8,0); mezclar bien con la pipeta o mediante el uso de una máquina de vórtice.

5. La alquilación y tripsinización

1. Añadir 50 l de 100 mM NH ₄ HCO _3, 10 l de _CH3CN, y 2 l de ditiotreitol a la mezcla (112 l de volumen total).
2. Incubar la muestra durante 30 min a 56 ° C.
3. Colocar la muestra a temperatura ambiente durante 10 min.
4. Añadir 10 l de 333 mM yodoacetamida a la muestra e incubar en la oscuridad durante 30 min a 37 ° C.
5. Añadir 10 l de tripsina (33 ng / l) a la mezcla y se incuba durante la noche a 37 ° C.

1. Después de tripsinización durante la noche, transportar el producto final a una instalación de LC-MS / MS o de un laboratorio de espectrometría de masas de terceros para el análisis ^12.

Representative Results

Se identificaron una fuerte señal ARIP4, alrededor de 160 KDa, así como las de un control de ejemplo mock y varias otras proteínas desconocidas (Figura 1). Análisis de LC-MS / MS identificó tanto los péptidos complejos ARIP4 y los cofactores de péptidos potenciales dentro de la fracción de perlas de FLAG (Tabla 1). p62 (Sequestosome1), un conocido cofactor ARIP4 ¹¹ fue identificado en el análisis (Tabla 1), lo que confirma la eficacia de este sistema ^11. También se identificaron muchas otras proteínas previamente notificados que interactúan con ARIP4. De esta manera, Sumo2 ¹⁰ y DryK ¹³ se detectaron mediante el análisis de LC-MS / MS. péptidos ARIP4 También se identificaron utilizando el análisis por LC-MS / MS, lo que sugiere que la IP era de alta calidad. En general, la técnica de LC-MS / MS es una herramienta poderosa que se puede utilizar para identificar desconocido enlace eventos nucleared a las interacciones proteína-proteína. Los resultados completos de espectrometría de masas estarán disponibles a petición.

Figura 1: Purificación de Complejos ARIP4. La tinción con plata de FLAG ARIP4 epítopo de etiquetado (ARIP4-F) expresado en células HEK293 y la inmunoprecipitación con un anticuerpo específico-FLAG. Las proteínas purificadas se resolvieron mediante electroforesis en gel y se visualizaron con una tinción de plata. Como control, una purificación mock se realizó en células HEK293 que no expresan proteínas exógenas. Los estándares de peso molecular se muestran a la izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Identificación de la novela ARIP4 proteínas de unión. perlas de FLAG unidos a complejos de proteínas purificadas se disociaron por digestión a base de tripsina. Estas proteínas se identificaron posteriormente utilizando el análisis de LC-MS / MS. Los datos de LC-MS / MS se analizó utilizando la base de datos Swiss-Prot y el software MASCOT. Se muestran el número de péptidos y la identidad de estas proteínas. Sólo se seleccionaron las proteínas con las puntuaciones significativas MASCOTA (p <0,05).

Discussion

transfección eficiente es esencial para obtener un resultado exitoso con este protocolo. En consecuencia, se recomienda el uso de Western blot para determinar los niveles de proteína marcada con FLAG inmunoprecipitadas. Este paso permite a los usuarios para verificar que su proteína de interés se sobreexpresa adecuadamente y, por otra parte, que la IP se realizó con éxito. los niveles de proteína marcada con FLAG también deben ser revisadas antes del análisis de espectrometría de masas.

Una muestra simulada se debe utilizar como un control negativo para evitar la obtención de un resultado falso positivo y para discriminar el fondo de los verdaderos interacciones. Por otra parte, en el estudio de proteínas humanas, los experimentos deben realizarse en un entorno relativamente limpio (por ejemplo, una habitación limpia) para evitar la contaminación. Aunque un tampón de extracción de proteína con una alta concentración de sal (0,3 a 0,4 M) se puede utilizar de vez en cuando para extraer proteínas nucleares, un tampón de IP con una concentración de sal 0,1-0,15 M es la mayor parte dediez recomendada. Esto permite que el procedimiento de IP para proceder sin interrumpir las interacciones proteína-proteína. Para minimizar aún más la señal de fondo, perlas magnéticas se pueden utilizar para el proceso de purificación. También es importante para optimizar las condiciones de lisis de células con el fin de reducir los resultados falsos positivos.

La importancia del método descrito en este estudio con respecto a otras técnicas (por ejemplo, en gel de digestión basado en la identificación única proteína) ^{5, 10, 11} es que permite a los usuarios realizar análisis de LC-MS / MS para la identificación de alto rendimiento de las interacciones entre proteínas cofactores nucleares y sus parejas de unión. la regulación de genes transcripcional es altamente dependiente de la cooperación de las proteínas de unión al ADN específicas de secuencia. Por consiguiente, los factores de transcripción a menudo interactúan con un gran número de co-factores para alterar la expresión del gen diana. Th erefore, para comprender mejor los eventos celulares que regulan estos mecanismos de transcripción, la identificación de los socios de la transcripción que promueven la actividad de la proteína diana es de suma importancia. Nuestro método permite a los usuarios identificar rápidamente cofactores nucleares a través de su putativo factor de transcripción de interés y mejora aún más nuestra comprensión de los mecanismos de regulación transcripcional.

péptido FLAG también se puede utilizar en lugar de una solución de glicina-HCl 0,1 M (pH 2,5) durante el proceso de elución. Sin embargo, si se emplea esta modificación, el pH del tampón usado para diluir los péptidos bandera debe ser monitoreada. 3x BANDERA péptidos también deben ser utilizados para la elución de las proteínas de las perlas de bandera. Por consiguiente, una solución con un pH relativamente alto se debe utilizar para diluir los péptidos bandera bajo estas condiciones modificadas. También es crucial para evitar la congelación y descongelación repetida de las muestras con el fin de mantener las interacciones proteína-proteína apropiadas.

t "> En ocasiones, la optimización del proceso de tratamiento con tripsina también puede ser necesaria para mejorar la exactitud de los resultados de la selección de interacción de proteínas. Aunque el método LC-MS / MS es una herramienta que puede ser usada para identificar las interacciones entre nuclear proteínas, una de sus limitaciones es que no proporciona detalles exactos acerca del montaje del complejo de la proteína. Para mejorar la estabilidad del complejo, tratamientos químicos de reticulación se puede utilizar ^14. Como método alternativo, electroforesis-MS capilar / MS es también útil ¹⁵ .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x)	nacalai tesque	03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220
Micro Bio-Spin Columns	BIO-RAD	732-6204