Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

الشعرية الكهربائي فصل حيدة النسيلة الأجسام المضادة الإسوية باستخدام الشعرية محايد

doi: 10.3791/55082 Published: January 16, 2017
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الاجسام المضادة (MABS) هي بروتينات biotherapeutic مع تزايد الاهتمام نظرا لقدرتها على التحرك ضد العديد من الأمراض المزمنة والتنكسية 1. مثل الجزيئات الحيوية الأخرى، MABS عرضة للخضوع العديد من التعديلات الفيزيائية في جميع مراحل دورة حياتها (أي، من الحيوي إلى المنتج النهائي). وتشمل هذه التعديلات، ولكن لا تقتصر على: نزع الأميد، بالغليكوزيل، والأكسدة، cyclization، المماكبة، وتجميع والانقسام بروتين 2. وبالتالي، هناك حاجة إلى تقنيات تحليلية قادرة على حل الإسوية الجوهرية لمراقبة MABS عدم التجانس والاستقرار من أجل وضع مواصفات الجودة.

الشعرية الكهربائي (م) هو تقنية فصل عالية الأداء التي تقوم outinside من أنبوب تنصهر السيليكا الضيق (مجموعة ميكرون) مليئة بالكهرباء الخلفية (BGE). بناء على طلب من مجال كهربائي (تصل إلى 30،000 V)، جزيء مشحونةالصورة الهجرة نحو القطب مع المسؤول المعاكس (أي مدفوعة الكهربائية الفصل). استخدام الفولتية العالية في CE يسمح التحاليل السريعة وزيادة الكفاءة، والتي تعلو على الكهربائي للهلام الكلاسيكية. الكهربائي منطقة الشعرية (تشيكيا) هو أسلوب قائم على CE تستخدم بشكل روتيني في صناعة الأدوية الحيوية لتقييم جودة المنتج 3-9. وخلافا لغيرها من وسائط CE (على سبيل المثال، هلام الشعرية الكهربائي، الشعرية ISOELECTRIC التركيز) أو أساليب تعتمد على اللوني، ويمكن إجراء تشيكيا دون استخدام denaturants أو واجهات الحالة الصلبة، والسماح للتحليل التباين المتأصل في MABS قريبة من الدولة الأصلية الخاصة بهم 10 . الفصل تشيكيا من الأشكال الإسوية ماب يحدث داخل الشعرية تنصهر السيليكا مغطاة ماء البوليمر (الشعرية محايد) ويقوم على التنقل الكهربي مختلفة، والتي يحكمها تهمة والكتلة والحجم والشكل (أو حجم الهيدروديناميكية) 11. تم الكشف عن الأنصاف ماب عندمافهي تتحرك وتمر عبر نافذة الكشف، التي لمست من قبل كاشف الأشعة فوق البنفسجية (UV) الامتصاصية في 214 نانومتر (4).

والتنفيذ الناجح لهذه التقنية التحليلية يعتمد على الاهتمام المناسب لتفاصيل قبل وأثناء التجربة. يتصرف خلاف ذلك سيزيد من التكلفة والوقت لإجراء التحليل، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى الفشل المستمر والإحباط.

هنا، نقدم دليل خطوة بخطوة لإجراء تحليل الناجح لماب عدم التجانس التي كتبها تشيكيا من خلال شرح مفصل لتحضير محاليل والعينات، وإعداد نظام CE، أساليب أداة إعداد، والحصول على البيانات، و تجهيز. لغرض هذا البرنامج التعليمي، المؤتلف الإنسان بالكامل ألفا المضادة للعامل نخر الورم يستخدم (مكافحة TNFα) ماب كنموذج البروتين. ومع ذلك، هذا البروتوكول يمكن تخصيصها بسهولة لتحليل البروتينات الأخرى التي تفكر في التعديلات وجيزة. اdditionally، يقترح المشاكل المحتملة عدة توصيات للتخفيف. ومما يشجع القارئ على تتبع بدقة البروتوكول المقترح، واحتمال أن تنجح سوف تزيد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد حلول

  1. إعداد الحل BGE.
    1. إعداد 100 مل من محلول مكون من 0.05٪ (م / ت) السليلوز بروبيل هيدروكسي ميثيل (HPMC)، 200 مم ε الأمينية ن الكابرويك حمض (EACA) و 30 ملي خلات ليثيوم.
      ملاحظة: كما HPMC هو بوليمر اللزجة، صب مسحوق في كوب من الزجاج، إضافة 80 مل من الماء، وأخيرا إضافة شريط التحريك. متابعة إضافة الكواشف المتبقية بشكل طبيعي. ارتداء النظارات الواقية عند التعامل مع خلات الليثيوم لأنها يمكن أن تسبب تهيج العين.
    2. ضبط لقيمة الرقم الهيدروجيني 4.8 ± 0.1 مع 50٪ (ت / ت) وحامض الخليك. يسمح الحل لتحقيق الاستقرار لمدة 5 دقائق وضبط حسب الضرورة.
    3. يضاف الماء إلى أن تصل إلى الحجم النهائي من 100 مل في القارورة الحجمية.
    4. تصفية من خلال غشاء ماء مع حجم 0.2 ميكرون المسام.
    5. متجر في 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام.
  2. إعداد معيار الداخلية.
    1. إعداد 1 ملحل تتكون من 1٪ (م / ت) الهستامين.
    2. تصفية من خلال غشاء ماء مع حجم 0.2 ميكرون المسام.
    3. متجر في 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 يوم.

إعداد 2. عينة

  1. إعداد 180 ميكرولتر من عينة ماب المخفف مع العازلة تريس (50 ملي تريس (hydroxymethyl) aminomethane، ودرجة الحموضة 8.0) إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل.
  2. إضافة 20 ميكرولتر من 1٪ (م / ت) الهستامين.
  3. خلط وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 ثوان.
  4. ضع قارورة صغيرة داخل قارورة العالمية.
  5. نقل العينة إلى القارورة الصغيرة وسقف القارورة العالمية. الاستغناء العينة صعودا من أجل تجنب إدخال أي فقاعات.
  6. متجر في 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 يوم.
  7. ضع قارورة العالمي (مع قارورة صغيرة تحتوي على محلول العينة) في علبة عينة مدخل.

3. إعداد نظام CE.

  1. تنظيف نظام CE.
    ملاحظة: عشر السلوكهو الإجراء مرة واحدة في الأسبوع على الأقل لتجنب تسرب التيار الكهربائي المستمدة من تراكم الغبار والحطام. ومع ذلك، اعتمادا على التطبيق (على سبيل المثال، استخدام BGE مع زيادة اللزوجة أو مع تركيز الملح العالية، والعينات مع زيادة اللزوجة) الأقطاب والعتلات فتح قد يحتاج إلى تنظيفها بشكل متكرر أكثر لمنع التلوث وعينة المرحلة.
    1. إيقاف تشغيل مفتاح الطاقة الصك م، وفتح الباب الأمامي.
    2. تنظيف سطح غطاء عينة عينة، عقد نظام (عينة وعازلة صواني)، غطاء خرطوشة، بار المشبك، كتلة واجهة والأقطاب مع محبوكة مبللة بالماء مسح. كرر الإجراء مع مسح وجاف قبل استخدام مبللة الايثانول.
    3. شطف العتلات فتح جيدا بالماء. تنظيف سطحها مع محبوكة مسح. كرر الإجراء مع مسح وجافة قبل التثبيت مبللة الايثانول.
    4. تنظيف طرفي كابل الألياف البصرية دقيقلاي بقطعة قماش ستوكات مبللة بالماء. كرر الإجراء مع قطعة قماش مبللة الايثانول.
  2. خرطوشة.
    1. إزالة الشعرية محايد جديد (50 ميكرون القطر الداخلي) من عبوتها.
    2. الشريط أسفل واحدة من نهاية الأنابيب الشعرية وقائية لطاولة العمل. حل، وتصويب وسحب شعري خارج الأنبوب.
    3. عصا قطعة من الشريط أو ورقة لطاولة العمل وإضافة علامات القياس على النحو التالي: طول للكشف عن (30 سم)، نافذة الشعرية (0.2 سم) وطول إلى نهاية مخرج (10 سم) (أي 40.2 سم الطول الكلي، 30.0 سم طول فعالة).
    4. محاذاة النافذة الشعرية إلى علامة قياس 0.2 سم في ورقة مرجعية. إصلاح الشعرية مع الشريط ووضع علامة الشعرية ينتهي 2 مم خارج علامات القياس.
    5. قطع الغطاء الواقي في نهاية مدخل الشعرية (ابعد حد من نافذة) في حركة واحدة على التوالي باستخدام حافة دافق من الحجر الانفطار.
      1. تزج نهاية الشعرية في قارورة عالمية توج مملوءة بالماء لتجنب تلف دائم في طلاء الداخلي الشعرية. كرر هذا الإجراء في كل مرة يتعرض نهاية الشعرية إلى المحيط لأكثر من 1 دقيقة.
    6. إدراج نهاية الشعرية مدخل إلى الجانب منفذ للخرطوشة.
    7. الشد والجذب الشعرية من خلال خرطوشة حسب الضرورة حتى يتم توسيط نافذة الشعرية إلى إطار خرطوشة.
    8. تضاف المكونات الفتحة (100 ميكرون × 200 ميكرون) في إطار خرطوشة.
      ملاحظة: تأكد من أن الضوء الأبيض يمر من خلال النافذة عندما تتعرض لمصدر الأبيض من ضوء. إذا كان الضوء الذي يمر عبر لديه مظهر اللون البني، وضبط حسب الضرورة.
    9. تضاف الشعرية في أنابيب التبريد شكلت قبل لمجموع طول شعري من 40.2 سم (مع الجوز المثبتة مسبقا الأنابيب، الطويق ويا الدائري عند كلا الطرفين في هذا النظام).
    10. دفع الشعرية من خلال coolanر أنابيب الضرورة حتى يظهر الشعرية في الجانب الآخر من الأنبوب.
    11. إدراج نهاية الأنبوب المبرد إلى جانب منفذ للخرطوشة وتشديد الجوز الأنابيب.
    12. إدراج نهاية الشعرية مدخل إلى الجانب مدخل من الخرطوشة.
    13. الشد والجذب الشعرية من خلال خرطوشة حسب الضرورة حتى يظهر الشعرية في الجانب مدخل من الخرطوشة.
    14. إدراج نهاية الأنبوب المبرد إلى جانب مدخل خرطوشة وتشديد الجوز الأنابيب.
    15. قطع الغطاء الواقي في نهاية الشعرية منفذ (النهاية أقرب من الإطار) في حركة واحدة على التوالي باستخدام حافة دافق من الحجر الانفطار.
    16. إدراج مقاطع ختم التوكيل على نهايات الشعيرات الدموية والضغط على لتستقر في الموقف. بصريا تفقد الشعرية ينتهي. إذا لم تكن حتى، كرر الإجراء.
    17. وضع قالب شعري طول على حافة طاولة العمل.
    18. وضع خرطوشة أسفل AGainst قالب شعري طول ومحاذاة الشعرية ينتهي مع خطوط إشارة على القالب. إذا كانت علامات قياس الشعرية (انظر 3.2.4) لا تتماشى مع خطوط إشارة، وضبط حسب الضرورة.
    19. عقد الشعرية ضد قالب شعري طول وقطع طرفي الشعرية باستخدام حافة دافق من الشق حجر 2 ملم تحت خطوط إشارة على القالب.
    20. بصريا تفقد الشعرية ينتهي مع عدسة مكبرة. إذا نهايات الشعيرات الدموية غير متجانسة، تلميع لهم باستخدام وجه ناعم من الحجر الانفطار.
    21. إدراج فتحة يا الدائري في حفرة فتحة المكونات باستخدام أداة الإدراج يا الدائري.
    22. تثبيت قارورة عالمية توج مملوءة بالماء في حالة خرطوشة وخرطوشة المكان إلى حالة مباشرة مع نهايات الشعيرات الدموية إدراجها في قارورة. لتخزين قصيرة وطويلة المدى حفاظ على 2-8 درجة مئوية.
  3. إعداد صواني العازلة.
    1. وتملأ المكان الكون توجقارورة القاعدة في مدخل العازلة وصواني منفذ (الشكل 1). مواقف قنينة كرر في الممرات 2 و 3 و 4 و 5 وفقا لعدد من العينات لتحليلها، ووضع مسار واحد لكل ستة حقن العينة.
      ملاحظة: تجنب ترطيب قبعات قارورة لمنع تسرب الحالي.

شكل 1
الشكل 1: المركز وملء مستوى قارورة العالمية في مدخل العازلة ومنفذ علب. ملء مستويات: 1/1 = 1400 ميكرولتر، 3/4 = 1300 ميكرولتر و1/2 = 1000 ميكرولتر. الاختصارات: W = الماء، حمض الهيدروكلوريك = 0.1 M حمض الهيدروكلوريك. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. نظام CE مكونات التجمع.
    1. تثبيت كاشف للأشعة فوق البنفسجية.
    2. تثبيت الروافع فتحعن طريق الضغط على ما يصل إلى كتلة واجهة.
    3. تثبيت كابل الألياف البصرية. أدخل الطرف المقابل للشريط المشبك و، في حين عقد كلا الطرفين، وتدوير في اتجاه عقارب الساعة. قم بتوصيل الطرف الآخر للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: التعامل مع كابل الألياف البصرية مع الرعاية أثناء هذا الإجراء منذ الانحناء يمكن أن تسبب كسر لها.
    4. مكان العينة وصواني عازلة في النظام عينة عقد والمفاجئة في الموقف.
    5. وضع خرطوشة الشعرية في كتلة واجهة و، في حين الضغط على شريط المشبك عند كلا الطرفين، وتشديد الرقابة على المقابض.

4. طرق صك مجموعة المتابعة

  1. إنشاء تكييف والجري وطرق اغلاق الصك وفقا للمعايير التالية والجدول 1: الجهد، الحد الأقصى: 30.0 كيلو فولت. الحالي، الحد الأقصى: 300.0 أمبير. درجة الحرارة خرطوشة: 20.0 درجة مئوية. درجة حرارة تخزين العينات: 10.0 درجة مئوية. الأشعة فوق البنفسجية للكشف عن الظروف الأولية: الطول الموجي: 214 نانومتر. معدل البيانات: 4 هرتز؛ مرشح: عادي؛ عرض ذروة (يشير): 16-25. إشارة الامتصاصية: مباشرة.
    ملاحظة: معدل الحصول على البيانات ويمكن زيادة تصل إلى 25 هرتز من أجل تحسين تغطية مناطق الفصل الضيقة.
<TD> الماء قارورة لمنافذ
برنامج الوقت طريقة تكييف
الوقت (دقيقة) حدث القيمة مدة قارورة مدخل قارورة المخرج ملخص تعليقات
- شطف - الضغط 2068 مليبار 1.0 دقيقة BI: C1 BO: C1 إلى الأمام حمض الهيدروكلوريك 0.1 M
- شطف - الضغط 2068 مليبار 2.0 دقيقة BI: B1 BO: C1 إلى الأمام
- شطف - الضغط 2068 مليبار 10.0 دقيقة BI: E1 BO: C1 إلى الأمام BGE
0.00 مستقل - الجهد 15.0 KV 10.0 دقيقة BI: D1 BO: D1 0.17 الحد الأدنى منحدر، والاستقطاب الطبيعي فصل
10.00 شطف - الضغط 2758 مليبار 10.0 دقيقة BI: E1 BO: C1 إلى الأمام BGE
20.01 انتظر - 0.0 دقيقة BI: A1 BO: A1 - نصائح شطف
تشغيل البرنامج مرة طريقة
الوقت (دقيقة) حدث القيمة مدة قارورة مدخل ملخص تعليقات
- شطف - الضغط 2068 مليبار 1.0 دقيقة BI: C1 BO: C1 إلى الأمام، في / خارج المؤتمر الوطني العراقي قارورة 6 حمض الهيدروكلوريك 0.1 M
- شطف - الضغط 2068 مليبار 2.0 دقيقة BI: B1 BO: C1 إلى الأمام، في / خارج المؤتمر الوطني العراقي قارورة 6 ماء
- شطف - الضغط 2068 مليبار 4.0 دقيقة BI: E1 BO: C1 إلى الأمام، في / خارج المؤتمر الوطني العراقي قارورة 6 BGE
- حقن - الضغط 34 مليبار 20.0 ثانية SI: A1 BO: B1 تجاوز، الى الامام حقن عينة
- انتظر - 0.4 دقيقة BI: A1 BO: A1 في / خارج المؤتمر الوطني العراقي قارورة 6 غسل نصائح
0 مستقل - الجهد 15.0 KV 30.0 دقيقة BI: D1 BO: D1 0.17 الحد الأدنى منحدر، والاستقطاب العادي، في / خارج المؤتمر الوطني العراقي قارورة 6 فصل عينة
0.5 Autozero - - - - - -
30.01 وقف البيانات - - - - - -
30.02 شطف - الضغط 2068 مليبار 2.0 دقيقة BI: B1 BO: C1 إلى الأمام، في / خارج المؤتمر الوطني العراقي قارورة 6 ماء
32.03 انتظر - 0.0 دقيقة BI: A1 BO: A1 في / خارج المؤتمر الوطني العراقي قارورة 6 نصائح شطف
32.04 النهاية - - - - - النهاية
برنامج الوقت طريقة الاغلاق
الوقت (دقيقة) حدث القيمة مدة قارورة مدخل قارورة المخرج ملخص تعليقات
- شطف - الضغط 2068 مليبار 1.0 دقيقة BI: E6 BO: E6 إلى الأمام حمض الهيدروكلوريك 0.1 M
- شطف - الضغط 2068 مليبار 6.0 دقيقة BI: F6 BO: F6 إلى الأمام ماء
- مصباح - إيقاف - - - - - -
- انتظر - 0.0 دقيقة BI: A1 BO: A1 - نصائح شطف

الجدول 1: تكييف، تشغيل وبرامج وقت الاغلاق.

5. الحصول على البيانات ومعالجة

  1. برمجة مجموعة عينة.
    1. برمجة الشعرية لتكييف باستخدام طريقة تكييف الصك. عند استخدام الشعرية لأول مرة، برنامج أربعة التكرار. خلاف ذلك البرنامج اثنين فقط من تكرار طريقة تكييف.
    2. برمجة عينات لتحليلها باستخدام طريقة أداة تشغيل.
    3. برمجة الشعرية لتخزين باستخدام طريقة أداة الاغلاق وكرر الإجراء المشار إليها في القسم 3.2.22.
  2. تشغيل التجربة.
  3. تصدير electropherograms.
  4. حساب الوقت الهجرة والمحتوى نسبة، وهو الرئيسي الأساسيالإسوية الحمضية الثانية باستخدام العمودي التكامل انخفاض خط الشخصي رحلاني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويبين الشكل 2 الملف الشخصي التيار الكهربائي نموذجي من 200 ملي EACA، 30 ملي خلات الليثيوم، ودرجة الحموضة 4.8 BGE مع عينة مكافحة TNFα ماب المخفف مع العازلة تريس (50 ملي، ودرجة الحموضة 8.0). كما يمكن ملاحظتها، والحالي هو مستقر في جميع مراحل التحليل ويمكن أن تتأرجح بين قيم 30-35 أمبير. ويبين الشكل 3 رحلاني تشيكيا من عينة فارغة حيث تقابل ذروة الكشف عن لمعيار داخلي هستامين. ومن المتوقع لالهستامين أن يكون وقتا هجرة 3،7-4،1 دقيقة. ويبين الشكل 4 رحلاني تشيكيا مكافحة TNFα ماب. كما يمكن ملاحظة، ويسبق القمة الرئيسية وتليها قمم شدة أصغر. منذ يجري فصل تحت قطبية العادي (أي من الموجب إلى السالب)، وتحليل يكشف الإسوية الأساسية (ماب المتغيرات مع شحنة موجبة) المهاجرة أسرع والإسوية الحمضية (ماب المتغيرات مع شحنة سالبة) الهجرة أبطأ من الإسوي الرئيسي.

الشكل 2
الشكل 2: التعريف الحالي الكهربائية للتشغيل التشيكي نموذجي. وBGE الحالي هو مستقر حوالي 30 أمبير عند تخفيف العينة ماب مع العازلة تريس (50 ملي، ودرجة الحموضة 8.0). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): تشيكيا رحلاني من عينة فارغة. لاحظ أنه يتم الكشف عن أي قمم بصرف النظر عن أن المعيار الداخلي هستامين. الاتحاد الافريقي = وحدة الامتصاص. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

خيمة "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل (4)
الشكل 4: عدم التجانس فيزيائية مكافحة TNFα ماب يحددها تشيكيا. ويتكون هذا النموذج من الأشكال الإسوية الأساسية، الرئيسية والحمضية. يظهر أقحم نظرة موسعة من المتغيرات حلها بواسطة تشيكيا. الاتحاد الافريقي = وحدة الامتصاص. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في هذا البرنامج التعليمي، وتسليط الضوء على أهمية الممارسات السليمة عندما يحلل إجراء تشيكيا من MABS من أجل زيادة احتمال أن تنجح. ومع ذلك، عند استخدام تشيكيا على أساس روتيني، تنشأ قضايا لا محالة 12.

للحصول على أفضل النتائج، من المهم أن تتبع الملاحظات التي تم تضمينها في جميع أنحاء بروتوكول، لأنها سوف تساعد المحلل إلى التغلب عليها واستكشاف الخطوات الصعبة. وهناك اعتبار رئيسي للحصول على قرار الأمثل في مجموعة معينة من الظروف هو إعداد الصحيح من حل BGE. وهذه العملية تتطلب وجود رقابة صارمة على القوة الأيونية وكلاء التخزين المؤقت، وتركيز المواد المضافة غير التخزين المؤقت ودرجة الحموضة. وعموما، فإن نظام CE يتطلب الرعاية والاهتمام بالتفاصيل. أنها يمكن أن تتلف بسهولة إذا تم تجاهل أي خطوة بشأن تنظيف النظام أو التجمع.

ويعتبر هذا الأسلوب استخدام الشعرية محايد. على عكس العارية الشعيرات الدموية تنصهر السيليكا،الشعيرات الدموية محايدة تقلل امتصاص البروتين على الجدار الداخلي الشعرية، وبالتالي تحسين كفاءة الفصل والدقة والتكرار 9. ومع ذلك، واستخدامه محدود بسبب كمية من الحقن التي يمكن القيام بها. في تجربتنا، يمكن أن يتم 120-150 الحقن من دون تأثير على قرار بسبب التدهور التدريجي للطلاء الداخلي. مرة واحدة الشعرية وصلت إلى هذا الحد، سوف تكون هناك حاجة إلى شعري جديد.

وقد تم الإبلاغ عن غيرها من البروتوكولات لتحليل التباين الفيزيائية من MABS من تشيكيا، والتي تشمل استخدام الشعيرات الدموية permanently- والمغلفة بشكل حيوي 13،14. ومع ذلك، فإن هذه الدراسات تقترح تطبيق مجموعة ثابتة من الشروط لتحليل التنوع واسعة من MABS. وعلى النقيض من الأساليب القائمة، ونحن نعتقد أن الأداء الأمثل يمكن أن يتحقق إلا عن طريق الخياطة الظروف التجريبية. على سبيل المثال، تم استخدام بروتوكول المعروضة هنا وتعديلها فيالماضي لتحليل التباين الإسوي من أربعة MABS أخرى مختلفة وجزء ماب 10. من أجل التكيف مع هذا البروتوكول لتقييم MABS أخرى، فإننا نوصي تعديل من BGE القوة الأيونية ودرجة الحموضة وفقا لتنوع المتغيرات ونقطة تساوي الكهربائية للجزيء ليتم تحليلها.

وينبغي أن تتضمن خطوات إضافية بعد اتقان هذه التقنية لتقييم أداء الأسلوب. المعلمات مثل الانتقائية والتكرار (من حيث الانحراف المعياري النسبي للوقت الهجرة والنسبة المئوية المنطقة) يجب أن يتم اختبار من أجل التأكد من أن هذه الطريقة مناسبة للاستخدام المقصود.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glacial acetic acid Tecsiquim AT0035-7
ACS grade hydrochloric acid J.T. Baker 9535-05
Histamine dihydrochloride Fluka 53300
(Hydroxypropyl) methyl cellulose  Fluka 09963
Lithium acetate Sigma-Aldrich 517992
6-Aminocaproic acid Sigma-Aldrich A2504
eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,  pH 8 Beckman Coulter 477427
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System Beckman Coulter A66528
eCAP Neutral capillary  Beckman Coulter 477441
Vial, Micro, 200 µl Beckman Coulter 144709
Universal Vial Caps Beckman Coulter A62250
Universal Vials Beckman Coulter A62251
Cable, Optics, UV/Vis Beckman Coulter 144093
UV/Vis Detector Module Beckman Coulter 144733
Cartridge Assembly Kit, Blank Beckman Coulter 144738

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases. Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).
  2. Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of monoclonal antibodies. J. Pharm. Sci. 97, (7), 2426-2447 (2008).
  3. Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. M. Recent advances in the analysis of therapeutic proteins by capillary and microchip electrophoresis. Anal. Methods. 6, (15), 5427-5449 (2014).
  4. Fekete, S., Guillarme, D., Sandra, P., Sandra, K. Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals. Anal. Chem. 88, (1), 480-507 (2016).
  5. He, Y., et al. Analysis of identity, charge variants, and disulfide isomers of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in an uncoated capillary column. Anal. Chem. 82, (8), 3222-3230 (2010).
  6. He, Y., Isele, C., Hu, W., Ruesch, M. Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary. J. Sep. Sci. 34, (5), 548-555 (2011).
  7. Zhao, S. S., Chen, D. D. Y. Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics. Electrophoresis. 35, (1), 96-108 (2014).
  8. Štěpánová, S., Kašička, V. Determination of impurities and counterions of pharmaceuticals by capillary electromigration methods. J. Sep. Sci. 37, (15), 2039-2055 (2014).
  9. Štěpánová, S., Kašička, V. Recent applications of capillary electromigration methods to separation and analysis of proteins. Anal. Chim. Acta. 933, 23-42 (2016).
  10. Espinosa-de la Garza, C. E., et al. Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 34, (8), 1133-1140 (2013).
  11. Staub, A., Guillarme, D., Schappler, J., Veuthey, J. L., Rudaz, S. Intact protein analysis in the biopharmaceutical field. J. Pharm. Biomed. Anal. 55, (4), 810-822 (2011).
  12. Altria, K. D. Troubleshooting. Methods in Molecular Biology, Vol 52. Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation and Applications. Altria, K. D. Chapter 10 (1996).
  13. Ma, S., Nashabeh, W. Analysis of protein therapeutics by capillary electrophoresis. Chromatographia. 53, (5), 75-89 (2001).
  14. Jaccoulet, E., Smadja, C., Prognon, P., Taverna, M. Capillary electrophoresis for rapid identification of monoclonal antibodies for routine application in hospital. Electrophoresis. 36, (17), 2050-2056 (2015).
الشعرية الكهربائي فصل حيدة النسيلة الأجسام المضادة الإسوية باستخدام الشعرية محايد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Espinosa-de la Garza, C. E., Salazar-Flores, R. D., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary. J. Vis. Exp. (119), e55082, doi:10.3791/55082 (2017).More

Espinosa-de la Garza, C. E., Salazar-Flores, R. D., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary. J. Vis. Exp. (119), e55082, doi:10.3791/55082 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter