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Biochemistry

Electrophorèse Capillaire séparation de l'anticorps monoclonal isoformes Utilisation d'un Capillaire Neutre

doi: 10.3791/55082 Published: January 16, 2017
* These authors contributed equally

Introduction

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Les anticorps monoclonaux (mAb) sont des protéines biothérapeutiques avec un intérêt croissant en raison de leur capacité d'agir contre plusieurs maladies chroniques et dégénératives 1. Comme d' autres biomolécules, les mAb sont sujettes à subir plusieurs modifications physico - chimiques à tous les stades de leur cycle de vie (ie, de la biosynthèse du produit final). De telles modifications comprennent, mais sans s'y limiter: la désamidation, la glycosylation, l' oxydation, la cyclisation, l' isomérisation, l' agrégation et le clivage protéolytique 2. Par conséquent, les techniques d'analyse capables de résoudre les isoformes intrinsèques sont nécessaires pour surveiller les mAb hétérogénéité et de la stabilité dans le but d'établir des spécifications de qualité.

L'électrophorèse capillaire (CE) est une technologie de séparation haute performance réalisée outinside d'un tube de silice fondue étroite (plage um) remplie d'un électrolyte de fond (BGE). Lors de l'application d'un champ électrique (jusqu'à 30 000 V), molécule chargées migrent vers l'électrode avec une charge opposée ( à savoir, la séparation entraîné électro-). L'utilisation de tensions élevées en CE permet des analyses rapides et une plus grande efficacité, qui sont supérieures à une électrophorèse sur gel classique. Électrophorèse capillaire de zone (CZE) est une technique basée CE couramment utilisé dans l'industrie biopharmaceutique pour l' évaluation de la qualité du produit 3-9. Contrairement à d' autres modes de CE (par exemple, l' électrophorèse sur gel capillaire, capillaire isoélectrofocalisation) ou des méthodes basées sur la chromatographie, CZE peut être effectuée sans utiliser dénaturants ou interfaces en phase solide, ce qui permet l'analyse de l'hétérogénéité inhérente des mAb proches de leur état natif 10 . Séparation CZE des isoformes mAb se produit à l' intérieur d'un capillaire en silice fondue recouverte d'un polymère hydrophile (capillaire neutre) et est basé sur leur mobilité électrophorétique différente, qui est gouverné par la charge, la masse, la taille et la forme (ou volume hydrodynamique) 11. fractions mAb sont détectées lorsqueils sont mobilisés et passent à travers la fenêtre de détection, qui est détecté par un détecteur ultraviolet (UV) de l' absorbance à 214 nm 4.

La mise en œuvre réussie de cette technique d'analyse dépendra de l'attention voulue aux détails avant et pendant l'expérience. Agir autrement augmentera le coût et le temps de procéder à l'analyse, conduisant finalement à l'échec et la frustration constante.

Ici, nous présentons un guide étape par étape pour effectuer une analyse réussie de mAb hétérogénéité par CZE par l'explication détaillée de la préparation des solutions et des échantillons, la préparation du système de CE, les méthodes d'instruments mis en place, l'acquisition de données, et le traitement. Aux fins de ce tutoriel, un anti-facteur de nécrose tumorale alpha entièrement humain recombinant (anti-TNF) mAb est utilisé comme modèle de protéine; Cependant, ce protocole peut être facilement personnalisé pour l'analyse d'autres protéines qui envisagent de brèves modifications. UNEn outre, plusieurs recommandations visant à atténuer les problèmes potentiels sont proposés. Le lecteur est invité à suivre strictement le protocole proposé, comme la probabilité de réussir augmentera.

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Protocol

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1. Préparation des solutions

  1. Préparer la solution BGE.
    1. Préparer 100 ml d'une solution composée de 0,05% (m / v) de cellulose, l'hydroxy propyl méthyl cellulose (HPMC), 200 mM de ε-amino n-caproïque (EACA) et 30 mM d'acétate de lithium.
      NOTE: Comme HPMC est un polymère viscoélastique, verser la poudre dans un bécher en verre, ajouter 80 ml d'eau et enfin ajouter la barre d'agitation. Continuez à ajouter les autres réactifs comme normalement. Porter des lunettes de sécurité lors de la manipulation d'acétate de lithium car il peut causer une irritation des yeux.
    2. Ajuster la valeur de pH 4,8 ± 0,1 avec 50% (v / v) d'acide acétique. Laisser la solution se stabiliser pendant 5 min et ajuster si nécessaire.
    3. Ajouter de l'eau pour compléter à un volume final de 100 ml en fiole jaugée.
    4. Filtrer à travers une membrane hydrophile ayant une taille de pores de 0,2 um.
    5. Conserver à 2-8 ° C pendant 7 jours.
  2. Préparer l'étalon interne.
    1. Préparer 1 mld'une solution composée de 1% (m / v) histamine.
    2. Filtrer à travers une membrane hydrophile ayant une taille de pores de 0,2 um.
    3. Conserver à 2-8 ° C pendant 1 jour.

Préparation 2. Sample

  1. Préparation de 180 ul d'échantillon dilué Acm avec du tampon Tris (50 mM de Tris (hydroxyméthyl) aminométhane, pH 8,0) à une concentration finale de 1 mg / ml.
  2. Ajouter 20 pi de 1% (m / v) de l'histamine.
  3. Mélanger et centrifuger à 1000 xg pendant 5 sec.
  4. Placer un micro-fiole dans un flacon universel.
  5. Transférer l'échantillon dans le micro flacon et boucher le flacon universel. Distribuer l'échantillon vers le haut afin d'éviter d'introduire des bulles.
  6. Conserver à 2-8 ° C pendant 1 jour.
  7. Placer le flacon universel (avec micro flacon contenant la solution d'échantillon) dans le bac d'entrée d'échantillon.

3. Préparation du système CE.

  1. Système de nettoyage CE.
    NOTE: Conduite eest procédé au moins une fois par semaine, afin d'éviter les fuites de courant électrique provenant de l'accumulation de poussière et de débris. Toutefois, en fonction de l'application (par exemple, l' utilisation d'un BGE avec une viscosité accrue ou avec une concentration élevée en sel, des échantillons avec augmentation de la viscosité) électrodes et leviers d'ouverture peut exiger d'être nettoyé plus fréquemment pour éviter la contamination croisée et contamination de l' échantillon.
    1. Éteignez l'interrupteur d'alimentation de l'instrument de la CE et d'ouvrir la porte d'entrée.
    2. Nettoyer la surface de la couverture de l'échantillon, l'échantillon de maintien du système (échantillon et tampons plateaux), couvercle de la cartouche, barre de serrage, bloc d'interface et des électrodes avec un non-tissé imbibé d'eau essuyez. Répétez la procédure avec un mélange éthanol-humidifié essuyer et sécher avant de l'utiliser.
    3. Rincer les leviers d'ouverture avec de l'eau. Nettoyer leur surface avec un Chiffon non tissé. Répétez la procédure avec un mélange éthanol-humidifié essuyer et sécher avant l'installation.
    4. Nettoyer les deux extrémités du câble à fibres optiques prudently avec un chiffon en microfibre imbibé d'eau. Répétez la procédure avec un chiffon imbibé d'éthanol.
  2. Ensemble de cartouche.
    1. Retirer un nouveau capillaire neutre (50 um de diamètre intérieur) de son emballage.
    2. Bande vers le bas une extrémité du capillaire tube de protection sur le plan de travail. Déroulez, redresser et tirer le capillaire sur le tube.
    3. Collez un morceau de ruban adhésif ou de papier à l'établi et ajouter des repères de mesure comme suit: longueur au détecteur (30 cm), la fenêtre capillaire (0,2 cm) et de la longueur à l'extrémité de sortie (10 cm) (ie, longueur 40,2 cm au total, 30,0 cm de longueur effective).
    4. Alignez la fenêtre capillaire à la marque de mesure de 0,2 cm dans le document de référence. Fixer le capillaire avec du ruban adhésif et marquer les extrémités du capillaire 2 mm en dehors des marques de mesure.
    5. Coupez le capuchon de protection à l'extrémité d'entrée capillaire (le plus éloigné de la fin de la fenêtre) dans un seul mouvement rectiligne en utilisant le bord affleurement de la pierre de fendage.
      1. Immerger l'extrémité capillaire dans un flacon universel plafonné rempli d'eau afin d'éviter des dommages permanents au revêtement intérieur capillaire. Répéter cette opération à chaque fois que l'extrémité capillaire est exposé à la température ambiante pendant plus de 1 min.
    6. Insérer l'extrémité d'entrée capillaire dans le côté de sortie de la cartouche.
    7. Poussez et tirez le capillaire à travers la cartouche que nécessaire jusqu'à ce que la fenêtre capillaire est centrée à la fenêtre de la cartouche.
    8. Insérez la fiche d'ouverture (100 um x 200 um) dans la fenêtre de la cartouche.
      REMARQUE: Assurez-vous que la lumière blanche passe à travers la fenêtre quand il est exposé à une source de lumière blanche. Si la lumière qui passe à travers a une apparence brunâtre, ajuster si nécessaire.
    9. Insérer le capillaire dans le tube de liquide de refroidissement pré-formé pour une longueur capillaire totale de 40,2 cm (avec écrou de tube pré-installé, la virole et le joint torique aux deux extrémités dans cet ordre).
    10. Poussez le capillaire à travers le coolant tubulure comme nécessaire jusqu'à ce que le capillaire figure à l'autre côté du tube.
    11. Insérer l'extrémité du tube de refroidissement dans le côté de sortie de la cartouche et serrer l'écrou de tube.
    12. Insérer l'extrémité d'entrée capillaire dans le côté d'entrée de la cartouche.
    13. Poussez et tirez le capillaire à travers la cartouche que nécessaire jusqu'à ce que le capillaire apparaît à côté de l'entrée de la cartouche.
    14. Insérer l'extrémité du tube de refroidissement dans le côté d'entrée de la cartouche et serrer l'écrou de tube.
    15. Coupez le capuchon de protection à l'extrémité de sortie capillaire (l'extrémité la plus proche de la fenêtre) en un seul mouvement rectiligne en utilisant le bord affleurement de la pierre de fendage.
    16. Insérez les clips de joint-retenue sur les extrémités capillaires et appuyez sur pour la mettre en position. Inspecter visuellement les extrémités du capillaire. Si elles ne sont même pas, répétez la procédure.
    17. Placer le gabarit capillaire de longueur sur le bord du plan de travail.
    18. Placez la cartouche vers le bas against le modèle capillaire de longueur et aligner le tube capillaire se termine par les lignes de référence sur le modèle. Si les marques de mesure capillaire (voir 3.2.4) ne sont pas alignées avec les lignes de référence, ajuster si nécessaire.
    19. Tenir le capillaire contre le modèle capillaire de longueur et couper les deux extrémités du capillaire en utilisant le bord du flush de la cliver pierre 2 mm en dessous des lignes de référence sur le modèle.
    20. Inspecter visuellement le capillaire se termine par une loupe. Si les extrémités capillaires ne sont pas lisses, brunir les utiliser le visage doux de la pierre de fendage.
    21. Insérez l'ouverture joint torique dans le trou du bouchon d'ouverture à l'aide de l'outil d'insertion O-ring.
    22. Installez des flacons universels plafonnés remplis d'eau dans le boîtier de la cartouche et le lieu cartouche dans le cas immédiatement avec des extrémités capillaires insérées dans des flacons. Pour le stockage à court et à long terme garder à 2-8 ° C.
  3. Préparation de plateaux de tampons.
    1. Remplissez et placez univers plafonnésdes flacons al dans l'entrée de la mémoire tampon et des plateaux de sortie (figure 1). positions flacon Répéter les pistes 2, 3, 4 et 5 selon le nombre d'échantillons à analyser, en plaçant une voie pour tous les six injections d'échantillons.
      REMARQUE: Évitez de mouiller les bouchons des flacons afin d'éviter les fuites de courant.

Figure 1
Figure 1: Position et le niveau de remplissage des flacons universels dans l'entrée de la mémoire tampon et de sortie des plateaux. Remplir les niveaux: 1/1 = 1400 pi, 3/4 = 1300 pi et 1/2 = 1000 pi. Abréviations: W = eau, HCl = acide chlorhydrique 0,1 M. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Système CE composants d'assemblage.
    1. Installez le détecteur UV.
    2. Installer les leviers d'ouvertureen appuyant vers le haut dans le bloc d'interface.
    3. Installez le câble à fibre optique. Insérez l'extrémité correspondant à la barre de serrage et, tout en maintenant les deux extrémités, tourner dans le sens horaire. Connectez l'autre extrémité au détecteur UV.
      REMARQUE: Manipulez le câble à fibre optique avec soin au cours de cette procédure depuis la flexion pourrait provoquer sa rupture.
    4. Placer l'échantillon et des plateaux de tampons dans le système échantillon de maintien et enclenchent en position.
    5. Placez la cartouche capillaire dans le bloc d'interface et, tout en appuyant sur la barre de serrage aux deux extrémités, serrez les boutons.

4. Méthodes Instrument Set-up

  1. Créer le conditionnement, le fonctionnement et les méthodes de l'appareil d'arrêt selon les paramètres suivants et le tableau 1: Tension, max: 30,0 kV; Courant, max: 300,0 uA; Température de la cartouche: 20,0 ° C; température de stockage de l'échantillon: 10,0 ° C; détecteur UV conditions initiales: Wavelength: 214 nm; Débit de données: 4 Hz; Filtre: normal; largeur Peak (des points): 16-25; signal Absorbance: Direct.
    NOTE: taux d'acquisition des données peut être augmentée jusqu'à 25 Hz afin d'améliorer la couverture des zones de séparation étroites.
<td> Eau flacon Outlet
Conditionnement programme méthode du temps
Temps (min) un événement Valeur Durée flacon Inlet flacon Outlet Résumé commentaires
- Rincez - Pression 2068 mbar 1,0 min BI: C1 BO: C1 Vers l'avant HCl 0,1 M
- Rincez - Pression 2068 mbar 2.0 min BI: B1 BO: C1 Vers l'avant
- Rincez - Pression 2068 mbar 10,0 min BI: E1 BO: C1 Vers l'avant BGE
0.00 Séparé - Tension 15,0 KV 10,0 min BI: D1 BO: D1 0,17 Min rampe, polarité normale Séparé
10.00 Rincez - Pression 2758 mbar 10,0 min BI: E1 BO: C1 Vers l'avant BGE
20.01 Attendez - 0,0 min BI: A1 BO: A1 - conseils de rinçage
Exécution de méthode programme de temps
Temps (min) un événement Valeur Durée flacon Inlet Résumé commentaires
- Rincez - Pression 2068 mbar 1,0 min BI: C1 BO: C1 Forward, In / Out inc flacon 6 HCl 0,1 M
- Rincez - Pression 2068 mbar 2.0 min BI: B1 BO: C1 Forward, In / Out inc flacon 6 Eau
- Rincez - Pression 2068 mbar 4.0 min BI: E1 BO: C1 Forward, In / Out inc flacon 6 BGE
- Injecter - Pression 34 mbar 20.0 sec SI: A1 BO: B1 Substituer, Forward injection échantillon
- Attendez - 0,4 min BI: A1 BO: A1 In / Out inc flacon 6 LAVAGE
0 Séparé - Tension 15,0 KV 30,0 min BI: D1 BO: D1 0,17 Min rampe, polarité normale, In / Out inc flacon 6 séparation Sample
0,5 Autozéro - - - - - -
30.01 Arrêtez les données - - - - - -
30.02 Rincez - Pression 2068 mbar 2.0 min BI: B1 BO: C1 Forward, In / Out inc flacon 6 Eau
32.03 Attendez - 0,0 min BI: A1 BO: A1 In / Out inc flacon 6 conseils de rinçage
32.04 Fin - - - - - Fin
Arrêt programme méthode du temps
Temps (min) un événement Valeur Durée flacon Inlet flacon Outlet Résumé commentaires
- Rincez - Pression 2068 mbar 1,0 min BI: E6 BO: E6 Vers l'avant HCl 0,1 M
- Rincez - Pression 2068 mbar 6,0 min BI: F6 BO: F6 Vers l'avant Eau
- Lamp - Off - - - - - -
- Attendez - 0,0 min BI: A1 BO: A1 - conseils de rinçage

Tableau 1: Conditionnement, en cours d' exécution et les programmes de temps d'arrêt.

5. Acquisition et traitement de données

  1. Programmer l'ensemble de l' échantillon.
    1. Programmer le capillaire pour le conditionnement en utilisant le procédé de l'appareil de conditionnement. Quand le capillaire est utilisé pour la première fois, le programme quatre répétitions; sinon programmer seulement deux répétitions du procédé de conditionnement.
    2. Programmer les échantillons à analyser en utilisant la méthode de l'instrument en cours d'exécution.
    3. Programmer le capillaire pour le stockage en utilisant la méthode de l'instrument d'arrêt et répéter la procédure indiquée dans la section 3.2.22.
  2. Exécutez l'expérience.
  3. Exporter les électrophérogrammes.
  4. Calculer le temps de migration et la teneur en pourcentage de base, un principalisoformes acides nd utilisant l'intégration verticale de la ligne de chute du profil de électrophérogramme.

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Representative Results

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La figure 2 montre le profil du courant électrique typique d'un EACA 200 mM, 30 mM d' acétate de lithium à pH 4,8 avec l' échantillon BGE anti TNFa Acm dilué avec du tampon Tris (50 mM, pH 8,0). Comme on peut le constater, le courant est stable tout au long de l'analyse et peut osciller entre des valeurs de 30 à 35 uA. La figure 3 montre l'électrophérogramme CZE d'un échantillon vierge où le pic détecté correspond à l'étalon interne histamine. Il est prévu pour l'histamine d'avoir un temps de migration de 3,7 à 4,1 min. La figure 4 montre l'électrophérogramme CZE d'anticorps anti-TNFa mAb. Comme on peut le remarquer, le pic principal est précédé et suivi par des pics de plus faible intensité. Depuis la séparation est réalisée sous polarité normale (c. -à- du positif au négatif), l'analyse révèle isoformes de base (mAb variantes avec charge positive) la migration plus rapide et isoformes acides (mAb variantes avec charge négative) la migration plus lente que l'isoforme principale.

Figure 2
Figure 2: profil de courant électrique d'une course de CZE typique. Le courant BGE est stable à environ 30 uA lorsque l'échantillon est dilué avec un mAb tampon Tris (50 mM, pH 8,0). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: CZE électrophérogramme d'échantillon à blanc. Noter qu'aucun des pics sont détectés en dehors de celle de l'étalon interne de l'histamine. UA = unités d'absorbance. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

tente "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 4
Figure 4: hétérogénéité physico - chimique des anti-TNFa mAb déterminé par CZE. Cet échantillon est composé d'isoformes de base, principal et acides. Encart montre une vue agrandie des variantes résolus par CZE. UA = unités d'absorbance. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Dans ce tutoriel, nous mettons en évidence l'importance des pratiques appropriées lors de la conduite CZE analyse de mAb afin d'augmenter la probabilité de réussir. Toutefois, lorsque CZE est utilisé sur une base régulière, les questions se posent inévitablement 12.

Pour de meilleurs résultats, il est important de suivre les notes qui ont été inclus dans l'ensemble du protocole, car elles aideront l'analyste à surmonter et résoudre les étapes difficiles. Une considération majeure pour obtenir une résolution optimale à un ensemble donné de conditions est la préparation correcte de solution BGE. Ce processus nécessite d'avoir un contrôle strict sur la force ionique des agents tampons, de la concentration d'additifs non-tampon et pH. Dans l'ensemble, le système de la CE a besoin de soins et d'attention aux détails. Il peut être facilement endommagée si aucune mesure concernant le nettoyage ou l'assemblage du système est ignoré.

Le présent procédé considère que l'utilisation d'un capillaire neutre. Contrairement à nu capillaires en silice fondue,capillaires neutres réduisent l' adsorption des protéines sur la paroi interne capillaire, améliorant ainsi l' efficacité de la séparation, la précision et la répétabilité 9. Toutefois, son utilisation est limitée par la quantité d'injections qui peuvent être effectuées. Dans notre expérience, 120 à 150 injections peuvent être effectuées sans effet sur la résolution en raison de la dégradation progressive de la couche intérieure. Une fois que le capillaire a atteint cette limite, un nouveau capillaire sera nécessaire.

D' autres protocoles ont été rapportés pour l'analyse de l'hétérogénéité physicochimique des mAb par CZE, qui comprennent l'utilisation de capillaires à demeure et dynamiquement enduites 13,14. Cependant, ces études proposent l'application d'un ensemble fixe de conditions pour analyser la grande diversité des mAb. Contrairement aux méthodes existantes, nous pensons que la performance optimale ne peut être obtenue en adaptant les conditions expérimentales. Par exemple, le protocole présenté ici a été utilisé et ajusté dans lepassé pour analyser l'hétérogénéité des isoformes de quatre autres mAb différents et un fragment mAb 10. Afin d'adapter ce protocole pour évaluer d'autres mAb, nous recommandons la modulation de la force ionique et le pH BGE selon la diversité des variantes et le point isoélectrique de la molécule à analyser.

D'autres étapes après la maîtrise de cette technique devraient inclure l'évaluation de la performance de la méthode. Des paramètres tels que la sélectivité et la répétabilité (en termes de l'écart type relatif des temps de migration et de pourcentage de surface) doivent être testés afin de confirmer que la méthode est adaptée à l'usage prévu.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glacial acetic acid Tecsiquim AT0035-7
ACS grade hydrochloric acid J.T. Baker 9535-05
Histamine dihydrochloride Fluka 53300
(Hydroxypropyl) methyl cellulose  Fluka 09963
Lithium acetate Sigma-Aldrich 517992
6-Aminocaproic acid Sigma-Aldrich A2504
eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,  pH 8 Beckman Coulter 477427
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System Beckman Coulter A66528
eCAP Neutral capillary  Beckman Coulter 477441
Vial, Micro, 200 µl Beckman Coulter 144709
Universal Vial Caps Beckman Coulter A62250
Universal Vials Beckman Coulter A62251
Cable, Optics, UV/Vis Beckman Coulter 144093
UV/Vis Detector Module Beckman Coulter 144733
Cartridge Assembly Kit, Blank Beckman Coulter 144738

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References

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Espinosa-de la Garza, C. E., Salazar-Flores, R. D., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary. J. Vis. Exp. (119), e55082, doi:10.3791/55082 (2017).More

Espinosa-de la Garza, C. E., Salazar-Flores, R. D., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary. J. Vis. Exp. (119), e55082, doi:10.3791/55082 (2017).

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