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Biochemistry

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी isoforms की केशिका वैद्युतकणसंचलन पृथक्करण एक तटस्थ केशिका का उपयोग

doi: 10.3791/55082 Published: January 16, 2017
* These authors contributed equally

Introduction

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मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (MABS) अपनी क्षमता कई पुरानी और अपक्षयी रोगों 1 के खिलाफ कार्रवाई करने के कारण ब्याज में वृद्धि के साथ biotherapeutic प्रोटीन होते हैं। अन्य जैविक अणुओं की तरह, MABS (अंतिम उत्पाद के लिए यानी, जैव संश्लेषण से) उनके जीवन चक्र के सभी चरणों में कई भौतिक संशोधनों से गुजरना होने का खतरा है। इस तरह के संशोधन शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं: deamidation, ग्लाइकोसिलेशन, ऑक्सीकरण, चक्रगति, isomerization, एकत्रीकरण और प्रोटिओलिटिक दरार 2। इसलिए, विश्लेषणात्मक आंतरिक isoforms को हल करने में सक्षम तकनीकों आदेश गुणवत्ता मानकों को स्थापित करने के MABS विविधता और स्थिरता पर नजर रखने की जरूरत है।

केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) एक उच्च प्रदर्शन जुदाई प्रौद्योगिकी एक संकीर्ण जुड़े हुए सिलिका ट्यूब (माइक्रोन रेंज) एक पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट (BGE) के साथ भर के outinside किया है। एक बिजली के क्षेत्र के आवेदन पर आरोप लगाया अणु (30,000 वी तक)एस विपरीत प्रभारी (यानी, विद्युत चालित जुदाई) के साथ इलेक्ट्रोड की ओर पलायन। सीई में उच्च वोल्टेज का उपयोग तेजी से विश्लेषण और वृद्धि की क्षमता है, जो शास्त्रीय जेल वैद्युतकणसंचलन से बेहतर हैं अनुमति देता है। केशिका क्षेत्र वैद्युतकणसंचलन (CZE) एक सीई आधारित तकनीक नियमित रूप से उत्पाद की गुणवत्ता के आकलन के लिए 3-9 biopharmaceutical उद्योग में प्रयोग किया जाता है। सीई के अन्य साधनों (जैसे, केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन, केशिका समविद्युतविभव ध्यान केंद्रित) या क्रोमैटोग्राफी आधारित विधियों के विपरीत, CZE उनके मूल राज्य में 10 के करीब MABS के निहित विविधता के विश्लेषण की अनुमति, denaturants या ठोस चरण इंटरफेस का उपयोग किए बिना किया जा सकता है । एमएबी isoforms की CZE जुदाई एक दूसरे से जुड़ने सिलिका केशिका एक हाइड्रोफिलिक बहुलक (तटस्थ केशिका) के साथ कवर के अंदर होता है और उनके विभिन्न electrophoretic गतिशीलता है, जो प्रभारी, जन, आकार और आकार (या hydrodynamic मात्रा) 11 से खारिज कर दिया है पर आधारित है। एमएबी moieties जब पता चला रहे हैंवे जुटाए और पता लगाने की खिड़की है, जो 214 एनएम 4 में एक पराबैंगनी (यूवी) absorbance डिटेक्टर से लगा है के माध्यम से पारित कर रहे हैं।

इस विश्लेषणात्मक तकनीक के सफल कार्यान्वयन से पहले और प्रयोग के दौरान जानकारी के लिए उचित ध्यान पर निर्भर करेगा। अन्यथा अभिनय विश्लेषण का संचालन करने के लिए लागत और समय में वृद्धि होगी, अंत में लगातार असफलता और हताशा के लिए अग्रणी।

यहाँ, हम समाधान और नमूने, सीई प्रणाली, साधन तरीकों की स्थापना की, डाटा अधिग्रहण की तैयारी की तैयारी के विस्तृत विवरण के माध्यम से CZE द्वारा एमएबी विविधता का एक सफल विश्लेषण का संचालन करने के लिए एक कदम दर कदम गाइड मौजूद है, और प्रसंस्करण। इस ट्यूटोरियल के प्रयोजन के लिए, एक पुनः संयोजक पूरी तरह से मानव विरोधी ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (विरोधी TNFα) एमएबी प्रोटीन मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है; हालांकि, इस प्रोटोकॉल आसानी से संक्षिप्त संशोधनों पर विचार अन्य प्रोटीन के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। एdditionally, कई सिफारिशों को कम करने के लिए संभावित मुद्दों का प्रस्ताव है। पाठक सख्ती से प्रस्तावित प्रोटोकॉल का पालन करने, संभावना में वृद्धि होगी सफल होने के लिए के रूप में प्रोत्साहित किया जाता है।

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Protocol

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1. समाधान की तैयारी

  1. BGE समाधान तैयार है।
    1. 0.05% की रचना की एक समाधान के 100 मिलीलीटर की तैयारी (एम / वी) हाइड्रोक्सी propyl मिथाइल सेलुलोज (एचपीएमसी), 200 मिमी ε अमीनो एन कैप्रोइक एसिड (EACA) और 30 मिमी लिथियम एसीटेट।
      नोट: एचपीएमसी एक viscoelastic बहुलक है के रूप में, एक गिलास बीकर में पाउडर डालना पानी के 80 एमएल जोड़ने और अंत में सरगर्मी बार जोड़ें। सामान्य रूप से के रूप में शेष अभिकर्मकों जोड़कर आगे बढ़ें। सुरक्षा चश्मा पहन जब लिथियम एसीटेट से निपटने के रूप में यह आंखों में जलन पैदा कर सकता है।
    2. पीएच मान 50% (v / v) एसिटिक एसिड के साथ 4.8 ± 0.1 करने के लिए समायोजित करें। समाधान 5 मिनट के लिए स्थिर और आवश्यक के रूप में समायोजित करने की अनुमति दें।
    3. पानी फ्लास्क में 100 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए बनाने के लिए जोड़ें।
    4. एक 0.2 माइक्रोन ताकना आकार के साथ एक हाइड्रोफिलिक झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर।
    5. 7 दिनों के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  2. आंतरिक मानक तैयार करें।
    1. 1 एमएल तैयार1% (एम / वी) हिस्टामिन से बना एक समाधान की।
    2. एक 0.2 माइक्रोन ताकना आकार के साथ एक हाइड्रोफिलिक झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर।
    3. अप करने के लिए 1 दिन के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

2. नमूना तैयार

  1. एमएबी नमूना 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए Tris बफर (50 मिमी Tris (hydroxymethyl) aminomethane, 8.0 पीएच) के साथ पतला के 180 μl तैयार करें।
  2. 1% (एम / वी) हिस्टामिन का 20 μl जोड़ें।
  3. मिक्स और 5 सेकंड के लिए 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  4. एक माइक्रो शीशी एक सार्वभौमिक शीशी के अंदर रखें।
  5. माइक्रो शीशी में नमूना हस्तांतरण और सार्वभौमिक शीशी टोपी। आदेश में किसी भी बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए ऊपर की तरफ नमूना बांटना।
  6. अप करने के लिए 1 दिन के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  7. यूनिवर्सल शीशी नमूना इनलेट ट्रे में (सूक्ष्म नमूना समाधान युक्त शीशी) के साथ रखें।

3. सीई प्रणाली की तैयारी।

  1. सीई सफाई व्यवस्था।
    नोट: आचार वेंआदेश में विद्युत प्रवाह रिसाव धूल और मलबे के संचय से निकाली गई बचने के लिए कम से कम एक बार एक हफ्ते प्रक्रिया है। हालांकि, आवेदन के आधार पर (जैसे, वर्धित चिपचिपाहट के साथ या उच्च नमक एकाग्रता में वृद्धि हुई, चिपचिपाहट के साथ नमूनों के साथ एक BGE का उपयोग) इलेक्ट्रोड और खोलने लीवर अधिक बार साफ किया जाना पार संक्रमण और नमूना भार को रोकने के लिए आवश्यकता हो सकती है।
    1. सीई साधन की बिजली स्विच बंद कर दें और सामने के दरवाजे खोलने के लिए।
    2. के साथ एक पानी घटा nonwoven पोंछ नमूना कवर की सतह को साफ, नमूना धारण प्रणाली (नमूना और बफर ट्रे), कारतूस कवर, दबाना बार, इंटरफेस ब्लॉक और इलेक्ट्रोड। एक इथेनॉल घटा पोंछे और उपयोग करने से पहले सूखे के साथ प्रक्रिया को दोहराएँ।
    3. अच्छी तरह से पानी के साथ खोलने लीवर कुल्ला। उनकी सतह को साफ एक nonwoven के साथ पोंछे। एक इथेनॉल घटा पोंछे और स्थापना से पहले सूखे के साथ प्रक्रिया को दोहराएँ।
    4. साफ फाइबर ऑप्टिक केबल सावधान के दोनों सिरोंएक पानी घटा microfiber कपड़ा के साथ Ly। एक इथेनॉल घटा कपड़े से प्रक्रिया को दोहराएँ।
  2. कारतूस विधानसभा।
    1. अपने पैकेज से एक नया तटस्थ केशिका (50 माइक्रोन आंतरिक व्यास) निकालें।
    2. टेप कार्यक्षेत्र केशिका सुरक्षात्मक ट्यूबिंग के एक छोर से नीचे। खुलना, सीधा और ट्यूबिंग बाहर केशिका खींच।
    3. कार्यक्षेत्र को टेप या कागज के एक टुकड़े चिपके रहते हैं और इस प्रकार के रूप में माप के निशान जोड़ें: डिटेक्टर (30 सेमी), केशिका खिड़की (0.2 सेमी) और लंबाई आउटलेट अंत करने के लिए (10 सेमी) (यानी, 40.2 सेमी कुल लंबाई करने के लिए लंबाई, 30.0 सेमी प्रभावी लंबाई)।
    4. संदर्भ पत्र में 0.2 सेमी माप चिह्नित करने के लिए केशिका खिड़की संरेखित करें। टेप के साथ केशिका फिक्स और मार्क केशिका माप के निशान के बाहर 2 मिमी समाप्त होता है।
    5. सुरक्षात्मक cleaving पत्थर के फ्लश में बढ़त का उपयोग कर एक एकल सीधे आंदोलन में केशिका इनलेट अंत में टोपी (खिड़की से अंत सब से अधिक दूर) में कटौती।
      1. आदेश केशिका भीतरी परत को स्थायी नुकसान से बचने के लिए पानी से भरे एक छाया सार्वभौमिक शीशी में केशिका अंत विसर्जित कर दिया। इस प्रक्रिया के लिए हर बार केशिका अंत से अधिक 1 मिनट के लिए परिवेश के संपर्क में है दोहराएँ।
    6. कारतूस के आउटलेट पक्ष में केशिका इनलेट अंत डालें।
    7. पुश और आवश्यक के रूप में कारतूस के माध्यम से केशिका खींच जब तक केशिका खिड़की कारतूस खिड़की करने के लिए केंद्रित है।
    8. एपर्चर प्लग (100 माइक्रोन x 200 माइक्रोन) कारतूस विंडो में डालें।
      नोट: पुष्टि करें कि सफेद रोशनी जब प्रकाश की एक सफेद स्रोत के संपर्क में खिड़की के माध्यम से गुजरता है। प्रकाश के माध्यम से गुजरता है कि एक भूरा रूप दिया है, तो के रूप में आवश्यक समायोजित करें।
    9. (इसी क्रम में दोनों सिरों पर पूर्व स्थापित ट्यूबिंग अखरोट, सामी और हे अंगूठी के साथ) 40.2 सेमी की कुल लंबाई केशिका के लिए पूर्व गठित शीतलक ट्यूबिंग में केशिका डालें।
    10. coolan के माध्यम से केशिका पुशटी ट्यूबिंग तक केशिका ट्यूबिंग के दूसरे पक्ष पर प्रकट होता है के रूप में आवश्यक।
    11. कारतूस के आउटलेट पक्ष में शीतलक ट्यूबिंग के अंत डालें और ट्यूबिंग अखरोट कस लें।
    12. कारतूस के प्रवेश पक्ष में केशिका इनलेट अंत डालें।
    13. पुश और जब तक केशिका कारतूस के प्रवेश पक्ष में दिखाई देता है आवश्यक के रूप में कारतूस के माध्यम से केशिका खींच।
    14. कारतूस के प्रवेश पक्ष में शीतलक ट्यूबिंग के अंत डालें और ट्यूबिंग अखरोट कस लें।
    15. cleaving पत्थर के फ्लश में बढ़त का उपयोग कर केशिका आउटलेट अंत (खिड़की से अंत निकटतम) एक एकल सीधे आंदोलन में कम से सुरक्षात्मक टोपी कट।
    16. केशिका सिरों के ऊपर सील-अनुचर क्लिप डालने और स्थिति में तस्वीर करने के लिए दबाएँ। नेत्रहीन का निरीक्षण केशिका समाप्त होता है। वे भी नहीं कर रहे हैं, प्रक्रिया को दोहराएँ।
    17. कार्यक्षेत्र के किनारे पर केशिका लंबाई टेम्पलेट रखें।
    18. एजी नीचे का सामना करना पड़ कारतूस की जगहकेशिका लंबाई टेम्पलेट ainst और संरेखित केशिका टेम्पलेट पर संदर्भ लाइनों के साथ समाप्त होता है। केशिका माप चिह्न (3.2.4 देखें) संदर्भ लाइनों के साथ तालमेल नहीं है, के रूप में आवश्यक समायोजित करें।
    19. केशिका लंबाई टेम्पलेट के खिलाफ केशिका पकड़ो और टेम्पलेट पर संदर्भ लाइनों के नीचे cleaving पत्थर 2 मिमी फ्लश किनारे का उपयोग केशिका के दोनों सिरों में कटौती।
    20. नेत्रहीन का निरीक्षण केशिका एक आवर्धक कांच के साथ समाप्त होता है। केशिका सिरों चिकनी नहीं कर रहे हैं, उन्हें cleaving पत्थर का नरम चेहरा का उपयोग कर चमकाना।
    21. हे अंगूठी प्रविष्टि उपकरण का प्रयोग एपर्चर प्लग छेद में एपर्चर हे अंगूठी डालें।
    22. शीशियों में डाला केशिका सिरों के साथ तुरंत मामले में छाया हुआ सार्वभौमिक कारतूस का मामला है और जगह कारतूस में पानी से भरे शीशियों को स्थापित करें। छोटी और लंबी अवधि के भंडारण के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।
  3. बफर ट्रे की तैयारी।
    1. भरें और छाया हुआ विश्वविद्यालय जगहबफर इनलेट में अल शीशियों और आउटलेट ट्रे (चित्रा 1)। नमूनों की संख्या के साथ अनुसार गलियों 2, 3, 4 और 5 में दोहराने शीशी पदों का विश्लेषण किया जाए, हर छह नमूना इंजेक्शन के लिए एक लेन रखकर।
      नोट: वर्तमान रिसाव को रोकने के लिए शीशी टोपियां गीला करने से बचें।

आकृति 1
चित्रा 1: स्थिति और बफर इनलेट और आउटलेट ट्रे में सार्वभौमिक शीशियों के स्तर को भरने के लिए। स्तरों भरें: 1/1 = 1400 μL, 3/4 = 1300 μL और 1/2 = 1000 μL। लघुरूप: डब्ल्यू = पानी, एचसीएल = 0.1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. सीई प्रणाली घटकों विधानसभा।
    1. यूवी डिटेक्टर स्थापित करें।
    2. खोलने लीवर स्थापित करेंइंटरफेस ब्लॉक में दबाकर।
    3. फाइबर ऑप्टिक केबल स्थापित करें। दबाना बार करने के लिए इसी अंत डालें और, दोनों सिरों धारण करते हुए, दक्षिणावर्त बारी बारी से। यूवी डिटेक्टर के लिए दूसरे छोर से कनेक्ट।
      नोट: झुकने अपने फ्रैक्चर का कारण बन सकता है क्योंकि इस प्रक्रिया के दौरान देखभाल के साथ फाइबर ऑप्टिक केबल संभाल लेना।
    4. प्लेस नमूना और नमूना होल्डिंग प्रणाली में बफर ट्रे और स्थिति में तस्वीर।
    5. केशिका कारतूस इंटरफेस ब्लॉक में रखें, और जब तक दोनों सिरों पर दबाना बार दबाने, knobs कस लें।

4. साधन तरीके सेट-अप

  1. कंडीशनिंग बनाएं, चल रहे हैं और बंद साधन तरीकों निम्नलिखित मानकों और 1 टेबल के अनुसार: वोल्टेज, अधिकतम: 30.0 केवी; वर्तमान, मैक्स: 300.0 μA; कारतूस के तापमान: 20.0 डिग्री सेल्सियस; नमूना संग्रहण तापमान 10.0 डिग्री सेल्सियस; यूवी डिटेक्टर प्रारंभिक स्थितियों: वेवलेंथ: 214 एनएम; डाटा दर: 4 हर्ट्ज; फिल्टर: सामान्य; शिखर चौड़ाई (बताते हैं): 16-25; Absorbance संकेत: प्रत्यक्ष।
    नोट: डाटा अधिग्रहण दर संकीर्ण जुदाई क्षेत्रों के कवरेज में सुधार के लिए 25 हर्ट्ज तक बढ़ाया जा सकता है।
<टीडी> पानी आउटलेट शीशी
कंडीशनिंग विधि समय कार्यक्रम
समय (मिनट) घटना मूल्य अवधि इनलेट शीशी आउटलेट शीशी सारांश टिप्पणियाँ
- कुल्ला - दबाव 2068 मिलीबार 1.0 मिनट बीआई: C1 बो: C1 आगे एचसीएल 0.1 एम
- कुल्ला - दबाव 2068 मिलीबार 2.0 मिनट बीआई: बी 1 बो: C1 आगे
- कुल्ला - दबाव 2068 मिलीबार 10.0 मिनट बीआई: E1 बो: C1 आगे BGE
0.00 अलग - वोल्टेज 15.0 केवी 10.0 मिनट बीआई: डी 1 बो: डी 1 0.17 मिन रैंप, सामान्य polarity अलग
10.00 कुल्ला - दबाव 2758 मिलीबार 10.0 मिनट बीआई: E1 बो: C1 आगे BGE
20.01 रुकिए - 0.0 मिनट बीआई: A1 बो: A1 - कुल्ला सुझाव दिए
विधि समय कार्यक्रम चल रहा है
समय (मिनट) घटना मूल्य अवधि इनलेट शीशी सारांश टिप्पणियाँ
- कुल्ला - दबाव 2068 मिलीबार 1.0 मिनट बीआई: C1 बो: C1 आगे, / बाहर शीशी इंक 6 एचसीएल 0.1 एम
- कुल्ला - दबाव 2068 मिलीबार 2.0 मिनट बीआई: बी 1 बो: C1 आगे, / बाहर शीशी इंक 6 पानी
- कुल्ला - दबाव 2068 मिलीबार 4.0 मिनट बीआई: E1 बो: C1 आगे, / बाहर शीशी इंक 6 BGE
- इंजेक्षन - दबाव 34 मिलीबार 20.0 सेकंड एसआई: A1 बो: बी 1 ओवरराइड, फॉरवर्ड नमूना इंजेक्शन
- रुकिए - 0.4 मिनट बीआई: A1 बो: A1 / बाहर शीशी इंक 6 में धो सुझाव दिए
0 अलग - वोल्टेज 15.0 केवी 30.0 मिनट बीआई: डी 1 बो: डी 1 0.17 मिन रैंप, सामान्य polarity, / बाहर शीशी इंक 6 नमूना पृथक्करण
0.5 Autozero - - - - - -
30.01 डेटा बंद करो - - - - - -
30.02 कुल्ला - दबाव 2068 मिलीबार 2.0 मिनट बीआई: बी 1 बो: C1 आगे, / बाहर शीशी इंक 6 पानी
32.03 रुकिए - 0.0 मिनट बीआई: A1 बो: A1 / बाहर शीशी इंक 6 में कुल्ला सुझाव दिए
32.04 समाप्त - - - - - समाप्त
शटडाउन विधि समय कार्यक्रम
समय (मिनट) घटना मूल्य अवधि इनलेट शीशी आउटलेट शीशी सारांश टिप्पणियाँ
- कुल्ला - दबाव 2068 मिलीबार 1.0 मिनट बीआई: E6 बो: E6 आगे एचसीएल 0.1 एम
- कुल्ला - दबाव 2068 मिलीबार 6.0 मिनट बीआई: F6 बो: F6 आगे पानी
- दीपक - बंद - - - - - -
- रुकिए - 0.0 मिनट बीआई: A1 बो: A1 - कुल्ला सुझाव दिए

तालिका 1: कंडीशनिंग, चल रहा है और बंद समय कार्यक्रम।

5. डाटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण

  1. नमूना निर्धारित कार्यक्रम।
    1. कंडीशनिंग साधन विधि का उपयोग कंडीशनिंग के लिए केशिका कार्यक्रम। केशिका पहली बार के लिए प्रयोग किया जाता है, इस कार्यक्रम के चार repetitions; अन्यथा कंडीशनिंग विधि के केवल दो repetitions कार्यक्रम।
    2. नमूनों का विश्लेषण किया जा करने के लिए कार्यक्रम चलाने साधन विधि का उपयोग।
    3. शटडाउन साधन विधि का उपयोग भंडारण के लिए केशिका कार्यक्रम और प्रक्रिया खंड 3.2.22 में संकेत दोहराएँ।
  2. प्रयोग चलाएँ।
  3. electropherograms निर्यात करें।
  4. माइग्रेशन समय और बुनियादी, मुख्य एक का प्रतिशत सामग्री की गणनाएन डी अम्लीय isoforms electropherogram प्रोफ़ाइल के खड़ी ड्रॉप लाइन एकीकरण का उपयोग कर।

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Representative Results

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चित्रा 2 एक 200 मिमी EACA 30 मिमी लिथियम एसीटेट के ठेठ बिजली चालू प्रोफ़ाइल से पता चलता है, विरोधी TNFα एमएबी नमूना Tris बफर (50 मिमी, 8.0 पीएच) के साथ पतला साथ पीएच 4.8 BGE। मनाया जा सकता है, वर्तमान विश्लेषण के दौरान स्थिर है और 30 से 35 μA के मूल्यों के बीच थरथराना सकते हैं। चित्रा 3, जहां पता चला चोटी हिस्टामिन आंतरिक मानक से मेल खाती है एक खाली नमूना के CZE electropherogram पता चलता है। यह 3.7 4.1 मिनट की एक पलायन समय है हिस्टामिन के लिए उम्मीद है। चित्रा 4 विरोधी TNFα एमएबी की CZE electropherogram पता चलता है। का उल्लेख किया जा सकता है, मुख्य शिखर के पहले और छोटे तीव्रता की चोटियों के बाद है। चूंकि जुदाई सामान्य polarity (यानी, सकारात्मक से नकारात्मक करने) के तहत आयोजित किया जाता है, विश्लेषण बुनियादी isoforms (एमएबी सकारात्मक चार्ज के साथ वेरिएंट) तेजी से पलायन और अम्लीय isoforms (एमएबी नकारात्मक चार्ज के साथ वेरिएंट) से पता चलता है मुख्य isoform की तुलना में धीमी पलायन।

चित्र 2
चित्रा 2: एक ठेठ CZE रन की विद्युत वर्तमान प्रोफ़ाइल। BGE वर्तमान 30 μA के आसपास स्थिर जब एमएबी नमूना Tris बफर (50 मिमी, 8.0 पीएच) के साथ पतला होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: खाली नमूना के CZE electropherogram। ध्यान दें कि कोई चोटियों हिस्टामिन आंतरिक मानक के उस से अलग पता चला रहे हैं। ए.यू. absorbance इकाइयों =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तम्बू "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्रा 4
चित्रा 4: विरोधी TNFα एमएबी की भौतिक विविधता CZE द्वारा निर्धारित की। यह नमूना, बुनियादी मुख्य और अम्लीय isoforms से बना है। इनसेट वेरिएंट CZE द्वारा हल की एक विस्तारित दृश्य दिखाता है। ए.यू. absorbance इकाइयों =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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इस ट्यूटोरियल में, हम उचित प्रथाओं के महत्व को जब आयोजित करने CZE आदेश में सफल होने के लिए संभावना को बढ़ाने के लिए MABS का विश्लेषण करती है पर प्रकाश डाला। हालांकि, जब CZE एक नियमित आधार पर इस्तेमाल किया जाता है, मुद्दों को अनिवार्य रूप से 12 उत्पन्न होती हैं।

सर्वोत्तम परिणामों के लिए, यह है कि नोटों प्रोटोकॉल भर में शामिल थे पालन करने के लिए, के रूप में वे विश्लेषक काबू पाने और मुश्किल कदम समस्याओं का निवारण करने में मदद मिलेगी महत्वपूर्ण है। एक प्रमुख विचार की स्थिति का सेट दिया पर इष्टतम समाधान प्राप्त करने के लिए BGE समाधान की सही तैयारी है। इस प्रक्रिया बफरिंग एजेंटों, गैर बफरिंग additives और पीएच की एकाग्रता की शक्ति ईओण पर सख्त नियंत्रण रखने की आवश्यकता है। कुल मिलाकर, सीई प्रणाली के विस्तार के लिए देखभाल और ध्यान देने की आवश्यकता है। यह आसानी से क्षतिग्रस्त किया जा सकता है, तो किसी भी प्रणाली की सफाई या विधानसभा के विषय में कदम नजरअंदाज कर दिया है।

वर्तमान पद्धति एक तटस्थ केशिका के उपयोग समझता है। नंगे जुड़े हुए सिलिका केशिकाओं के विपरीत,तटस्थ केशिकाओं, केशिका भीतरी दीवार पर प्रोटीन सोखना को कम इस तरह जुदाई दक्षता, सटीकता और repeatability 9 में सुधार। हालांकि, इसके उपयोग के इंजेक्शन की मात्रा है कि प्रदर्शन किया जा सकता द्वारा सीमित है। हमारे अनुभव में, 120 से 150 इंजेक्शन आंतरिक कोटिंग के प्रगतिशील गिरावट के कारण संकल्प पर प्रभाव के बिना किया जा सकता है। एक बार जब केशिका इस सीमा तक पहुँच गया है, एक नया केशिका आवश्यक हो जाएगा।

अन्य प्रोटोकॉल CZE, जो permanently- और गतिशील लेपित केशिकाओं 13,14 के उपयोग में शामिल द्वारा MABS की भौतिक विविधता के विश्लेषण के लिए सूचित किया गया है। हालांकि, इन अध्ययनों की स्थिति की एक निश्चित सेट के आवेदन का प्रस्ताव MABS की व्यापक विविधता का विश्लेषण करने के लिए। मौजूदा तरीकों के विपरीत, हम मानते हैं कि अनुकूलतम प्रदर्शन केवल प्रयोगात्मक शर्तों सिलाई द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल इस्तेमाल किया गया है और में समायोजितपिछले चार अन्य विभिन्न MABS की isoform विविधता और एक एमएबी टुकड़ा 10 विश्लेषण करने के लिए। आदेश में अन्य MABS मूल्यांकन करने के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूल करने के लिए, हम अनुशंसा करते वेरिएंट विविधता और अणु की समविद्युतविभव बिंदु के अनुसार BGE ईओण ताकत और पीएच के मॉडुलन विश्लेषण किया जा सके।

इस तकनीक के माहिर के बाद आगे कदम विधि प्रदर्शन के मूल्यांकन में शामिल करना चाहिए। इस तरह के चयनात्मकता और repeatability (माइग्रेशन समय और क्षेत्र के प्रतिशत के सापेक्ष मानक विचलन के मामले में) के रूप में पैरामीटर आदेश है कि विधि का इरादा उपयोग के लिए उपयुक्त है इस बात की पुष्टि करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glacial acetic acid Tecsiquim AT0035-7
ACS grade hydrochloric acid J.T. Baker 9535-05
Histamine dihydrochloride Fluka 53300
(Hydroxypropyl) methyl cellulose  Fluka 09963
Lithium acetate Sigma-Aldrich 517992
6-Aminocaproic acid Sigma-Aldrich A2504
eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,  pH 8 Beckman Coulter 477427
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System Beckman Coulter A66528
eCAP Neutral capillary  Beckman Coulter 477441
Vial, Micro, 200 µl Beckman Coulter 144709
Universal Vial Caps Beckman Coulter A62250
Universal Vials Beckman Coulter A62251
Cable, Optics, UV/Vis Beckman Coulter 144093
UV/Vis Detector Module Beckman Coulter 144733
Cartridge Assembly Kit, Blank Beckman Coulter 144738

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References

  1. Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases. Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).
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मोनोक्लोनल एंटीबॉडी isoforms की केशिका वैद्युतकणसंचलन पृथक्करण एक तटस्थ केशिका का उपयोग
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Espinosa-de la Garza, C. E., Salazar-Flores, R. D., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary. J. Vis. Exp. (119), e55082, doi:10.3791/55082 (2017).More

Espinosa-de la Garza, C. E., Salazar-Flores, R. D., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary. J. Vis. Exp. (119), e55082, doi:10.3791/55082 (2017).

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