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Biochemistry

중립 모세관을 사용하여 단일 클론 항체 동종의 모세관 전기 영동 분리

doi: 10.3791/55082 Published: January 16, 2017
* These authors contributed equally

Introduction

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단일 클론 항체 (단클론 항체는)으로 인해 여러 가지 만성 및 퇴행성 질환 일에 대해 행동하는 능력에 관심을 증가 biotherapeutic 단백질이다. 다른 생체 분자와 마찬가지로, 모노클로 날 항체가 (최종 제품에 생합성에서, 예) 수명주기의 모든 단계에서 여러 가지 물리 화학적 변형을 받아야하는 경향이있다. 이러한 변형을 포함하지만 이에 한정되지 않는다 : 탈 아미드 화, 글리코 실화, 산화, 폐환 반응, 이성화 반응, 응집 단백질 분해 절단이. 따라서, 극한 이성체를 해결할 수있는 분석 기법은 품질 사양을 설정하기 위해 모노클로 날 항체 얼룩이 안정성을 모니터링 할 필요가있다.

모세관 전기 영동 (CE)는 배경 전해질 (BGE)로 채워진 좁은 용융 실리카 튜브 (μm의 범위)의 outinside 실시 고성능 분리 기술이다. 전계의인가시에, 충전 분자 (30,000 V까지)의는 반대 전하 (즉, 전기 구동 분리)와 전극으로 이동한다. CE에서 높은 전압의 사용은 전통적인 겔 전기 우수한 고속 분석 및 증가 된 효율을 허용한다. 모세관 영역 전기 영동 (CZE)는 통상적으로 제품의 품질 평가 3-9에 대한 생물 약제 산업에 사용되는 CE 기반 기술이다. CE의 다른 모드 (예, 모세관 전기 영동, 모세관 등전점 포커싱) 또는 크로마토 기반의 방법과는 달리, CZE은 그 나라의 상태 (10)에 가까운 모노클 고유의 이질성의 분석을 허용 변성제 고체상 인터페이스를 사용하지 않고 수행 될 수있다 . 단클론 항체 동종의 CZE 분리는 친수성 고분자 (중립 모세관)으로 피복 용융 실리카 모세관 내부의 발생 전하, 질량, 크기 및 형상 (또는 유체 역학적 부피) (11)에 의해 지배되고 서로 다른 전기 영동 이동성을 기반으로한다. 단클론 항체 잔기 때 검출이들은 동원 214 내지 4에서 자외선 (UV) 흡수 검출기에 의해 감지 된 검출 윈도우를 통과한다.

이러한 분석 기술의 성공적인 구현은 전 실험 기간 동안 세부 적절한주의에 달려있다. 궁극적으로 지속적인 실패와 좌절로 이어지는 분석을 수행하기 위해 비용과 시간을 증가시킬 것이다, 그렇지 않으면 연기.

여기서는 용액 및 시료 CE 시스템 설정 악기 방법, 데이터 수집의 제제의 제조에 대한 상세한 설명을 통해 CZE 의해 단클론 이질성 성공적인 분석을 수행하는 단계별로 제시하고, 처리. 이 가이드의 목적을 위해, 재조합 완전 인간 항 종양 괴사 인자 알파 (TNFα 항) 단클론 항체 단백질 모델로서 사용된다; 그러나,이 프로토콜은 쉽게 간단한 수정을 고려하여 다른 단백질의 분석을 위해 사용자 정의 할 수 있습니다. 에이dditionally 몇 가지 권장 사항은 잠재적 인 문제가 제안 완화합니다. 독자는 엄격하게 증가 할 것이다 성공 확률로, 제안 된 프로토콜을 따르도록 권장합니다.

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Protocol

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솔루션 1. 준비

  1. BGE 솔루션을 준비합니다.
    1. 0.05 %로 이루어지는 용액 100㎖를 제조 하였다 (m / v)의 하이드 록시 프로필 메틸 셀룰로오스 (HPMC), 200 mM의 ε-N - 아미노 카프로 산 (EACA)와 30mm의 리튬 아세테이트.
      주 : HPMC는 점탄성 폴리머이기 때문에, 유리 비이커에 분말을 부어 물 80 mL를 첨가하고 마지막으로 교반 막대를 추가한다. 일반적으로 남아있는 시약을 계속 추가합니다. 그것은 눈 자극을 일으킬 수있는 리튬 아세테이트를 취급 할 때는 보안경을 착용한다.
    2. 50 % (v / v)로 아세트산으로 4.8 ± 0.1의 pH 값으로 조정한다. 용액을 5 분 동안 안정하고 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
    3. 메스 플라스크에 100 ㎖의 최종 부피를 만들기 위해 물을 추가합니다.
    4. 0.2 ㎛의 세공 크기를 갖는 친수성 막을 통과 필터.
    5. 최대 7 일 동안 2-8 ℃에서 보관하십시오.
  2. 내부 표준을 준비합니다.
    1. 1 mL의 준비1 % (m / v)로 히스타민 이루어지는 용액.
    2. 0.2 ㎛의 세공 크기를 갖는 친수성 막을 통과 필터.
    3. 최대 1 일 동안 2-8 ℃에서 보관하십시오.

2. 샘플 준비

  1. 1 mg / ml의 최종 농도로 트리스 완충액 (50 mM의 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄, pH를 8.0)으로 희석 된 단클론 항체의 샘플을 180 μL를 준비한다.
  2. 1 % (m / v)의 히스타민의 20 μl를 추가합니다.
  3. 혼합하고 5 초 동안 1,000 XG에 원심 분리기.
  4. 보편적 인 유리 병 내부에 마이크로 병을 놓습니다.
  5. 마이크로 바이알에 샘플을 전송하고 보편적 인 유리 병 캡. 기포를 도입하는 것을 방지하기 위해 위쪽으로 시료를 분배.
  6. 최대 1 일 동안 2-8 ℃에서 보관하십시오.
  7. 샘플 입구 트레이 (시료 용액을 포함하는 마이크로 바이알)와 보편적 인 병을 놓습니다.

CE 시스템 3. 준비.

  1. CE 시스템 청소.
    참고 : 실시 일먼지 나 이물질이 축적 유래의 전류 누설을 방지하기 위해 적어도 일주일 절차이다. 그러나, 용도에 따라 (예를 들면, 점도가 증가 또는 높은 염 농도 증가 점도 시료와 BGE 사용) 전극 및 개방 레버 교차 오염 샘플 캐리 오버를 방지하기 위해 더 자주 세정 될 필요로 할 수있다.
    1. 은 CE 기기의 전원 스위치를 끄고 전면 도어를 엽니 다.
    2. 물에 적신 부직포 와이프와 함께, 샘플 유지 시스템 (샘플 버퍼 트레이), 카트리지 커버, 클램프 바, 인터페이스 블록과 전극을 샘플 커버의 표면을 청소합니다. 과 절차를 반복 에탄올을 묻혀 닦아 사용하기 전에 건조.
    3. 철저하게 물을 개방 레버를 씻어. 부직포 닦아 자신의 표면을 청소합니다. 과 절차를 반복 에탄올을 묻혀 닦아 설치하기 전에 건조.
    4. 주의 광섬유 케이블의 양단 청소물에 적신 마이크로 화이버 천으로 사라져. 에탄올에 적신 천으로 절차를 반복합니다.
  2. 카트리지 어셈블리.
    1. 패키지에서 새로운 중립 모세관 (50 μm의 내경)를 제거합니다.
    2. 테이프 워크 벤치에 모세관 보호 튜브의 한쪽 끝을 아래로. , 풀다 똑바로 튜브에서 모세관을 당기십시오.
    3. 워크 벤치에 테이프 나 종이 스틱 다음과 같이 측정 마크를 추가 길이 검출기 (30cm), 출구 단부에 모세관 창 (0.2 cm) 길이 (10cm) (즉, 40.2 cm 전체 길이에, 30.0 cm 유효 길이).
    4. 참조 논문에서 0.2 cm 측정 마크 모세관 창을 맞 춥니 다. 테이프로 모세관을 수정하고 모세관이 측정 마크 외부 2mm를 종료 표시합니다.
    5. 클 리빙 돌의 평면 가장자리를 사용하여 하나의 직선 운동에 모세관 입구 끝 부분에있는 보호 캡 (창에서 최종 먼)를 잘라.
      1. 모세관 내부 코팅에 영구적 인 손상을 방지하기 위해 물이 가득 덮인 보편적 인 유리 병에 모세관 끝을 담가. 이 절차를 모세관 말단 이상 1 분 동안 대기에 노출 될 때마다 반복한다.
    6. 카트리지의 출구 측에 모세관 입구 끝을 삽입합니다.
    7. 밀어 모세관 창 카트리지 창을 중심으로 될 때까지 필요에 따라 카트리지를 통해 모세관을 당기십시오.
    8. 카트리지 창에 구멍 플러그 (100 μm의 X 200 μm의)를 삽입합니다.
      주 : 빛의 화이트 소스에 노출되면 흰색 빛이 창을 통해 전달되었는지 확인합니다. 통과하는 광은 갈색 외관이 경우, 필요에 따라 조정한다.
    9. (순서대로 양단에 사전 설치된 튜브 너트, 페룰 및 O 링 포함) 40.2 cm의 총 모세관 길이에 대한 미리 형성된 냉매 배관에 모세관을 삽입합니다.
    10. coolan을 통해 모세 혈관을 눌러모세관이 관의 다른면에 나타날 때까지 필요한 t 튜브.
    11. 카트리지의 출구 측에 냉각수 튜브의 끝을 삽입하고 튜브 너트를 조이십시오.
    12. 카트리지의 입구 측에 모세관 입구 단부를 삽입한다.
    13. 밀고 모세관 카트리지의 입구 측에 나타날 때까지 필요에 따라 카트리지를 통해 모세관을 당긴다.
    14. 카트리지의 입구 측에 냉각수 튜브의 끝을 삽입하고 튜브 너트를 조이십시오.
    15. 클 리빙 돌의 평면 가장자리를 사용하여 하나의 직선 운동에 모세관 출구 단부 (창에서 가까운 끝 부분)에서 보호 캡을 잘라.
    16. 모세관 끝 부분을 통해 밀봉 고정 클립을 삽입하고 위치에 고정하는 키를 누릅니다. 시각적으로 모세관이 종료 검사합니다. 그들도없는 경우, 절차를 반복한다.
    17. 워크 벤치의 가장자리에 모세관 길이 템플릿을 놓습니다.
    18. AG를 아래로 향하게하여 카트리지를 배치모세관 길이 템플릿을 ainst과 모세관 템플릿의 참조 라인으로 끝 맞 춥니 다. 모세관 계측 마크 (3.2.4 참조) 기준선과 정렬되지 않는 경우, 필요에 따라 조정한다.
    19. 모세관 길이, 모세관에 대해 템플릿을 잡고 템플릿 기준선 아래 절단 돌 2mm의 세척 에지 사용 모세관의 양쪽 끝을 절단.
    20. 시각적으로 모세관은 돋보기로 끝나는 검사합니다. 모세관 말단이 평활하지 않은 경우, 클 리빙 스톤의 부드러운면을 사용하여 윤기.
    21. O 링 삽입 도구를 사용하여 개구부 플러그 구멍에 개구 O 링을 삽입한다.
    22. 유리 병에 삽입 모세관 끝 즉시 케이스에 카트리지 케이스와 장소 카트리지에 물이 가득 덮인 보편적 인 튜브를 설치합니다. 단기 및 장기 저장에 2-8 ℃에서 보관.
  3. 버퍼 트레이의 제조.
    1. 작성하고 출장 UNIVERS를 배치버퍼 입구에서 알 튜브 및 배출 트레이 (그림 1). 샘플 수에 따라 레인 2, 3, 4 및 5의 반복 바이알 위치가 매 6 샘플 주입 하나 차선 배치 분석한다.
      주 : 누설 전류를 방지하기 위해 캡 바이알 습윤 피한다.

그림 1
그림 1 : 위치 및 버퍼 입구와 출구 트레이에 보편적 인 유리 병의 레벨을 입력합니다. 수준을 채우기 : 1/1 = 1400 μL, 3/4 = 1300 μL 1/2 = 1000 μL를. 요약 : W = 물, 염산은 0.1 M 염산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. CE 시스템 구성 요소 어셈블리.
    1. 자외선 검출기를 설치합니다.
    2. 개방 레버를 설치인터페이스 블록에 최대 눌러.
    3. 광섬유 케이블을 설치한다. 양쪽 끝을 잡고 시계 방향으로 회전 클램프 표시 줄에 해당 끝을 삽입합니다. 자외선 검출기 다른 쪽 끝을 연결합니다.
      참고 : 그 파괴의 원인이 굴곡 때문에이 절차를 수행하는 동안주의 광섬유 케이블을 처리합니다.
    4. 장소 샘플과 샘플 유지 시스템에 버퍼 트레이 및 위치에 걸립니다.
    5. 양단의 클램프 바가하면서 손잡이를 조여, 상기 인터페이스 블록으로 모세관 카트리지 놓고.

4. 악기 방법 셋업

  1. 전압, 최대 : 다음 매개 변수를 표 1에있어서, 상기 조절을 만들고 실행 및 종료 악기 방법 30.0 kV의; 현재, 최대 : 300.0 μA; 카트리지 온도 : 20.0 ° C; 샘플 보관 온도 : 10.0 ° C; UV 검출기 초기 조건 : 파장 : 214 nm 인; 데이터 속도 : 4 Hz에서; 필터 : 일반; 피크 폭 () 포인트 : 16-25; 흡광도 신호 : 직접.
    참고 : 데이터 수집 속도는 좁은 분리 영역의 커버리지를 향상시키기 위해서는 25 Hz로까지 증가시킬 수있다.
<TD> 물 아울렛 유리 병
컨디셔닝 방법 시간 프로그램
시간 (분) 행사 지속 입구 유리 병 아울렛 유리 병 개요 댓글
- 린스 - 압력 2068 밀리바 1.0 분 BI : C1 BO : C1 앞으로 염산 0.1 M
- 린스 - 압력 2068 밀리바 2.0 분 BI : B1 BO : C1 앞으로
- 린스 - 압력 2068 밀리바 10.0 분 BI : E1 BO : C1 앞으로 BGE
0.00 별도 - 전압 15.0 KV 10.0 분 BI : D1 BO : D1 0.17 최소 램프, 정상 극성 갈라진
10.00 린스 - 압력 2758 밀리바 10.0 분 BI : E1 BO : C1 앞으로 BGE
20.01 기다림 - 0.0 분 BI : A1 BO : A1 - 린스 팁
방법 시간 프로그램을 실행
시간 (분) 행사 지속 입구 유리 병 개요 댓글
- 린스 - 압력 2068 밀리바 1.0 분 BI : C1 BO : C1 앞으로, 인 / 아웃 유리 병 INC (6) 염산 0.1 M
- 린스 - 압력 2068 밀리바 2.0 분 BI : B1 BO : C1 앞으로, 인 / 아웃 유리 병 INC (6)
- 린스 - 압력 2068 밀리바 4.0 분 BI : E1 BO : C1 앞으로, 인 / 아웃 유리 병 INC (6) BGE
- 주입 - 압력 34 밀리바 20.0 초 SI : A1 BO : B1 앞으로, 재정의 샘플 주입
- 기다림 - 0.4 분 BI : A1 악: A1 / 아웃 유리 병 INC (6) 워시 팁
0 별도 - 전압 15.0 KV 30.0 분 BI : D1 BO : D1 0.17 최소 램프, 정상 극성 인 / 아웃 유리 병 INC (6) 샘플 분리
0.5 자동 영점 조정 - - - - - -
30.01 데이터를 중지 - - - - - -
30.02 린스 - 압력 2068 밀리바 2.0 분 BI : B1 BO : C1 앞으로, 인 / 아웃 유리 병 INC (6)
32.03 기다림 - 0.0 분 BI : A1 BO : A1 / 아웃 유리 병 INC (6) 린스 팁
32.04 종료 - - - - - 종료
종료 방법 시간 프로그램
시간 (분) 행사 지속 입구 유리 병 아울렛 유리 병 개요 댓글
- 린스 - 압력 2068 밀리바 1.0 분 BI : E6 BO : E6 앞으로 염산 0.1 M
- 린스 - 압력 2068 밀리바 6.0 분 BI : F6 BO : F6 앞으로
- 램프 - 오프 - - - - - -
- 기다림 - 0.0 분 BI : A1 BO : A1 - 린스 팁

표 1 : 컨디셔닝, 실행 및 종료 시간 프로그램.

5. 데이터 수집 및 처리

  1. 샘플 세트를 프로그램.
    1. 컨디셔닝기구 방법을 사용하여 컨디셔닝 모세관 프로그램. 모세관가 처음 사용되는 경우, 네 개의 반복 과정; 그렇지 않으면 조절 방법의 두 반복 프로그램.
    2. 주행 계기 방법을 이용하여 분석 될 시료 프로그램.
    3. 셧다운기구 방법을 이용하여 저장을 위해 모세관 프로그램 섹션 3.2.22에 나타낸 절차를 반복한다.
  2. 실험을 실행합니다.
  3. electropherograms를 내 보냅니다.
  4. 마이그레이션 시간과 기본 주 (A)의 함유율을 계산electropherogram 프로필의 수직 드롭 라인 통합을 사용하여 차 산성 이성체.

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Representative Results

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도 2는 200 mM의 EACA, 30mm의 리튬 아세테이트의 전형적인 전류 프로파일을 도시 트리스 완충액 (50 mM의, pH를 8.0)로 희석 한 항 - TNFα 단클론 항체 샘플을 사용하여 pH 4.8 BGE. 관찰 될 수있는 바와 같이, 전류는 분석에 걸쳐 안정하고 30 내지 35 μA의 값 사이에서 발진 할 수있다. 검출 된 피크가 히스타민 내부 표준에 대응한다 그림 3은 빈 샘플의 CZE의 electropherogram을 보여줍니다. 3.7 ~ 4.1 분의 이동 시간을 갖고 히스타민 예상된다. 그림 4 항 TNFα 단클론 항체의 CZE의 electropherogram을 보여줍니다. 언급 될 수있는 바와 같이, 주 피크는 선행 작은 강도의 피크를 따른다. 분리가 (양에서 음 예) 정상 극성 하에서 수행되기 때문에, 분석의 기본 이성체 (단클론 항체는 양전하 변종) 빠른 마이그레이션 산성 이성체를 (단클론 음전하 변종) 알 주요 이소 형보다 느린 마이그레이션.

그림 2
그림 2 : 일반적인 CZE 실행의 전기 현재 프로필. 단클론 항체 샘플을 트리스 완충액 (50 mM의, pH를 8.0)으로 희석 될 때 BGE 전류를 30 μA 주위 안정하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 빈 샘플의 CZE의 electropherogram. 더 피크가 히스타민 내부 표준의 차별화 감지되지 않습니다. AU 흡광도 단위 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1 "> :"유지 - together.within 페이지 = FO "십t 그림 4
그림 4 : CZE에 의해 결정 항 TNFα 단클론 항체의 물리 화학적 이질성. 이 샘플은 기본 주 및 산성 이성체로 구성되어있다. 삽입은 CZE에 의해 해결 변형의 확대보기를 보여줍니다. AU 흡광도 단위 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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실시 CZE가 성공 확률을 높이기 위해 모노클로 날 항체 분석 할 때이 튜토리얼에서, 우리는 적절한 방법의 중요성을 강조 표시합니다. CZE가 일상적으로 사용하는 경우에는, 문제가 필연적으로 발생한다 (12).

최상의 결과를 얻으려면, 그들이 극복하고 어려운 단계 문제를 해결하는 분석가 도움이 될 것 같은 프로토콜을 통해 포함 된주의 사항을 따르는 것이 중요합니다. 주어진 조건에 최적의 해상도를 얻기 위해 중요한 고려 BGE 용액의 정확한 제제이다. 이 프로세스는 완충제, 비 버퍼링 첨가제의 pH 농도의 이온 강도 엄격하게 제어 데 필요하다. 전반적으로, CE 시스템은 세부 사항에 관심과주의가 필요합니다. 시스템 청소 또는 어셈블리에 관한 단계를 무시할 경우 그것은 쉽게 손상 될 수 있습니다.

본 방법은 중성 모세관의 사용을 고려한다. 베어 융합 실리카 모세관 달리중성 모세관 따라서 분리 효율, 정확성 및 재현성을 향상 9 모세관 내벽 상 단백질 흡착을 감소시킨다. 그러나, 그 사용이 수행 될 수있는 주사의 양에 의해 제한된다. 우리의 경험에서, 120 내지 150 주사 인해 내부 코팅의 점진적 저하 해상도에 영향없이 수행 될 수있다. 모세관이 한계에 도달하면, 새로운 모세 혈관이 필요합니다.

다른 프로토콜 permanently- 동적 코팅 모세관 (13, 14)의 사용을 포함 CZE 의한 모노클로 날 항체의 물리 이질성 분석에보고되었다. 그러나, 이들 연구는 모노클로 날 항체의 넓은 다양성을 분석 조건의 고정 된 세트의 적용을 제안한다. 기존의 방법과는 대조적으로, 우리는 최적의 성능은 단지 실험 조건을 조정하여 달성 될 수 있다고 믿는다. 예를 들어, 여기에 제시된 프로토콜이 사용되었으며, 조정과거 다른 네 개의 서로 다른 단클론 항체의 이소 형의 이질성 및 단클론 항체 단편 (10)를 분석합니다. 다른 모노클로 날 항체를 평가하기 위해,이 프로토콜에 적응하기 위해, 우리는 변형 다양성과 분자의 등전점에 따라 BGE 이온 강도 및 pH를 변조 분석 할 것을 권장합니다.

이 기술을 마스터 한 후 추가 단계는 방법의 성능 평가를 포함해야한다. 이러한 선택성 (이동 시간 및 면적 백분율의 상대 표준 편차 환산) 재현성 등의 파라미터는 상기 방법은 사용 목적에 적합 함을 확인하기 위해 테스트되어야한다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glacial acetic acid Tecsiquim AT0035-7
ACS grade hydrochloric acid J.T. Baker 9535-05
Histamine dihydrochloride Fluka 53300
(Hydroxypropyl) methyl cellulose  Fluka 09963
Lithium acetate Sigma-Aldrich 517992
6-Aminocaproic acid Sigma-Aldrich A2504
eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,  pH 8 Beckman Coulter 477427
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System Beckman Coulter A66528
eCAP Neutral capillary  Beckman Coulter 477441
Vial, Micro, 200 µl Beckman Coulter 144709
Universal Vial Caps Beckman Coulter A62250
Universal Vials Beckman Coulter A62251
Cable, Optics, UV/Vis Beckman Coulter 144093
UV/Vis Detector Module Beckman Coulter 144733
Cartridge Assembly Kit, Blank Beckman Coulter 144738

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References

  1. Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases. Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).
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중립 모세관을 사용하여 단일 클론 항체 동종의 모세관 전기 영동 분리
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Cite this Article

Espinosa-de la Garza, C. E., Salazar-Flores, R. D., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary. J. Vis. Exp. (119), e55082, doi:10.3791/55082 (2017).More

Espinosa-de la Garza, C. E., Salazar-Flores, R. D., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary. J. Vis. Exp. (119), e55082, doi:10.3791/55082 (2017).

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