Summary
Метастазы в головной мозг становится актуальной неудовлетворенная медицинская потребность в его заболеваемость увеличилась в то время как терапевтические возможности остаются полумерой. Создание экспериментальных животных моделях метастазов в головной мозг через intracarotid артериальной инъекции раковых клеток облегчает механистические исследования биологии болезни и оценки новых схем вмешательства.
Abstract
Метастазы, распространение и рост злокачественных клеток на вторичных сайтах в организме пациента, составляет> 90%, связанной с раком смертности. В последнее время впечатляющие достижения в области новых методов лечения значительно увеличивает выживаемость и улучшить качество жизни многих больных раком. К сожалению, частота мозговых метастатических рецидивов быстро растет, и все современные методы лечения являются лишь полумерой. Следовательно, хорошие экспериментальные модели на животных крайне необходимы для облегчения углубленного исследования биологии заболевания и оценить новые терапевтические схемы для доклинической оценки. Тем не менее, стандарт в естественных условиях анализа метастазирования через инъекции в хвостовую вену раковых клеток производит преимущественно метастатических поражений легких; животные, как правило, поддаются бремя опухоли легкого, прежде чем какой-либо значимой разрастание метастазов в головной мозг. Внутриутробная инъекции опухолевых клеток производит метастатических поражений на нескольких сайтах органов, включая мозг; Тем не менее, variabiмируемости опухолевого роста производства этой модели является большой, смачивая его полезность при оценке терапевтической эффективности. Для создания надежных и верных животных моделей для изучения мозга метастазов, здесь мы опишем процедуру получения экспериментальных метастазов в головной мозг в домовой мыши (Mus Musculus) с помощью intracarotid инъекции опухолевых клеток. Такой подход позволяет производить большое количество мозга мышей метастазирования подшипников с аналогичными роста и смертности характеристик, способствуя тем самым научно-исследовательскую работу по изучению основных биологических механизмов, а также для оценки новых терапевтических агентов.
Introduction
Метастазирование рака центральной нервной системы (ЦНС) является разрушительной болезни, и может включать в себя либо паренхимы мозга или лептоменинкс ( "метастазы в головной мозг" относится как в этой статье). Это является преобладающим внутричерепное злокачественности, превосходящими первичные глиомы на> 10: 1 1, 2. Рак легких, рак молочной железы и меланома являются главными три основных опухолевые заболевания , которые производят высокие числа случаев метастазы в головной мозг 3, 4. В последние годы впечатляющие достижения в области новых методов лечения рака значительно увеличивает выживаемость и улучшить качество жизни многих больных раком. Однако, после рецидива, частота метастазов в головной мозг быстро растет. Например, антитело трастузумаб против HER2 (Герцептин) продемонстрировал значительную клиническую эффективность у больных с HER2 + рак молочной железы; тем не менее тревожная тенденция возниклау этих больных: до 1/3 тех , чьи экстракраниально системное заболевание первоначально пользу от лечения трастузумаб позже развиваются метастазы в головной мозг 5, 6, 7. К сожалению, у пациентов с метастазами в головной мозг резистентны практически все современные методы лечения, как правило , испытывают травматический ухудшение качества жизни, и их однолетнее выживание после установления диагноза составляет лишь ~ 20% 8. Современные методы лечения метастазов в головной мозг (включая стероиды, краниальной радиотерапии и хирургической резекции у отдельных больных) являются лишь паллиативный, а не лечебный 9. Таким образом, метастазы в головной мозг развивается как очередной внушительной вызов в эту эру новых методов лечения рака. Для решения этой проблемы неудовлетворенную пациенты сталкиваются каждый день в клинике, нам срочно необходимо, чтобы лучше понять основной механизм метастазов в головной мозг и использовать эти знания для разработки новых методов лечения.
Здесь мы опишем процедуры для получения экспериментальных метастазов в головной мозг через инъекции раковых клеток в общей сонной артерии. Мы использовали этот подход рассекать вклад отдельных генов »к метастатического каскада метастазов в головной мозг и оценить эффективность терапевтического вмешательстваs 12, 13. Основные преимущества такого подхода являются высокая степень воспроизводимости и низкой степенью изменчивости; основным недостатком является сложность и ловкость, необходимые для выполнения микрохирургии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Все исследования на животных были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных (IACUC) из Университета Техаса MD Anderson Cancer Center мимо.
1. Подготовьте раковые клетки для инъекций
- Семенной раковые клетки один или два дня до инъекции. Используйте DMEM / F12, дополненной 10% FBS, если специальность среда не указывается в литературе для конкретной клеточной линии.
- В день хирургической операции, урожай клеток, когда они достигают 70 - 80% сплошности, сначала промыванием не содержащей сыворотки среде один раз перед обработкой трипсином (0,25%) в течение 1 - 2 мин при 37 ° С. Добавить в клетки 10% FBS, содержащей DMEM / F12 СМИ, чтобы погасить 0,25% трипсина.
- Центрифуга клетки при 80 × г в течение 3 мин. Промыть клеток в не содержащей сыворотки среде в два раза , чтобы удалить остатки сыворотки, подсчета клеток с помощью гемоцитометра и повторно приостанавливать в Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) в 1 - 5 × 10 6 клеток / мл, в зависимости от клеточной линии. Держите на льдудо момента инъекции.
Примечание: MDA-MB-231 клетки рака молочной железы и клеток меланомы K1735 были использованы в этом исследовании, и обе клеточные линии были использованы при 2 × 10 6 клеток / мл концентрации. Держите продолжительность трипсином как можно короче, как могут повлиять избыточного лечения результаты анализов метастазирования.
2. Подготовка мышей для опухолевых клеток для инъекций
- Обезболить мышей путем внутрибрюшинного (IP) инъекции кетамина / ксилазина коктейль (кетамина 100 мг / кг, ксилазин 10 мг / кг).
- Подтверждение полной анестезии, зажимая животных ноги и наблюдать отсутствие ответа.
- Поместите курсор на стеклянную пластину (используется для литья белковых гелей), и закрепите резинкой.
- При необходимости, удалить волосы шеи после бритья или нанести небольшое количество продукта для удаления волос и вытирая волосы с бумажным полотенцем. Примечание: При использовании голых мышах, пропустите этот шаг, поскольку они не имеют волос на теле.
- Очистите кожу шеи, применяяповидон-йода и 70% спирта.
- Поместите мышь на сцене рассекает микроскопом
- Сделайте надрез в коже ~ 1 см длиной, с хирургическим скальпелем.
- Попросту рассекают мышцы с зубчатыми щипцами, чтобы выставить сонную артерию под ним.
- Отделить сонной артерии от соседнего блуждающего нерва с хирургическим пинцетом.
- С помощью хирургических щипцов, отделить некоторые из хлопка ватный шарик, смочите, и мода в меньший ватный шарик. Поместите этот буфер увлажненная ватный тампон под сонной артерии предполагаемого места инъекции.
- Поместите шовный дальняя и ближняя к ватным тампоном и сделать выпадающие сучки. Затянуть проксимальный узел, чтобы блокировать поток крови в месте инъекции.
- Перейдите к инъекции раковых клеток, если сонной артерии на ватный шарик появляется полностью под давлением со свежей красной крови.
3. Cancer Cell Инъекция в сонной артерии
- Vortex и рисовать 100 мкл Oраковые клетки F в шприц.
- Под микроскопом рассекает, медленно вставьте 31 G иглу (со скосом вверх) в просвет сонной артерии, сидящего на верхней части ватным тампоном.
- Медленно вводят клетки из шприца в сонную артерию. Успешное инъекции можно наблюдать под микроскопом с помощью изменяющегося цвета близлежащих кровеносных сосудов и мускулатуры, когда буферизованные раковые клетки выталкиваются в обращение.
- При инъекции всего объема завершена, поднимите дистального сонной артерии осторожно, чтобы предотвратить срыгивание.
- Быстро затянуть дистальный узел для завершения процесса впрыска.
- После завершения инъекции, затяните лигатуры и обрезать излишки шелковой нити с микро-ножницами под рассекает микроскопом. Попятитесь отделенного мышцы, чтобы покрыть участок раны. Закройте кожу с двумя скрепками.
4. Хирургическое восстановление
- Переместить обслуживаемое животное на грелкудля восстановления. Это может занять 30 - 60 мин для животных, чтобы прийти в сознание. В то же время, управлять бупренорфин (0,05 мг / кг) с помощью подкожной инъекции в качестве послеоперационной аналгезии. Примечание: Обезболивание должна быть предоставлена в соответствии с местным IACUC утвержденным протоколом.
- После того, как животные, пробуждать и возобновить их нормальное поведение, вернуть мышей их местоположения жилья. Обеспечить мышей с гелем пищи в течение нескольких дней после операции. Поддерживать хирургическую запись и держать его в комнате.
5. Неинвазивная В Vivo изображений
- Для клеток , меченных люциферазы конструкций, измерить эффективность инъекции раковых клеток с использованием в системе визуализации естественных условиях 14.
Примечание: формирования изображения не выполняется в день инъекции, чтобы избежать чрезмерного напряжения на подопытных животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Есть две точки, в которых качество инъекций может быть оценена. Первый шанс наблюдением оператора изменения цвета кровеносных сосудов во время инъекции. Утечка из бедных инъекций можно легко наблюдать под микроскопом рассекает. Стабильное и безопасное размещение корпуса мыши (Фигура 1А) , и его сонную артерию (Фигура 1В) на опорной ватным тампоном являются критическими факторами для гладкой и успешной инъекции в сонную артерию. Вторая точка для оценки качества инъекции является послеоперационный неинвазивной визуализации. Для этой цели, раковые клетки , как правило , метят люциферазы экс виво перед инъекцией. Чтобы свести к минимуму нагрузку на животных, в естественных изображений обычно выполняется 24 ч после инъекции. Успешный результат инъекций в сильной внутричерепного раковых клеток нагрузки и головы мыши является единственным регионом с положительным сignals (Рисунок 2А).
Использование в естественных условиях системы визуализации для отслеживания люциферазы меченных раковых клеток, мы наблюдаем начальное снижение интенсивности сигнала в течение нескольких дней после инъекции; тем не менее, раковые клетки , способные аксонов в ЦНС в конечном итоге удалось разделить и производить увеличение в системе формирования изображения сигналов в организме , как метастазы в головной мозг развиваются (Фигура 2В). Intracarotid инъекции обычно производит последовательны в системе сигналов естественных изображений с относительно низкой изменчивости, которая является одним из основных преимуществ использования этого подхода для получения экспериментальных метастазов в головной мозг. Поскольку растущие повреждения опухоли вытесняют тканях мозга, качество здоровья для животных с быстро прогрессирующей метастазами в головной мозг может быстро ухудшаться, отражая клинические проявления пациентов метастазы в головной мозг человека. Типичные симптоматическое поведение, указывающие на значительное присутствие метастазов в головной мозг включают потерювес, сгорбленная поза, и непрестанное кружение. На экспериментальной конечной точке, мозг животных могут быть извлечены для изучения биохимических параметров или для гистологического исследования. Для меланотический метастазирование повреждения (Рисунок 3A) За исключением случаев , как правило , трудно отличить поражение опухоли от окружающих тканях мозга до начала гистологической оценки (фиг.3В). В таких случаях рекомендуется маркировать опухолевых клеток с флуоресцентным репортером (например , GFP) для удобства выделения метастатических клеток (рис 3C). В качестве альтернативы, весь мозг может быть диссоциированы на отдельные клетки и опухолевые клетки, разделенных магнитными бортовыми-конъюгированные антитела.
Рисунок 1: Подготовка к инъекции сонной артерии. А) под наркозом мышь помещают на стеклянную пластину и крепится с помощью руBBER полосы. Сайт и длина разреза обозначена черной линией на шее. Б) После того, как все подготовительные хирургические шаги завершены, обнаженный сонной артерии помещают для поддержки на твердую ватный шарик, готовый к инъекции раковых клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: неинвазивный мониторинг за метастазы в головной мозг вырост. А) Модифицированные MDA-MB-231 рака молочной железы клетки метили люциферазы гена экс виво. Начиная от инъекций 24 ч после сонной артерии, развитие мозга метастазов контролировали неинвазивным путем повторного в системе визуализации естественных изображений (масштаб бар = 50 мм). Б) Количественная в естественных условиях системы визуализации IMAрежимных данных указывает на первоначальное снижение инъекции после сонной артерии бремя опухоли, с последующим экспоненциальным разрастание метастазов в головной мозг животного до moribundity. Столбики ошибок отражают стандартную ошибку среднего (SEM) от общего люминесцентного сигнала. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Сбор мозга Метастазы Поражения. A) K1735 клетки меланомы производят меланотический метастазы в головной мозг повреждения в сингенных мозга мыши С3Н, что значительно облегчает разделение мозга метастатических поражений от окружающей стромы , но ограничивается определенными моделями с меланомой. Б) диссоциированных клеток опухоли молочной железы из трансгенного MMTV- Neu / Pten -null мыши производит откровенное метастазы в головной мозг AFтер имплантации посредством инъекции сонной артерии. Маржа опухоль / стромы трудно отличить, несмотря на очевидное наличие метастатических поражений кровеносных сосудов. C) , MDA-MB-231 клетки рака молочной железы предварительно меченных с зеленым флуоресцентным белком (GFP) репортера экс виво для облегчения экстракции метастазы в головной мозг поражений с помощью хирургической резекции или сортировки клеток. Следует отметить, что большинство метастатических очагов сосредоточены на той же стороне мозга, где инъекции сонных артерий происходит. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важные шаги для успешного сонных артерий инъекции раковых клеток являются: 1) глубокой анестезии мыши в процессе подготовки к хирургической операции; 2) устойчивое расположение сонной артерии на верхней части опоры хлопка; 3) плотно перевязки сонной артерии после успешной инъекции.
Глубокая анестезия ~ 30 мин, как правило, необходимо для устойчивого хирургического исполнения под рассекает микроскопом. Мы используем все коммерчески готовый к употреблению кетамин / ксилазин коктейль для наркоза мыши. Для того, чтобы избежать возможных передозировке кетамин / ксилазин коктейль может быть разбавлена 1: 1 или 1: 2, в физиологическом растворе, чтобы обеспечить большую гибкость при регулировке громкости, используемый для анестезии. В качестве альтернативы, неконтролируемое tribromoethanol препарат также может быть использован в качестве анестезирующего средства; Тем не менее, мы обнаружили, что склонность tribromoethanol разлагать делает вещество менее надежным в качестве эффективного анестетика, чем кетамин / ксилазина коктейль.
устойчиво размещены и надутого сонной артерии значительно облегчает инъекции раковых клеток; Поэтому, мы настоятельно рекомендуем проводить время, чтобы тщательно подготовить положение артерии под микроскопом, а не продолжением инъекции при неоптимальных условиях.
Чем больше клеток рака поселят в сосудистую сеть на стороне инъекции сонных артерий. Иногда значительная часть метастатических клеток может мигрировать в другую сторону головного мозга таким образом, что оба полушария по всей видимости, несут значительное количество метастатических очагов в умирающих животных.
Метастатического поражения могут появляться в любом паренхимы или лептоменинкс ЦНС, или в обоих местах. Там , как представляется, уникальные опухолевые-микросреда взаимодействий, лежащих в основе этих биологических фенотипов 15. Поэтому, когда новая клеточная линия должна быть проверена на ее способность производить экспериментальные метастазы в головной мозг, это necessичных обратить особое внимание на такие фенотипы.
Внутренние и внешние сонные артерии снабжают кровью в паренхиму мозга и лептоменинкс соответственно. Соответственно, осаждение клеток опухоли в паренхиму или лептоменинкс может быть достигнуто путем незначительной модификации этого протокола. Для того, чтобы позволить клеткам только к лептоменинкс, внутреннюю сонную артерию может быть лигирован с помощью шовного материала до инъекции опухолевых клеток, таким образом, направляя клетки в наружную сонную артерию; с другой стороны, перевязки наружной сонной артерии перед инъекцией позволит запись клетки только во внутреннюю сонную артерию и паренхиму мозга.
В целом, intracarotid инъекции подход дает данные о более высокой воспроизводимости и низкой изменчивости по сравнению с хвостовой вены или внутрисердечных инъекций; она также позволяет избежать инъекционного индуцированных воспаление ЦНС по сравнению с прямым внутримозгового методом впрыска. Следовательно, этот подход является в настоящее время наиболееценным в количественных исследованиях метастазов в головной мозг, которые стремятся к образованию значительных статистических выводов с использованием ограниченного числа животных. В то же время все экспериментальные модели имеют ограничения. Подобно другим способам введения гематогенному опухолевых клеток, то intracarotid инъекции резюмирует только позже шаги в метастаз каскада после распространения раковых клеток в кровоток. Таким образом, это не является подходящей моделью для исследования, например, биологические факторы, определяющие распространение первичных раковых клеток в кровоток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution | Sigma-Aldrich | K113 | |
| Routine Stereomicroscope Leica M50 | Leica | M50 | The microscope is modular and highly configurable to fit particular space requirements. |
| Surgical disposable scapel | Integra Miltex | 4-410 | to make skin incisions |
| Tissue Forceps - 1 x 2 Teeth | Fine Science Tools | 11021-12 | to bluntly dissect mucles |
| Dumont #5 - Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | to separate and prepare the carotid artery for injection |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | to cut sutures |
| EZ Clip Kit | Stoelting | 59020 | for wound cloure |
| BD Insulin Syringe | Becton Dickinson | 328438 | for cell injection |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 |
References
- Gavrilovic, I. T., Posner, J. B. Brain metastases: epidemiology and pathophysiology. J Neurooncol. 75 (1), 5-14 (2005).
- Patchell, R. A. The management of brain metastases. Cancer Treat Rev. 29 (6), 533-540 (2003).
- Barnholtz-Sloan, J. S., et al. Incidence proportions of brain metastases in patients diagnosed (1973 to 2001) in the Metropolitan Detroit Cancer Surveillance System. J Clin Oncol. 22 (14), 2865-2872 (2004).
- Schouten, L. J., Rutten, J., Huveneers, H. A., Twijnstra, A. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94 (10), 2698-2705 (2002).
- Bendell, J. C., et al. Central nervous system metastases in women who receive trastuzumab-based therapy for metastatic breast carcinoma. Cancer. 97 (12), 2972-2977 (2003).
- Clayton, A. J., et al. Incidence of cerebral metastases in patients treated with trastuzumab for metastatic breast cancer. Br J Cancer. 91 (4), 639-643 (2004).
- Romond, E. H., et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med. 353 (16), 1673-1684 (2005).
- Mayer, M. A patient perspective on brain metastases in breast cancer. Clin Cancer Res. 13 (6), 1623-1624 (2007).
- Lin, N. U., Bellon, J. R., Winer, E. P. CNS metastases in breast cancer. J Clin Oncol. 22 (17), 3608-3617 (2004).
- Zhang, C., Yu, D. Microenvironment determinants of brain metastasis of brain metastasis. Cell Biosci. 1 (1), 8 (2011).
- Fidler, I. J., Nicolson, G. L. Organ selectivity for implantation survival and growth of B16 melanoma variant tumor lines. J Natl Cancer Inst. 57 (5), 1199-1202 (1976).
- Zhang, L., et al. Microenvironment-induced PTEN loss by exosomal microRNA primes brain metastasis outgrowth. Nature. 527 (7576), 100-104 (2015).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Cancer Res. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Zhang, C., Zhang, F., Tsan, R., Fidler, I. J. Transforming growth factor-beta2 is a molecular determinant for site-specific melanoma metastasis in the brain. Cancer Res. 69 (3), 828-835 (2009).
