Summary
Metastaser i hjärnan har blivit ett akut medicinskt behov som dess förekomst har ökat medan behandlingsalternativ har förblivit palliativ. Skapa experimentella djurmodeller för hjärnmetastaser via intracarotid arteriell injektion av cancerceller underlättar mekanistiska studier av sjukdomen biologi och utvärdering av nya interventions regimer.
Abstract
Metastas, spridning och tillväxt av maligna celler vid sekundära ställen inom en patients kropp, står för> 90% av cancerrelaterad dödlighet. Nyligen har imponerande framsteg i nya terapier dramatiskt förlängd överlevnad och förbättrad livskvalitet för många cancerpatienter. Tyvärr är förekomsten av hjärnmetastaserande återfall snabbt stigande, och alla nuvarande behandlingar är endast palliativ. Därför är goda experimentella djurmodeller akut behov för att underlätta en fördjupning av sjukdomen biologi och bedöma nya terapeutiska regimer för preklinisk utvärdering. Emellertid standard in vivo metastasering assay via injektion i svansvenen av cancerceller producerar övervägande lungmetastatiska lesioner; djur brukar falla för lungtumörbördan innan någon meningsfull utväxt av metastaser i hjärnan. Intrakardiell injektion av tumörceller producerar metastaser till flera platser organ inklusive hjärnan; emellertid variability av tumörtillväxt som produceras med denna modell är stor, vilket dämpar dess användbarhet vid utvärdering av terapeutisk effektivitet. För att generera tillförlitliga och konsekventa djurmodeller för hjärnmetastaser studie, här beskriver vi ett förfarande för framställning av experimentella metastaser i hjärnan i husmusen (Mus musculus) via intracarotid injektion av tumörceller. Detta tillvägagångssätt gör att man kan producera stora antal hjärnmetastaser bärande möss med liknande tillväxt och dödlighet egenskaper, vilket underlättar forskningsinsatser för att studera grundläggande biologiska mekanismer och bedöma nya terapeutiska medel.
Introduction
Metastasen av cancer till det centrala nervsystemet (CNS) är en förödande sjukdom, och kan involvera antingen hjärnparenkymet eller de leptomeninges ( "metastaser i hjärnan" avser både i denna artikel). Det är den dominerande intrakraniell malignitet outnumbering primära gliom med> 10: 1 1, 2. Lungcancer, bröstcancer och melanom är de tre stora neoplastiska sjukdomar som producerar höga förekomsten av metastaser i hjärnan 3, 4. Under de senaste åren, har imponerande framsteg i nya cancerterapier dramatiskt förlängd överlevnad och förbättrad livskvalitet för många cancerpatienter. Men vid återfall, är förekomsten av metastaser i hjärnan ökar snabbt. Exempelvis har anti-HER2 antikropp trastuzumab (Herceptin) visade signifikant klinisk effekt hos patienter med HER2 + bröstcancer; ännu en oroande trend har vuxit framhos dessa patienter: upp till 1/3 av dem vars extrakraniell systemisk sjukdom initialt gynnades av trastuzumab behandling senare utveckla metastaser i hjärnan 5, 6, 7. Tyvärr patienter med metastaser i hjärnan är okänsliga för nästan alla nuvarande behandlingar, vanligtvis upplever en traumatisk försämring av livskvaliteten, och deras ettåriga överlevnad efter diagnos är endast ~ 20% 8. Nuvarande terapier för metastaser i hjärnan (inklusive steroider, hjärn strålbehandling och kirurgisk resektion i utvalda patienter) är bara palliativ inte botande 9. Därför är metastaser i hjärnan utvecklas till nästa imponerande utmaning i denna tid av nya cancerbehandlingar. Att ta itu med otillfredsställda utmaningen patienter möter varje dag på kliniken, vi snarast behöver för att bättre förstå den bakomliggande mekanismen av metastaser i hjärnan och använda denna kunskap för att utveckla nya behandlingsmetoder.
Här beskriver vi förfaranden för att producera experimentella metastaser i hjärnan via injektion av cancerceller in i den gemensamma halsartären. Vi har använt denna metod för att dissekera enskilda gener bidrag till metastaserande kaskad av metastaser i hjärnan och för att utvärdera effekten av terapeutisk interventions 12, 13. De stora fördelarna med denna metod är den höga graden av reproducerbarhet och låg grad av variabilitet; den stora nackdelen är den sofistikerade och fingerfärdighet krävs för att utföra mikrokirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Alla djurstudier har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Förbered cancerceller för injektion
- Seed cancercellerna en eller två dagar före injektion. Använda DMEM / F12-medium kompletterat med 10% FBS, såvida en specialitet mediet anges i litteraturen för en särskild cellinje.
- På dagen för kirurgiskt ingrepp, skörd celler när de når 70-80% sammanflytning genom att först tvätta med serumfritt medium en gång innan trypsinisering (0,25%) för 1 - 2 min vid 37 ° C. Lägg i cellerna 10% FBS-innehållande DMEM / F12 media för att släcka 0,25% trypsin.
- Centrifugera cellerna vid 80 x g under 3 min. Tvätta celler i serumfritt medium två gånger för att avlägsna kvarvarande serum, räkna cellerna med en hemocytometer och återsuspendera i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) på 1 - 5 x 10 6 celler / ml, beroende på cellinjen. Håll på isförrän vid injektion.
OBS: MDA-MB-231-bröstcancerceller och K1735-melanomceller användes i denna studie, och båda cellinjer användes vid 2 x 10 6 celler / ml koncentration. Håll trypsinization varaktighet så kort som möjligt eftersom överbehandling kan påverka resultaten av metastaser analyser.
2. Förbered Möss för tumörcellinjektion
- Söva möss genom intraperitoneal (ip) injektion av ketamin / xylazin cocktail (ketamin 100 mg / kg, xylazin 10 mg / kg).
- Bekräfta fullständig anestesi genom att klämma djur fötter och observera bristande respons.
- Placera musen på en glasskiva (används för att gjuta protein geler) och fäst med gummiband.
- Om det behövs, ta bort hår i nacken genom rakning eller tillämpa en liten mängd hårborttagning produkt och torka håret av med hushållspapper. OBS: Om du använder nakna möss, hoppa över detta steg eftersom de inte har kroppshår.
- Rengör nackskinnet genom att applicerapovidon-jod och 70% alkohol.
- Placera musen på scenen av dissektionsmikroskop
- Gör ett snitt i huden ~ 1 cm lång med en kirurgisk skalpell.
- Rakt på sak dissekera muskeln med tandade pincett för att exponera halspulsådern under.
- Separera karotidartären från den intilliggande vagusnerven med kirurgisk tång.
- Med hjälp av kirurgiska pincett, separera en del bomull från en bomullstuss, fukta och mode i en mindre bomullstuss. Placera denna buffert-återfuktad bomullstuss under halspulsådern avsedda injektionsstället.
- Placera en sutur distal och proximal till bomullstuss och göra lösa knutar. Dra åt den proximala knut för att blockera blodflödet in i injektionsstället.
- Fortsätt till cancer cell injektion om halspulsådern på bomullstuss visas fullt tryck med färskt rött blod.
3. Cancer Cell Injektion i Carotid Artery
- Vortex och rita 100 ^ of cancerceller in i sprutan.
- Enligt dissekera mikroskop, långsamt in 31 G-nål (med avfasning upp) in i lumen av halspulsådern sitter ovanpå bomullstuss.
- Långsamt injicera celler från sprutan i halspulsådern. Lyckad injektion kan observeras under mikroskop genom att ändra färgen på närliggande blodkärl och muskulatur när buffrade cancerceller skjuts in i cirkulationen.
- När injektion av hela volymen är klar, lyfter den distala halspulsådern försiktigt för att förhindra uppstötningar.
- Snabbt dra den distala knut att slutföra insprutningsprocessen.
- Efter avslutad injektion, dra åt ligaturer och trimma överskottet siden sutur med mikro-sax under dissekera mikroskop. Flytta tillbaka den separerade muskeln att täcka sårstället. Stänga huden med två häftklamrar.
4. Kirurgisk Recovery
- Flytta drivs djur på en värmedynaför återvinning. Det kan ta 30-60 minuter för djuren att återfå medvetandet. Under tiden, administrera buprenorfin (0,05 mg / kg) via subkutan injektion som post-kirurgisk analgesi. Notera: Analgesi bör tillhandahållas i enlighet med den lokala IACUC godkänt protokoll.
- När djuren vakna och återuppta sitt normala beteende, åter möss till sin bostadsort. Ge möss med gel mat i flera dagar efter operationen. Upprätthålla en kirurgisk rekord och hålla den i rummet.
5. Icke-invasiv in vivo-avbildning
- För celler märkta med luciferas reporterkonstruktioner, mäta cancercellinjektion effektivitet med hjälp av in vivo imaging systemet 14.
OBS: Imaging utförs inte på dagen för injektion för att undvika överdriven stress försöksdjur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det finns två punkter vid vilken kan utvärderas kvaliteten på injektion. Den första chans är av operatörens observation av förändrade blodkärls färger under injektion. Läckage från fattiga injektioner lätt kan observeras under dissektionsmikroskop. Den stadiga och säker placering av den mus-kroppen (Figur 1A) och dess halsartären (Figur 1B) på stödbomullstuss är kritiska faktorer för smidig och framgångsrik injektion i halspulsådern. Den andra punkten för att utvärdera injektionskvalitet är post-kirurgisk icke-invasiv avbildning. För detta ändamål, är cancercellerna typiskt märkt med en luciferas reporter ex vivo före injektion. För att minimera stress på djuren, in vivo imaging utförs vanligtvis 24 h efter injektion. En lyckad injektion resulterar i stark intrakraniell cancercell belastning, och musen huvudet är den enda regionen med positiva signals (Figur 2A).
Använda in vivo imaging system för att spåra luciferas-märkta cancerceller, observerar vi en initial nedgång av signalintensiteten inom några dagar efter injektion; men cancerceller kan utväxt i CNS hantera så småningom att dela sig och producera ökande in vivo signaler avbildningssystem som hjärnmetastaser utveckla (Figur 2B). Intracarotid injektion ger vanligen konsekvent in vivo imaging systemsignaler med relativt låg variabilitet, vilket är en stor fördel med att använda denna metod för att producera experimentella metastaser i hjärnan. Som växande tumörlesioner förskjuta hjärnvävnader, kan kvaliteten på hälsan för djur med snabbt framåt metastaser i hjärnan försämras snabbt, spegling den kliniska manifestationen av metastaser i hjärnan patienter mänskliga. Typiska symptom beteenden som tyder på betydande närvaro av hjärnmetastaser är förlust avvikt, krökt kroppshållning, och oupphörliga cirklande. Vid den experimentella slutpunkt, kan djuret hjärnor extraheras för undersökning av biokemiska parametrar eller för histologiska undersökningar. Med undantag för melanotiska metastas lesioner (figur 3A), är det oftast svårt att skilja tumören lesionen från omgivande hjärnvävnad före histologisk utvärdering (Figur 3B). I sådana fall är det tillrådligt att märka tumörceller med en fluorescerande reporter (t ex GFP) för att underlätta för att isolera metastatiska celler (Figur 3C). Alternativt kan hela hjärnan kan dissocieras till enskilda celler och tumörceller åtskilda av magnetisk pärla-konjugerade antikroppar.
Figur 1: Förberedelse för halspulsådern injektion. A) Den sövda musen placeras på en glasplatta och säkras med rubber band. Platsen och längden av snittet är märkt med en svart linje på halsen. B) Efter att alla förberedande kirurgiska steg är klar, är den exponerade halspulsådern placeras stöd på en fast bomullstuss, redo för cancer cellinjektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Icke-invasiv övervakning av metastaser i hjärnan utväxt. A) Modifierade MDA-MB-231-bröstcancerceller märktes med luciferasreportergenen ex vivo. Från och med 24 timmar efter halspulsådern injektion var metastaser i hjärnan utveckling övervakas icke-invasivt genom upprepad in vivo imaging system för bildbehandling (skala bar = 50 mm). B) Kvantifiering av in vivo imaging systemet imaging data tyder på en initial nedgång av tumörbörda efter halspulsådern injektion, följt av exponentiell utväxt av metastaser i hjärnan tills djur moribundity. Felstaplar spegla standardfelet för medelvärdet (SEM) av den totala luminiscensen signalen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Skörde metastaser i hjärnan skador. A) K1735 melanomceller producerar melanotiska metastaser i hjärnan skador i syngena C3H mushjärna, vilket avsevärt underlättar separationen av hjärnan metastaser från den omgivande stroma men är begränsat till vissa melanommodeller. B) Dissocierade brösttumörceller från den transgena MMTV- Neu / PTEN -null mus producerar öppen metastaser i hjärnan after implantering via karotidartären injektion. Tumören / stroma marginalen är svårt att skilja trots den uppenbara närvaron av angiogena metastatiska lesioner. C) MDA-MB-231-bröstcancerceller var pre-märkt med ett grönt fluorescerande protein (GFP) reporter ex vivo för att underlätta extraktion av metastaser i hjärnan lesioner via kirurgisk resektion eller cellsortering. Notera att de flesta av de metastatiska lesioner är koncentrerade på samma sida av hjärnan där karotid arteriell injektion sker. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiska stegen för framgångsrik karotid arteriell injektion av cancerceller är: 1) djup anestesi av mus som förberedelse för kirurgisk operation; 2) stadig placering av halsartären på toppen av stöd bomull; 3) tät ligering av halspulsådern efter lyckad injektion.
Djup anestesi av ~ 30 minuter är oftast nödvändigt för jämn kirurgisk prestanda under dissekera mikroskop. Vi använder kommersiellt redo att använda ketamin / xylazin cocktail för mus anestesi. För att undvika potentiella överdos kan ketamin / xylazin cocktail spädas 1: 1 eller 1: 2 i fysiologisk saltlösning för att ge mer flexibilitet i att justera volymen används för anestesi. Alternativt kan icke-kontrollerad läkemedels tribromoethanol också användas som anestetikum; dock har vi funnit att benägenheten hos tribromoethanol att bryta ned gör ämnet mindre tillförlitliga som ett effektivt anestetikum än ketamin / xylazin cocktail.
enstadigt placerade och fullt tryck halspulsådern underlättar i hög grad injektion av cancerceller; Därför rekommenderar vi att tillbringa tid att noggrant förbereda läget i artären under mikroskop istället för att fortsätta med injektion under suboptimala förhållanden.
Fler cancerceller kommer att lämna inom kärl på sidan av hals arteriell injektion. Ibland kan en betydande del av de metastatiska celler kan migrera till den andra sidan av hjärnan, så att båda halvkloten förefaller bära betydande mängd av metastatiska lesioner i döende djur.
Metastatiska lesioner kan förekomma i antingen parenkymet eller de leptomeninges i CNS, eller på båda platserna. Det verkar finnas unika tumörmikro interaktioner som ligger bakom dessa biologiska fenotyper 15. Därför, när en ny cellinje skall testas med avseende på sin förmåga att producera experimentella metastaser i hjärnan, är det necessari att ägna särskild uppmärksamhet åt sådana fenotyper.
De interna och externa halspulsåder levererar blod till hjärnan parenkym och leptomeninges respektive. Således kan tumörcellavsättning i parenkymet eller leptomeninges uppnås genom lätt modifiering av detta protokoll. För att tillåta celler endast i leptomeninges kan den interna halspulsådern ligeras med en sutur före injektion av tumörceller, och därigenom styra celler i den yttre halspulsådern, å andra sidan kommer ligering av yttre hals före injektion tillåta celler artikel enbart in i den inre halspulsådern och hjärnans parenkym.
Sammantaget ger intracarotid injektion metod uppgifter av högre reproducerbarhet och lägre variabilitet jämfört med svansvenen eller intrakardiella injektioner; Det undviker också injektion-inducerad CNS inflammation jämfört med direkt intracerebral injektionsmetoden. Därför är detta tillvägagångssätt för närvarande den mestvärdefulla i kvantitativa studier av metastaser i hjärnan som syftar till att generera betydande statistiska slutsatser genom att använda ett begränsat antal djur. Samtidigt, alla experimentmodeller har begränsningar. I likhet med andra metoder för hematogen tumörcells introduktion, intracarotid injektion rekapitulerar endast senare steg i metastas kaskaden efter cancercellspridning i cirkulationen. Det är alltså inte en lämplig modell för att studera, till exempel, de biologiska faktorer som bestämmer spridningen av primära cancerceller in i blodomloppet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution | Sigma-Aldrich | K113 | |
| Routine Stereomicroscope Leica M50 | Leica | M50 | The microscope is modular and highly configurable to fit particular space requirements. |
| Surgical disposable scapel | Integra Miltex | 4-410 | to make skin incisions |
| Tissue Forceps - 1 x 2 Teeth | Fine Science Tools | 11021-12 | to bluntly dissect mucles |
| Dumont #5 - Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | to separate and prepare the carotid artery for injection |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | to cut sutures |
| EZ Clip Kit | Stoelting | 59020 | for wound cloure |
| BD Insulin Syringe | Becton Dickinson | 328438 | for cell injection |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 |
References
- Gavrilovic, I. T., Posner, J. B. Brain metastases: epidemiology and pathophysiology. J Neurooncol. 75 (1), 5-14 (2005).
- Patchell, R. A. The management of brain metastases. Cancer Treat Rev. 29 (6), 533-540 (2003).
- Barnholtz-Sloan, J. S., et al. Incidence proportions of brain metastases in patients diagnosed (1973 to 2001) in the Metropolitan Detroit Cancer Surveillance System. J Clin Oncol. 22 (14), 2865-2872 (2004).
- Schouten, L. J., Rutten, J., Huveneers, H. A., Twijnstra, A. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94 (10), 2698-2705 (2002).
- Bendell, J. C., et al. Central nervous system metastases in women who receive trastuzumab-based therapy for metastatic breast carcinoma. Cancer. 97 (12), 2972-2977 (2003).
- Clayton, A. J., et al. Incidence of cerebral metastases in patients treated with trastuzumab for metastatic breast cancer. Br J Cancer. 91 (4), 639-643 (2004).
- Romond, E. H., et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med. 353 (16), 1673-1684 (2005).
- Mayer, M. A patient perspective on brain metastases in breast cancer. Clin Cancer Res. 13 (6), 1623-1624 (2007).
- Lin, N. U., Bellon, J. R., Winer, E. P. CNS metastases in breast cancer. J Clin Oncol. 22 (17), 3608-3617 (2004).
- Zhang, C., Yu, D. Microenvironment determinants of brain metastasis of brain metastasis. Cell Biosci. 1 (1), 8 (2011).
- Fidler, I. J., Nicolson, G. L. Organ selectivity for implantation survival and growth of B16 melanoma variant tumor lines. J Natl Cancer Inst. 57 (5), 1199-1202 (1976).
- Zhang, L., et al. Microenvironment-induced PTEN loss by exosomal microRNA primes brain metastasis outgrowth. Nature. 527 (7576), 100-104 (2015).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Cancer Res. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Zhang, C., Zhang, F., Tsan, R., Fidler, I. J. Transforming growth factor-beta2 is a molecular determinant for site-specific melanoma metastasis in the brain. Cancer Res. 69 (3), 828-835 (2009).
