Summary
Hjernemetastaser har blitt et presserende udekket medisinsk behov som sin forekomsten har økt mens behandlingsalternativene har vært palliativ. Opprette eksperimentelle dyremodeller av hjernemetastaser via intracarotid arteriell injeksjon av kreftceller forenkler mekanistiske studier av sykdommen biologi og evaluering av nye intervensjons regimer.
Abstract
Metastaser, spredning og vekst av ondartede celler i sekundære områder innenfor en pasientens kropp, utgjør> 90% av kreftrelatert dødelighet. Nylig har imponerende fremskritt i nye behandlingsformer dramatisk forlenget overlevelse og økt livskvalitet for mange kreftpasienter. Dessverre er forekomsten av hjernemetastatisk tilbakefall raskt stigende, og alle aktuelle behandlingsformer er bare palliativ. Derfor er gode eksperimentelle dyremodeller sterkt behov for å legge til rette for grundige studier av sykdommen biologi og for å vurdere nye terapeutiske regimer for preklinisk evaluering. Men den standard in vivo-metastase-analyse via haleveneinjeksjon av kreftceller produserer hovedsakelig lungemetastatiske lesjoner; dyrene vanligvis bukke til lungetumorbyrde før noen meningsfull utvekst av hjernemetastaser. Intrakardial injeksjon av tumorceller produserer metastaselesjoner til flere organ områder, inkludert hjernen; imidlertid variabiheten av tumorvekst produsert med denne modellen er stor, dempe sin nytteverdi i å vurdere terapeutisk effekt. For å generere pålitelige og konsistente dyremodeller for hjernemetastaser studie, her beskriver vi en prosedyre for å produsere eksperimentell hjernemetastaser i huset mus (Mus musculus) via intracarotid injeksjon av tumorceller. Denne tilnærmingen gjør det mulig å produsere store antall hjernemetastaser bærende mus med liknende vekst og dødelighet egenskaper, og dermed tilrettelegge for forskningsinnsatsen for å studere grunnleggende biologiske mekanismer og for å vurdere nye terapeutiske midler.
Introduction
Metastasen av kreft i det sentrale nervesystem (CNS) er en ødeleggende sykdom, og kan innebære enten hjernen parenchyma eller leptomeninges ( "hjernemetastaser" refererer til både i denne artikkelen). Det er den dominerende intrakranielle malignitet, outnumbering primære hjernesvulst etter> 10: 1 1, 2. Lungekreft, brystkreft, og melanom er de tre store neoplastiske sykdommer som gir høy forekomst av hjernemetastaser tre, fire. I de senere årene har imponerende fremskritt i romanen kreftbehandling dramatisk forlenget overlevelse og økt livskvalitet for mange kreftpasienter. Men ved gjentakelse, er forekomsten av hjernemetastaser stiger raskt. For eksempel har den anti-HER2-antistoff trastuzumab (Herceptin) viste signifikant klinisk effekt hos pasienter med HER2 + brystkreft; likevel en urovekkende trend har dukket opphos disse pasientene: inntil 1/3 av dem som ekstrakraniell systemisk sykdom i utgangspunktet dratt nytte av trastuzumab behandling senere utvikle hjernemetastaser 5, 6, 7. Dessverre, pasienter med hjernemetastaser er ildfaste til nesten alle nåværende behandlinger, vanligvis opplever en traumatisk forverring av livskvalitet, og deres ett-års overlevelse etter diagnose er bare ~ 20% 8. Eksisterende behandling for hjernemetastaser (inkludert steroider, kranie strålebehandling og kirurgisk fjerning av selekterte pasienter) er bare smertestillende ikke kurativ 9. Derfor er hjernemetastaser fremstår som den neste imponerende utfordring i denne epoken av nye kreftbehandlingen. For å løse udekkede utfordringen pasienter møter hver dag i klinikken, må vi raskt å bedre forstå den underliggende mekanismen av hjernemetastaser og bruke denne kunnskapen til å utvikle nye behandlingsformer.
Her beskriver vi fremgangsmåtene for å fremstille forsøkshjernemetastaser via injeksjons av kreftceller i arteria carotis communis. Vi har brukt denne tilnærmingen til å dissekere bidrag individuelle gener 'til metastatisk kaskade av hjernemetastaser og for å evaluere effekten av terapeutisk intervensjons 12, 13. Hovedfordelene ved denne tilnærmingen er den høye grad av reproduserbarhet og lav grad av variasjon; Den store ulempen er raffinement og dyktighet som kreves for å utføre mikrokirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Alle dyrestudier ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av The University of Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Forbered kreftceller til injeksjon
- Seed kreftcellene en eller to dager før injeksjon. Bruk DMEM / F12 medium supplert med 10% FBS, med mindre en spesialitet medium er angitt i litteraturen for en spesiell cellelinje.
- På dagen for kirurgisk operasjon, høste cellene når de nå 70 - 80% konfluens ved først å vaske med serumfritt medium en gang før trypsinering (0,25%) i 1 - 2 minutter ved 37 ° C. Legg inn i cellene 10% FBS holdig DMEM / F12 media for å slukke 0,25% trypsin.
- Sentrifuger cellene ved 80 x g i 3 min. Vask cellene i serumfritt medium to ganger for å fjerne gjenværende serum, telle cellene med et hemocytometer og re-suspen i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) ved 1 - 5 x 10 6 celler / ml, avhengig av cellelinjen. Hold på istil injeksjonstidspunktet.
MERK: MDA-MB-231 brystkreftceller og K1735 melanomceller ble anvendt i denne studien, og begge cellelinjer ble brukt ved 2 x 10 6 celler / ml konsentrasjon. Hold trypsinering varigheten så kort som mulig som overbehandling kan påvirke utfallet av metastase analyser.
2. Forbered Mus for Tumor Cell Injection
- Bedøve mus ved intraperitoneal (ip) injeksjon av ketamin / xylazin cocktail (ketamin 100 mg / kg, xylazin 10 mg / kg).
- Bekreft komplett anestesi ved å klemme dyret føtter og observere mangelen på respons.
- Plasser musen på en glassplate (brukes for støping proteingeler), og fest med gummistrikk.
- Hvis det er nødvendig, fjerne hår fra nakken ved å barbere eller bruke en liten mengde hår fjerning av produktet og tørke håret av med papirhåndkle. MERK: Hvis du bruker nakne mus, hoppe over dette trinnet som de ikke har hår på kroppen.
- Rengjør halsen huden ved å brukepovidon-jod og 70% alkohol.
- Plassere mus på stadiet av disseksjonsmikroskop
- Lag et snitt i huden ~ 1 cm lang med en kirurgisk skalpell.
- Rett ut dissekere muskelen med tann pinsett for å avsløre halspulsåren under.
- Separer den halsarterie fra den tilstøtende vagusnerven med kirurgisk tang.
- Ved hjelp av kirurgisk pinsett, skiller noen bomull fra en bomullsdott, fukt og mote til en mindre bomullsdott. Plasser denne buffer fuktet bomullsdott på undersiden av halspulsåren for tiltenkt injeksjonsstedet.
- Plasser en sutur fjernt og nært til bomullsdott og gjøre løse knop. Stram proksimale knute for å blokkere blodstrømmen inn i injeksjonsstedet.
- Fortsett til kreftcelle injeksjon hvis halspulsåren på bomullsdott vises fullt trykk med friskt rødt blod.
3. Cancer Cell Injeksjon i arteria carotis
- Vortex og trekke 100 ul of kreftceller i sprøyten.
- Under dissekere mikroskop, settes 31 G nål (med skråkant opp) inn i lumen av halspulsåren som sitter på toppen av bomullsdott.
- Sakte injisere cellene fra sprøyten inn i halspulsåren. Vellykket injeksjon kan observeres under mikroskop ved å endre fargen av nærliggende blodkar og muskulatur når bufrede kreftceller blir skjøvet inn i sirkulasjonen.
- Når injeksjon av hele volumet er ferdig, løftes den ytre halsarterie forsiktig for å forhindre oppgulping.
- Raskt å stramme den distale knute for å fullføre injeksjonsprosessen.
- Etter endt injeksjon, stramme ligaturer og trim overflødig silke sutur med mikro-saks under dissekere mikroskop. Flytt tilbake den separerte muskler til å dekke såret. Lukk huden med to stifter.
4. Kirurgisk Recovery
- Flytt operert dyret på en varmeputefor utvinning. Det kan ta 30 - 60 min for dyrene å gjenvinne bevissthet. I mellomtiden, administrere buprenorfin (0,05 mg / kg) via subkutan injeksjon som post-kirurgisk analgesi. Merk: Smertelindring bør gis i henhold til din lokale IACUC godkjent protokoll.
- Når dyrene vekke og gjenoppta sin normale oppførsel, returnere musene til deres bolig plassering. Gi mus med gel mat i flere dager etter operasjonen. Opprettholde et kirurgisk posten og holde den i rommet.
5. Ikke-invasiv in vivo avbildning
- For celler merket med luciferaserapportørplasmid konstruksjoner, måle kreftcelle injeksjon effektivitet ved hjelp av in vivo imaging system 14.
MERK: Imaging utføres ikke på dagen for injeksjon for å unngå overdreven stress til forsøksdyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er to punkter hvor kvaliteten av injeksjonen kan evalueres. Den første sjansen er av operatøren observasjon av skiftende blodkar farger under injeksjon. Lekkasje fra fattige injeksjoner kan lett observeres under dissekere mikroskop. Den jevne og sikker plassering av musen legemet (figur 1 A) og dens karotidarterie (figur 1B) på bærebomullsdott er kritiske faktorer for jevn og vellykket injeksjon i halspulsåren. Det andre punktet å vurdere injeksjons kvaliteten er post-kirurgisk non-invasiv bildediagnostikk. For dette formål blir de kreftceller vanligvis merket med en luciferase reporter ex vivo før injeksjon. For å minimere belastningen på dyrene, in vivo avbildning er vanligvis utført 24 timer etter injeksjon. En vellykket injeksjon resulterer i sterk hjernekreftcelle belastning, og musen hodet er den eneste regionen med positive signals (Figur 2A).
Ved hjelp av in vivo bildesystem for å spore luciferase-merkede kreftceller, observerer vi en initial nedgang av signalintensiteten i løpet av dager etter injeksjon; ennå, kreftceller som kan utvekst i CNS til slutt klarer å dele seg og produsere økende in vivo imaging system signalene som hjernemetastaser utvikle (figur 2B). Intracarotid injeksjon gir vanligvis konsistent in vivo avbildningssystemsignaler med relativt lav variabilitet, noe som er en stor fordel ved å bruke denne fremgangsmåten til å fremstille forsøkshjernemetastaser. Som voksende tumorlesjoner fortrenge hjernevev, kan kvaliteten på helse for dyr med rask framdrift hjernemetastaser forringes raskt, speiling den kliniske manifestasjon av menneskelig hjernemetastaser pasienter. Typiske symptomatisk atferd som indikerer betydelig tilstedeværelse av hjernemetastaser inkluderer tap avvekt, krum holdning, og uopphørlig sirkle. Ved den eksperimentelle endepunktet, kan de dyr hjernen hentes ut for undersøkelse av biokjemiske parametere eller for histologiske undersøkelser. Med unntak av melanotiske metastase lesjoner (figur 3A), er det vanligvis vanskelig å skille tumorlesjon fra omkringliggende vev i hjernen før histologisk evaluering (figur 3B). I slike tilfeller er det anbefalt å merke tumorceller med et fluorescerende reporter (f.eks GFP) for bekvemmeligheten av å isolere metastatiske celler (Figur 3C). Alternativt kan hele hjernen blir dissosiert til enkeltceller og tumorceller separert av magnetiske kule-konjugerte antistoffer.
Figur 1: Forberedelse til halspulsåren injeksjon. A) bedøvet mus ble plassert på en glassplate og sikret med rubber band. Området og lengden av snittet er merket med en sort linje på halsen. B) Etter at alle forberedende kirurgiske trinnene er fullført, blir utsatt halspulsåren plassert for støtte på en fast bomullsdott, klar for kreftcelle injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Non-invasiv monitorering for hjernemetastaser utvekst. A) Modifiserte MDA-MB-231 brystcancerceller ble merket med luciferase reportergen ex vivo. Starter fra 24 timer etter halspulsåren injeksjon, ble hjernemetastaser utvikling overvåkes non-invasiv ved gjentatt in vivo imaging system imaging (skala bar = 50 mm). B) Kvantifisering av in vivo imaging system imaging data indikerer en innledende nedgang på tumorbyrden post-halspulsåren injeksjon, etterfulgt av eksponentiell utvekst av hjernemetastaser til dyr moribundity. Feilstolper reflektere standardfeil av middelverdien (SEM) av den totale luminescens signal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Høsting hjernemetastaser lesjoner. A) K1735 melanomceller produserer melanotiske hjernemetastaser lesjoner i syngeniske C3H mus hjernen, noe som i stor grad forenkler separasjonen av hjernemetastatiske lesjoner fra den omkringliggende stroma, men er begrenset til visse melanom modeller. B) dissosiert brystsvulstceller fra transgene MMTV- Neu / PTEN -null mus produserer overt hjernemetastaser after implantasjon via arteria carotis injeksjon. Svulsten / stroma margin er vanskelig å skille tross for åpenbare tilstedeværelse av angiogene metastatiske lesjoner. C) MDA-MB-231 brystcancerceller ble pre-merket med en grønn fluorescerende protein (GFP) reporter ex vivo for å lette uttrekking av hjernemetastaser lesjoner via kirurgisk reseksjon eller cellesortering. Legg merke til at de fleste av de metastatiske lesjoner er konsentrert på samme side av hjernen hvor halspulsåren injeksjon finner sted. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trinn for vellykket hals arteriell injeksjon av kreftceller er: 1) dyp anestesi av mus i forberedelse for kirurgisk operasjon; 2) stabil plassering av halspulsåren på toppen av bomull støtte; 3) stramt ligering av arteria carotis etter vellykket injeksjon.
Deep anestesi på ~ 30 min er vanligvis nødvendig for jevn kirurgisk ytelse under dissekere mikroskop. Vi bruker kommersielt klar til bruk ketamin / xylazin cocktail for mus anestesi. For å unngå potensiell overdosering kan ketamin / xylazin cocktail bli fortynnet 1: 1 eller 1: 2 i fysiologisk saltvann for å tilveiebringe mer fleksibilitet i å justere volumet som brukes for anestesi. Alternativt kan ikke-kontrollert medikament tribromoethanol også anvendes som anestetikum; Vi har imidlertid funnet at den tilbøyelighet til å degradere tribromoethanol gjør stoffet mindre pålitelig som et effektivt bedøvelsesmiddel enn ketamin / xylazin cocktail.
ENjevnt plassert og fullt trykk karotidarterie i stor grad forenkler injisering av kreftceller; Derfor anbefaler vi å bruke tid til å nøye forberede stilling av arterien under mikroskopet i stedet for å fortsette med injeksjon under suboptimale betingelser.
Andre kreftceller vil over inne i vaskulaturen på siden av halspulsåren injeksjon. Noen ganger kan en betydelig del av de metastatiske celler kan migrere til den andre side av hjernen, slik at begge halvkuler ser ut til å bære betydelig mengde av metastatiske lesjoner i døende dyr.
Metastatiske lesjoner kan forekomme enten i parenchyma eller leptomeninges i CNS, eller på begge steder. Det synes å være unike tumor-mikromiljøet interaksjoner som ligger til grunn for disse biologiske fenotyper 15. Derfor, når en ny cellelinje som skal testes for sin evne til å produsere eksperimentell hjernemetastaser, er det nødvenAry å være spesielt oppmerksom på slike fenotyper.
De interne og eksterne carotis arterier tilføre blod inn i hjernen parenchyma og leptomeninges, respektivt. Følgelig kan tumorcelle avsetning inn i parenchyma eller leptomeninges oppnås ved liten endring av denne protokollen. For å tillate at cellene bare i leptomeninges, kan den indre halsarterie ligeres med en sutur før injeksjon av tumorceller, for derved å dirigere celler i den ytre halsarterie; på den annen side vil ligering av den eksterne karotid før injeksjon tillate celler adgang bare til den indre karotidarterie og hjernen parenchyma.
Totalt produserer intracarotid injeksjon tilnærming data med høyere reproduserbarhet og lavere variabilitet i forhold til halevenen eller intrakardielle injeksjoner; Det unngår også sprøyte-indusert CNS inflammasjon sammenlignet med den direkte intracerebrale injeksjon metode. Derfor er denne metode for tiden den mestverdifull i kvantitative studier av hjernemetastaser som tar sikte på å generere betydelige statistiske konklusjoner ved hjelp av et begrenset antall dyr. På samme tid, er alle eksperimentelle modeller har begrensninger. I likhet med andre metoder for hematogenous tumorcelle innledningsvis intracarotid injeksjons sammenfatter bare senere trinn i den metastase kaskade etter cancercellespredning til sirkulasjonen. Det er derfor ikke et egnet modell for å studere, for eksempel, de biologiske faktorer som bestemmer utbredelsen av primære kreftceller i blodet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution | Sigma-Aldrich | K113 | |
| Routine Stereomicroscope Leica M50 | Leica | M50 | The microscope is modular and highly configurable to fit particular space requirements. |
| Surgical disposable scapel | Integra Miltex | 4-410 | to make skin incisions |
| Tissue Forceps - 1 x 2 Teeth | Fine Science Tools | 11021-12 | to bluntly dissect mucles |
| Dumont #5 - Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | to separate and prepare the carotid artery for injection |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | to cut sutures |
| EZ Clip Kit | Stoelting | 59020 | for wound cloure |
| BD Insulin Syringe | Becton Dickinson | 328438 | for cell injection |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 |
References
- Gavrilovic, I. T., Posner, J. B. Brain metastases: epidemiology and pathophysiology. J Neurooncol. 75 (1), 5-14 (2005).
- Patchell, R. A. The management of brain metastases. Cancer Treat Rev. 29 (6), 533-540 (2003).
- Barnholtz-Sloan, J. S., et al. Incidence proportions of brain metastases in patients diagnosed (1973 to 2001) in the Metropolitan Detroit Cancer Surveillance System. J Clin Oncol. 22 (14), 2865-2872 (2004).
- Schouten, L. J., Rutten, J., Huveneers, H. A., Twijnstra, A. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94 (10), 2698-2705 (2002).
- Bendell, J. C., et al. Central nervous system metastases in women who receive trastuzumab-based therapy for metastatic breast carcinoma. Cancer. 97 (12), 2972-2977 (2003).
- Clayton, A. J., et al. Incidence of cerebral metastases in patients treated with trastuzumab for metastatic breast cancer. Br J Cancer. 91 (4), 639-643 (2004).
- Romond, E. H., et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med. 353 (16), 1673-1684 (2005).
- Mayer, M. A patient perspective on brain metastases in breast cancer. Clin Cancer Res. 13 (6), 1623-1624 (2007).
- Lin, N. U., Bellon, J. R., Winer, E. P. CNS metastases in breast cancer. J Clin Oncol. 22 (17), 3608-3617 (2004).
- Zhang, C., Yu, D. Microenvironment determinants of brain metastasis of brain metastasis. Cell Biosci. 1 (1), 8 (2011).
- Fidler, I. J., Nicolson, G. L. Organ selectivity for implantation survival and growth of B16 melanoma variant tumor lines. J Natl Cancer Inst. 57 (5), 1199-1202 (1976).
- Zhang, L., et al. Microenvironment-induced PTEN loss by exosomal microRNA primes brain metastasis outgrowth. Nature. 527 (7576), 100-104 (2015).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Cancer Res. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Zhang, C., Zhang, F., Tsan, R., Fidler, I. J. Transforming growth factor-beta2 is a molecular determinant for site-specific melanoma metastasis in the brain. Cancer Res. 69 (3), 828-835 (2009).
