Summary
Brain metastaser er blevet en presserende udækket medicinsk behov, da forekomsten er steget, mens behandlingsmuligheder er forblevet palliativ. Oprettelse eksperimentelle dyremodeller for hjernemetastaser via intracarotid arteriel injektion af kræftceller letter mekanistiske undersøgelser af sygdommen biologi og evaluering af nye interven- regimer.
Abstract
Metastase, spredning og vækst af maligne celler ved sekundære steder i en patients krop, udgør> 90% af cancer-relaterede dødsfald. For nylig har imponerende fremskridt i nye behandlingsformer dramatisk forlænget overlevelse og forbedret livskvalitet for mange kræftpatienter. Desværre er forekomsten af hjernen metastatiske gentagelser hurtigt stigende, og alle nuværende terapier er blot palliative. Derfor er et presserende behov for gode eksperimentelle dyremodeller for at lette dybtgående undersøgelser af sygdommen biologi og vurdere nye terapeutiske regimer for præklinisk evaluering. Men et standard in vivo metastase assay via haleveneinjektion af cancerceller producerer overvejende lunge metastatiske læsioner; dyr normalt bukke under for lungerne tumor byrde før nogen meningsfuld udvækst af hjernemetastaser. Intrakardial injektion af tumorceller producerer metastatiske læsioner til flere organsteder herunder hjernen; imidlertid variabiheden af tumorvækst produceret med denne model er stort, afdæmpende dens anvendelighed ved at evaluere terapeutisk effektivitet. At tilvejebringe pålidelige og konsistente dyremodeller for hjernemetastaser undersøgelse her beskriver vi en fremgangsmåde til fremstilling af eksperimentelle hjernemetastaser i huset mus (Mus musculus) via intracarotid injektion af tumorceller. Denne tilgang gør det muligt at producere store antal hjernen metastase-bærende mus med lignende vækst- og dødelighed egenskaber, hvilket letter forskningsindsatsen at studere grundlæggende biologiske mekanismer og vurdere nye terapeutiske midler.
Introduction
Den metastase af kræft til centralnervesystemet (CNS) er en ødelæggende sygdom, og kan involvere enten hjerneparenkymet eller leptomeninges ( "hjernemetastaser" til både i denne artikel). Det er den fremherskende intrakraniel malignitet, outnumbering primære gliomer ved> 10: 1 1, 2. Lungecancer, brystcancer og melanom er den øverste tre store neoplastiske sygdomme, der producerer høje forekomster af hjernemetastaser 3, 4. I de senere år har imponerende fremskridt i nye kræftbehandlinger dramatisk forlænget overlevelse og forbedret livskvalitet for mange kræftpatienter. Dog ved gentagelse, forekomsten af hjernemetastaser er hastigt stigende. For eksempel har den anti-HER2 antistof trastuzumab (Herceptin) viste signifikant klinisk effekt hos patienter med HER2 + brystkræft; endnu en foruroligende tendens er opståethos disse patienter: op til 1/3 af dem, hvis extrakraniel systemisk sygdom oprindeligt nydt godt af trastuzumab behandling senere udvikle hjernemetastaser 5, 6, 7. Desværre, patienter med hjernemetastaser er refraktære over for næsten alle nuværende behandlinger, som regel oplever en traumatisk forringelse af livskvaliteten, og deres en-års overlevelse efter diagnosen er kun ~ 20% 8. Aktuelle behandlinger for hjernemetastaser (herunder steroider, kraniel strålebehandling og kirurgisk resektion i udvalgte patienter) er blot palliativ, ikke helbredende 9. Derfor er hjernen metastaser fremstår som den næste imponerende udfordring i denne tid med nye behandlinger mod kræft. For at imødekomme udækkede udfordring patienter står hver dag i klinikken, vi har hårdt brug for bedre at forstå den underliggende mekanisme af hjernemetastaser og bruge denne viden til at udvikle nye behandlingsformer.
Her beskriver vi de procedurer til frembringelse eksperimentel hjernemetastaser via injektion af cancerceller i den fælles carotidarterie. Vi har brugt denne metode til at dissekere de enkelte gener bidrag til metastatisk kaskade af hjernemetastaser og vurdere effekten af terapeutisk interventions 12, 13. De store fordele ved denne fremgangsmåde er den høje grad af reproducerbarhed og lav grad af variabilitet; den store ulempe er den sofistikerede og smidighed nødvendig for at udføre mikrokirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af The University of Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Forbered kræftceller til injektion
- Seed kræftcellerne en eller to dage før injektion. Brug DMEM / F12-medium suppleret med 10% FBS, medmindre en specialitet medium er angivet i litteraturen for en bestemt cellelinie.
- På dagen for kirurgisk operation, høst cellerne, når de nå op på 70 - med 80% sammenløb ved først at vaske med serum-frie medier en gang før trypsinbehandling (0,25%) til 1 - 2 minutter ved 37 ° C. Tilføj til celler 10% FBS-DMEM / F12-medium til standsning af 0,25% trypsin.
- Centrifuger cellerne ved 80 x g i 3 min. Vask cellerne i serumfrie medier to gange for at fjerne resterende serum, tælle cellerne med et hæmocytometer og resuspender i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ved 1 - 5 x 10 6 celler / ml, afhængigt af cellelinjen. Hold på isindtil tidspunktet for injektion.
BEMÆRK: MDA-MB-231 brystcancerceller og K1735 melanomceller blev anvendt i denne undersøgelse, og begge cellelinier blev anvendt ved 2 x 10 6 celler / ml koncentration. Hold trypsinisering varighed så kort som muligt, da overbehandling kan påvirke resultaterne af metastase analyser.
2. Forbered Mus for tumorcelleinjektion
- Bedøve musene ved intraperitoneal (ip) injektion af ketamin / xylazin cocktail (ketamin 100 mg / kg, xylazin 10 mg / kg).
- Bekræft fuldstændig anæstesi ved at knibe dyret fødder og observere manglende respons.
- Placer musen på en glasplade (bruges til støbning protein geler), og fastgør med elastikker.
- Hvis det er nødvendigt, fjerne hår på halsen ved barbering eller anvende en lille mængde af hårfjerning produkt og tørrer håret ud med køkkenrulle. BEMÆRK: Hvis du bruger nøgne mus, springe dette trin, da de ikke har hår på kroppen.
- Rens halsskindet ved at anvendepovidon-jod og 70% alkohol.
- Placer musen på stadium af dissektionsmikroskop
- Lave et snit i huden ~ 1 cm lang med en kirurgisk skalpel.
- Ligeud dissekere musklen med fortandede pincet for at blotlægge halspulsåren nedenunder.
- Adskil carotidarterien fra den tilstødende vagus nerve med kirurgiske pincet.
- Ved hjælp af kirurgiske tænger, adskille nogle bomuld fra et stykke vat, fugte og mode i en mindre stykke vat. Placer denne buffer-fugtet vat nedenunder halspulsåren for tilsigtet injektionsstedet.
- Placer en sutur distalt og proksimalt for vat og gøre løse knuder. Spænd proximale knude til at blokere blodstrømmen ind injektionsstedet.
- Fortsæt til kræftcelle injektion, hvis halspulsåren på vat vises fuldt tryk med frisk rødt blod.
3. Cancer Cell Injektion i Arteria carotis
- Vortex og trække 100 pi of cancerceller i sprøjten.
- Under dissektionsmikroskop, og indfør langsomt 31 G nål (med facet op) i lumen i halspulsåren sidder på toppen af vat.
- Injicer langsomt cellerne fra sprøjten ind i carotidarterien. Vellykket injektion kan iagttages under mikroskop ved ændre farve af nærliggende blodkar og muskulatur når pufrede cancerceller skubbes til kredsløbet.
- Når injektion af hele mængden er færdig, løftes distale halspulsåre forsigtigt for at forhindre opstød.
- Hurtigt stramme den distale knude for at fuldføre injektionsprocessen.
- Efter at have afsluttet injektionen, stramme ligaturer og trim overskydende silke sutur med mikro-saks under dissektionsmikroskop. Flytte tilbage den fraskilte muskel til at dække såret. Luk huden med to hæfteklammer.
4. Kirurgisk Recovery
- Flyt opererede dyr på en varmepudetil nyttiggørelse. Det kan tage 30-60 min for at dyrene kommer til bevidsthed. I mellemtiden administrere buprenorphin (0,05 mg / kg) via subkutan injektion som post-kirurgisk analgesi. Bemærk: Analgesi bør gives i henhold til dit lokale IACUC godkendt protokol.
- Når dyrene vågner og genoptage deres normale adfærd, returnere mus til deres bolig placering. Give mus med gel fødevarer i flere dage efter kirurgi. Opretholde en kirurgisk rekord og holde det i rummet.
5. Ikke-invasiv in vivo Imaging
- For celler mærket med luciferase reporterkonstruktioner, måle cancercelle injektion effektivitet ved anvendelse in vivo imaging system 14.
BEMÆRK: Imaging udføres ikke på dagen for injektion for at undgå overdreven stress til forsøgsdyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der er to punkter, hvor kvaliteten af injektionen kan evalueres. Den første chance er ved operatørens observation af skiftende blodkarrenes farver under injektion. Lækage fra fattige injektioner let kan observeres under dissektionsmikroskop. Den konstante og sikker placering af muse legeme (figur 1A) og dens halspulsåre (figur 1B) på den understøttende vat er kritiske faktorer for smidig og vellykket injektion i carotidarterien. Det andet punkt at evaluere injektion kvalitet er postkirurgisk ikke-invasiv billeddannelse. Til dette formål er kræftcellerne typisk mærket med en luciferase reporter ex vivo før injektion. For at minimere stress på dyrene, in vivo-billeddannelse udføres sædvanligvis 24 timer efter injektion. En vellykket injektion resulterer i stærk intrakraniel kræftcelle belastning, og musen hoved er den eneste region med positive signals (figur 2A).
Under anvendelse in vivo imaging system til at spore luciferase-mærkede cancerceller, observere vi en indledende nedgang i signalintensitet inden for få dage efter injektion; endnu, cancerceller stand udvækst i CNS vinder formår at dele sig og producere stigende in vivo imaging system signaler hjernemetastaser udvikler (figur 2B). Intracarotid injektion sædvanligvis producerer konsekvent in vivo imaging system signaler med relativt lav variabilitet, hvilket er en stor fordel ved at anvende denne fremgangsmåde for at fremstille eksperimentel hjerne metastaser. Som voksende tumor læsioner fortrænge hjernevæv, kan kvaliteten af sundhed for dyr med hurtig forløber hjernemetastaser forværres hurtigt, spejling den kliniske manifestation af menneskelige hjerne metastase patienter. Typiske symptomatiske adfærd indikerer den betydelig tilstedeværelse af hjernemetastaser omfatte tab afvægt, foroverbøjet kropsholdning, og uophørlige kredser. Ved den eksperimentelle slutpunkt, kan dyret hjerner ekstraheres til undersøgelse af biokemiske parametre eller til histologiske undersøgelser. Bortset melanotiske metastase læsioner (figur 3A), er det normalt vanskeligt at skelne tumor læsion fra omgivende hjernevæv før histologisk evaluering (figur 3B). I sådanne tilfælde anbefales det at mærke tumorceller med et fluorescerende reporter (f.eks GFP) til hjælp for isolering metastatiske celler (figur 3C). Alternativt kan hele hjernen dissocieres i enkeltceller og tumorceller adskilt af magnetiske perler konjugeret antistoffer.
Figur 1: Forberedelse til carotidarterie injektion. A) Den bedøvede mus anbringes på en glasplade og sikret med rubber bands. Stedet og længden af snittet er mærket med en sort streg på halsen. B) Efter alle forberedende kirurgiske trin er afsluttet, er den udsatte halspulsåre placeret for støtte på et fast stykke vat, klar til kræftcellen injektion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Ikke-invasiv overvågning af hjernemetastaser udvækst. A) Modificerede MDA-MB-231 brystcancerceller blev mærket med luciferasereportergen ex vivo. Startende fra 24 timer efter carotidarterie injektion blev hjernemetastaser udvikling overvåges ikke-invasivt ved gentagen in vivo imaging system imaging (skala bar = 50 mm). B) Kvantificering af in vivo imaging system imaging data indikerer en indledende fald i tumorbyrde post-halspulsåre injektion, efterfulgt af eksponentiel udvækst af hjernemetastaser indtil dyr hendøen. Fejlsøjler afspejler standardfejlen af middelværdien (SEM) af den samlede luminescens signal. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Høst Brain Metastase Læsioner. A) K1735 melanomceller producere melanotiske hjernemetastaser læsioner i syngeniske C3H mus hjerne, hvilket i høj grad letter separationen af hjernens metastatiske læsioner fra det omgivende stroma men er begrænset til visse melanom modeller. B) dissocieres brysttumorceller fra det transgene MMTV- Neu / PTEN -null mus producerer åbenlys hjernemetastase AFter implantation via carotidarterie injektion. Tumoren / stroma margin er vanskeligt at skelne trods den åbenlyse tilstedeværelse af angiogene metastatiske læsioner. C) MDA-MB-231 brystcancerceller blev præ-mærket med et grønt fluorescerende protein (GFP) reporter ex vivo for at lette ekstraktion af hjernemetastaser læsioner via kirurgisk resektion eller cellesortering. Bemærk, at de fleste af de metastatiske læsioner er koncentreret på den samme side af hjernen, hvor carotis arteriel injektion finder sted. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trin til vellykket carotis arteriel injektion af cancerceller er: 1) dyb anæstesi af mus i forberedelse til kirurgisk operation; 2) stabil placering af halspulsåren oven på bomuld bærer; 3) stramt ligering af carotidarterien efter vellykket injektion.
Dyb anæstesi på ~ 30 min er normalt nødvendig for stabil kirurgisk ydeevne under dissektionsmikroskop. Vi anvender kommercielt klar til brug ketamin / xylazin cocktail for mus anæstesi. For at undgå potentiel overdosis, kan ketamin / xylazin cocktail fortyndes 1: 1 eller 1: 2 i fysiologisk saltvand for at give mere fleksibilitet til at justere lydstyrken bruges til anæstesi. Alternativt kan ikke-kontrolleret medikament tribromethanol også anvendes som bedøvelsesmiddel; har vi imidlertid fundet, at tilbøjelighed tribromethanol at nedbryde gør stoffet mindre pålidelig som en effektiv anæstetikum end ketamin / xylazin cocktail.
ENstøt placeret og fuldt tryksat carotidarterie letter i høj grad injektionen af cancerceller; Derfor anbefaler vi at bruge tid til omhyggeligt at forberede position arterien under mikroskop stedet fortsætter med injektion under suboptimale betingelser.
Flere cancerceller vil indgive i vaskulaturen på siden af carotis arteriel injektion. Nogle gange kan en betydelig del af de metastatiske celler kan migrere til den anden side af hjernen, således at begge halvkugler synes at bære en betydelig mængde af metastatiske læsioner i døende dyr.
Metastatiske læsioner kan forekomme i enten parenchym eller leptomeninges i CNS, eller begge steder. Der synes at være unikke tumor-mikromiljø interaktioner, der ligger til grund for disse biologiske fænotyper 15. Derfor, når en ny cellelinje, der skal testes for sin evne til at producere eksperimentelle hjernemetastaser, det er necessAry at være særlig opmærksom på sådanne fænotyper.
De interne og eksterne halspulsårer leverer blod til hjernen parenkym og leptomeninges hhv. Følgelig kan tumor celle aflejring i parenkym eller leptomeninges opnås ved mindre ændring af denne protokol. At tillade celler kun i leptomeninges, kan den interne carotisarterie ligeres med en sutur før injektion af tumorceller, derved dirigere celler i den eksterne carotidarterie; på den anden side vil ligering af den eksterne carotis før injektion tillade celler post kun ind i den indre carotidarterie og hjernen parenkym.
Samlet set intracarotid injektion metode producerer data af højere reproducerbarhed og lavere variabilitet sammenlignet med hale vene eller intrakardielle injektioner; det undgår også injektion-induceret CNS inflammation i forhold til den direkte intracerebral injektion metode. Derfor er denne fremgangsmåde er i øjeblikket den mestværdifulde i kvantitative undersøgelser af hjernemetastaser, der har til formål at skabe betydelige statistiske konklusioner ved hjælp af et begrænset antal dyr. Samtidig, alle eksperimentelle modeller har begrænsninger. I lighed med andre metoder for hæmatogen tumorcelle introduktion kun den intracarotid injektion rekapitulerer senere trin i metastase kaskade efter formidling kræftcelle til kredsløbet. Det er således ikke en passende model til at studere, for eksempel de biologiske faktorer, der bestemmer udbredelsen af primære kræftceller i blodbanen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution | Sigma-Aldrich | K113 | |
| Routine Stereomicroscope Leica M50 | Leica | M50 | The microscope is modular and highly configurable to fit particular space requirements. |
| Surgical disposable scapel | Integra Miltex | 4-410 | to make skin incisions |
| Tissue Forceps - 1 x 2 Teeth | Fine Science Tools | 11021-12 | to bluntly dissect mucles |
| Dumont #5 - Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | to separate and prepare the carotid artery for injection |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | to cut sutures |
| EZ Clip Kit | Stoelting | 59020 | for wound cloure |
| BD Insulin Syringe | Becton Dickinson | 328438 | for cell injection |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 |
References
- Gavrilovic, I. T., Posner, J. B. Brain metastases: epidemiology and pathophysiology. J Neurooncol. 75 (1), 5-14 (2005).
- Patchell, R. A. The management of brain metastases. Cancer Treat Rev. 29 (6), 533-540 (2003).
- Barnholtz-Sloan, J. S., et al. Incidence proportions of brain metastases in patients diagnosed (1973 to 2001) in the Metropolitan Detroit Cancer Surveillance System. J Clin Oncol. 22 (14), 2865-2872 (2004).
- Schouten, L. J., Rutten, J., Huveneers, H. A., Twijnstra, A. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94 (10), 2698-2705 (2002).
- Bendell, J. C., et al. Central nervous system metastases in women who receive trastuzumab-based therapy for metastatic breast carcinoma. Cancer. 97 (12), 2972-2977 (2003).
- Clayton, A. J., et al. Incidence of cerebral metastases in patients treated with trastuzumab for metastatic breast cancer. Br J Cancer. 91 (4), 639-643 (2004).
- Romond, E. H., et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med. 353 (16), 1673-1684 (2005).
- Mayer, M. A patient perspective on brain metastases in breast cancer. Clin Cancer Res. 13 (6), 1623-1624 (2007).
- Lin, N. U., Bellon, J. R., Winer, E. P. CNS metastases in breast cancer. J Clin Oncol. 22 (17), 3608-3617 (2004).
- Zhang, C., Yu, D. Microenvironment determinants of brain metastasis of brain metastasis. Cell Biosci. 1 (1), 8 (2011).
- Fidler, I. J., Nicolson, G. L. Organ selectivity for implantation survival and growth of B16 melanoma variant tumor lines. J Natl Cancer Inst. 57 (5), 1199-1202 (1976).
- Zhang, L., et al. Microenvironment-induced PTEN loss by exosomal microRNA primes brain metastasis outgrowth. Nature. 527 (7576), 100-104 (2015).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Cancer Res. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Zhang, C., Zhang, F., Tsan, R., Fidler, I. J. Transforming growth factor-beta2 is a molecular determinant for site-specific melanoma metastasis in the brain. Cancer Res. 69 (3), 828-835 (2009).
