Summary
métastases cérébrales est devenu un besoin médical non satisfait urgent que son incidence a augmenté tandis que les options thérapeutiques sont restés palliatifs. La création de modèles animaux expérimentaux de métastases cérébrales par injection artérielle intracarotidienne des cellules cancéreuses facilite les études mécanistiques de la biologie de la maladie et l' évaluation de nouveaux schémas d'intervention.
Abstract
Les métastases, la prolifération et la croissance des cellules malignes à des sites secondaires à l'intérieur du corps d'un patient, représente> 90% de la mortalité liée au cancer. Récemment, des progrès impressionnants dans les nouvelles thérapies ont considérablement prolongé la survie et l'amélioration de la qualité de vie de nombreux patients atteints de cancer. Malheureusement, l'incidence du cerveau récurrences métastatiques est en augmentation rapide, et toutes les thérapies actuelles ne sont que des palliatifs. Par conséquent, de bons modèles animaux expérimentaux sont nécessaires de toute urgence pour faciliter les études approfondies de la biologie de la maladie et d'évaluer de nouveaux schémas thérapeutiques pour l'évaluation préclinique. Cependant, la norme dans le dosage des métastases in vivo via une injection dans la veine caudale des cellules cancéreuses produit principalement des lésions métastasiques du poumon; animaux succombent généralement à la charge de la tumeur du poumon avant toute excroissance significative des métastases cérébrales. l'injection intracardiaque de cellules tumorales produit des lésions métastatiques à des sites multiples organes, y compris le cerveau; cependant, le variabilité de la croissance tumorale produite avec ce modèle est grand, freinant son utilité dans l'évaluation de l'efficacité thérapeutique. Pour générer des modèles animaux fiables et cohérentes pour l' étude du cerveau de métastases, ici , nous décrivons une procédure pour la production expérimentale des métastases du cerveau dans la maison de souris (Mus musculus) par injection intracarotidienne des cellules tumorales. Cette approche permet de produire un grand nombre de cerveau des souris métastase porteurs ayant des caractéristiques de croissance et de mortalité similaires, facilitant ainsi les efforts de recherche pour étudier les mécanismes biologiques de base et d'évaluer de nouveaux agents thérapeutiques.
Introduction
La métastase du cancer du système nerveux central (SNC) est une maladie dévastatrice, et peut impliquer soit le parenchyme cérébral ou les méninges ( «métastases cérébrales» désigne à la fois dans cet article). Il est la tumeur maligne intracrânienne prédominante, dépassant les gliomes primaires par> 10: 1 1, 2. Le cancer du poumon, le cancer du sein et le mélanome sont les trois principales maladies néoplasiques principales qui produisent une forte incidence de métastases cérébrales 3, 4. Au cours des dernières années, des progrès impressionnants dans de nouvelles thérapies contre le cancer ont considérablement prolongé la survie et l'amélioration de la qualité de vie de nombreux patients atteints de cancer. Cependant, lors de la récurrence, l'incidence des métastases cérébrales augmente rapidement. Par exemple, le trastuzumab anticorps anti-HER2 (Herceptin) a démontré une efficacité clinique significative chez les patients atteints HER2 cancer du sein; encore une tendance inquiétante est apparuechez ces patients: jusqu'à 1/3 de ceux dont la maladie systémique extracrânien initialement bénéficié d' un traitement de trastuzumab plus tard développer des métastases cérébrales 5, 6, 7. Malheureusement, les patients atteints de métastases cérébrales sont réfractaires à presque tous les traitements actuels, connaît généralement une détérioration traumatique de la qualité de vie et leur survie à un an après le diagnostic est seulement ~ 20% 8. Les thérapies actuelles pour des métastases cérébrales (y compris des stéroïdes, la radiothérapie crânienne, et la résection chirurgicale chez des patients sélectionnés) sont palliatifs simplement, non curatif 9. Par conséquent, des métastases cérébrales est en train de devenir le prochain imposant défi en cette ère de nouvelles thérapies contre le cancer. Pour relever le défi non satisfaits des patients sont confrontés chaque jour à la clinique, il est urgent de mieux comprendre le mécanisme sous-jacent de métastases cérébrales et utiliser ces connaissances pour développer de nouvelles thérapies.
Nous décrivons ici les procédures pour produire expérimentale des métastases cérébrales via l'injection de cellules cancéreuses dans l'artère carotide commune. Nous avons utilisé cette approche pour disséquer les contributions des gènes individuels à la cascade métastatique des métastases cérébrales et d'évaluer l'efficacité d'une intervention thérapeutiques 12, 13. Les principaux avantages de cette approche sont le degré élevé de reproductibilité et de faible degré de variabilité; l'inconvénient majeur est la sophistication et de la dextérité nécessaire pour réaliser la microchirurgie.
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Protocol
déclaration éthique: Toutes les études animales ont été approuvées par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Université du Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Préparation de cellules cancéreuses pour injection
- Ensemencer les cellules cancéreuses d'un ou deux jours avant l'injection. Utilisez DMEM / F12 supplémenté avec 10% de FBS, à moins qu'un moyen de spécialité est indiqué dans la littérature pour une lignée cellulaire particulière.
- Le jour de l'opération chirurgicale, les cellules de la récolte quand ils atteignent 70-80% de confluence par un premier lavage avec un milieu sans sérum une fois avant trypsinisation (0,25%) pendant 1 - 2 min à 37 ° C. Ajouter dans les cellules de 10% de FBS contenant du milieu DMEM / F12 pour étancher la trypsine à 0,25%.
- Centrifuger les cellules à 80 × g pendant 3 min. Laver les cellules dans un milieu sans sérum deux fois pour éliminer le sérum résiduel, compter les cellules avec un hémocytomètre et remettre en suspension dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à 1 - 5 x 10 6 cellules / ml, en fonction de la lignée cellulaire. Gardez sur la glacejusqu'au moment de l'injection.
REMARQUE: MDA-MB-231 cellules de cancer du sein et des cellules de mélanome K1735 ont été utilisés dans cette étude, et les deux lignées cellulaires ont été utilisées à 2 x 10 6 cellules / ml de concentration. Gardez la durée de trypsinisation aussi courte que possible que surtraitement peut influencer les résultats des tests de métastases.
2. Préparer les souris pour cellules tumorales Injection
- Anesthetize souris par voie intrapéritonéale (ip) injection de kétamine / xylazine cocktail (kétamine 100 mg / kg, xylazine 10 mg / kg).
- Confirmer anesthésie complète en pinçant les pieds des animaux et observer l'absence de réponse.
- Placez la souris sur une plaque de verre (utilisé pour la coulée de gels de protéines), et fixer avec des bandes de caoutchouc.
- Si nécessaire, enlever les poils du cou par le rasage ou en appliquant une petite quantité de produit d'épilation et essuyer les cheveux avec une serviette en papier. NOTE: Si vous utilisez la souris nude, sauter cette étape car ils ne possèdent pas les poils du corps.
- Nettoyer la peau du cou en appliquantpovidone-iode et 70% d'alcool.
- Placer la souris sur platine du microscope à dissection
- Faire une incision dans la peau ~ 1 cm de long avec un scalpel chirurgical.
- Carrément disséquer le muscle avec une pince à dents pour exposer l'artère carotide en dessous.
- Séparer l'artère carotide du nerf pneumogastrique adjacente avec des pinces chirurgicales.
- En utilisant des pinces chirurgicales, séparer un peu de coton à partir d'une boule de coton, humidifier, et de la mode dans une boule de coton plus petit. Placez cette boule de coton tampon humidifié sous l'artère carotide du site prévu de l'injection.
- Placez une extrémité distale de suture et à proximité de la boule de coton et faire des noeuds lâches. Serrez le noeud proximal pour bloquer le flux sanguin dans le site d'injection.
- Passez à l'injection des cellules cancéreuses si l'artère carotide sur la boule de coton apparaît totalement sous pression avec du sang rouge frais.
3. Cancer cellulaire injection dans l'artère carotide
- Vortex et d'en tirer 100 pi oles cellules cancéreuses f dans la seringue.
- Sous le microscope de dissection, insérez lentement le G aiguille 31 (avec biseau vers le haut) dans la lumière de l'artère carotide assis sur le dessus de la boule de coton.
- injecter lentement les cellules de la seringue dans l'artère carotide. injection réussie peut être observée au microscope par la couleur changeante des vaisseaux sanguins à proximité et la musculature lorsque les cellules cancéreuses tamponnées sont poussés dans la circulation.
- Lors de l'injection de la totalité du volume est terminée, lever l'artère carotide distale doucement pour éviter la régurgitation.
- serrez rapidement le noeud distal pour terminer le processus d'injection.
- Après avoir terminé l'injection, serrer les ligatures et couper la suture de soie en excès avec des micro-ciseaux sous le microscope de dissection. Reculer le muscle séparé pour couvrir le site de la plaie. Fermer la peau avec deux agrafes.
4. Récupération chirurgicale
- Déplacer l'animal opéré sur un coussin chauffantpour la récupération. Il peut prendre 30 - 60 min pour que les animaux reprennent conscience. En attendant, administrer la buprénorphine (0,05 mg / kg) par injection sous - cutanée comme l' analgésie post-chirurgicale. Remarque: L'analgésie doit être fourni en fonction de votre IACUC locale protocole approuvé.
- Une fois que les animaux se réveillent et reprennent leur comportement normal, retourner les souris à l'emplacement de leur logement. Fournir des souris avec de la nourriture de gel pendant plusieurs jours après la chirurgie. Tenir un registre chirurgical et le garder dans la chambre.
5. Non-invasive imagerie in vivo
- Pour les cellules marquées avec des constructions rapporteurs luciférase, mesurer l' efficacité des cellules cancéreuses d'injection in vivo en utilisant le système d'imagerie 14.
REMARQUE: L'imagerie est pas effectuée le jour de l'injection pour éviter des contraintes excessives aux animaux de recherche.
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Representative Results
Il y a deux points où la qualité de l'injection peut être évaluée. La première occasion est par l'observation de l'opérateur de changer les couleurs des vaisseaux sanguins lors de l'injection. Fuites d'injections pauvres peut être facilement observé sous le microscope de dissection. Le placement stable et sécurisé du corps de la souris (figure 1A) et son artère carotide (figure 1B) sur la boule de coton de soutien sont des facteurs critiques pour l' injection sans heurt et réussie dans l'artère carotide. Le deuxième point pour évaluer la qualité d'injection est post-chirurgicale imagerie non-invasive. A cet effet, les cellules cancéreuses sont habituellement marqués avec un reporter de luciférase ex vivo avant l' injection. Pour minimiser le stress sur les animaux, l'imagerie in vivo est généralement effectuée après l'injection de 24 heures. Il en résulte une injection réussie en forte charge des cellules cancéreuses intracrânienne, et la tête de la souris est la seule région avec s positifsignals (figure 2A).
Utilisation dans le système d'imagerie in vivo pour suivre les cellules cancéreuses luciférase marqué, nous observons une baisse initiale de l' intensité du signal dans les jours post-injection; cependant, les cellules cancéreuses capables d'excroissance dans le SNC finalement réussi à se diviser et produire de plus en plus des signaux du système d'imagerie in vivo comme développent des métastases cérébrales (figure 2B). Injection intracarotidienne produit habituellement cohérent dans les signaux du système d'imagerie in vivo relativement faible variabilité, ce qui est un avantage majeur de l' utilisation de cette approche expérimentale pour produire des métastases cérébrales. Comme les lésions tumorales croissance déplacent les tissus du cerveau, la qualité de la santé pour les animaux avec progression rapide des métastases cérébrales peut se détériorer rapidement, reflétant la manifestation clinique des patients porteurs de métastases cérébrales humaines. comportements symptomatiques typiques indiquant la présence significative des métastases cérébrales comprennent la perte depoids, une posture voûtée et indirecte incessante. Au point final expérimental, les cerveaux d'animaux peuvent être extraits pour l'examen des paramètres biochimiques ou pour des examens histologiques. Sauf pour les lésions métastatiques mélaniques (figure 3A), il est généralement difficile de distinguer la lésion tumorale à partir des tissus environnants du cerveau antérieur pour une évaluation histologique (figure 3B). Dans de tels cas, il est conseillé de marquer les cellules tumorales avec un rapporteur fluorescent (par exemple GFP) pour la commodité de l' isolement des cellules métastatiques (Figure 3C). En variante, la totalité du cerveau, peut être dissociée en cellules isolées et les cellules tumorales séparées par des anticorps conjugués à des billes magnétiques.
Figure 1: Préparation de l' injection de l' artère carotide. A) La souris anesthésiée est placé sur une plaque de verre et fixé avec rubandes bBER. Le site et la longueur de l'incision est marquée avec une ligne noire sur le cou. B) Une fois que toutes les étapes préparatoires chirurgicales sont terminés, l'artère carotide exposée est placée pour l' appui sur une boule de coton solide, prêt pour l' injection des cellules cancéreuses. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: la surveillance non invasive pour métastases cérébrales excroissance. A) MDA-MB-231 cellules de cancer du sein modifiées ont été marquées avec le gène rapporteur de la luciférase ex vivo. A partir de l' injection de l' artère 24 h post-carotidienne, le développement du cerveau de métastases a été contrôlée de manière non invasive répétée dans l' imagerie du système d'imagerie in vivo (barre d' échelle = 50 mm). B) Quantification in vivo système d'imagerie imaging données indiquent une baisse initiale de l'injection de l'artère carotide post-charge tumorale, suivie par l'excroissance exponentielle des métastases cérébrales jusqu'à moribonds animale. Les barres d'erreur reflètent l'erreur standard de la moyenne (SEM) du signal de luminescence totale. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: La récolte des métastases cérébrales Lésions. A) Des cellules de mélanome K1735 produisent des lésions de métastases cérébrales mélaniques dans le cerveau de souris C3H syngéniques, ce qui facilite grandement la séparation des lésions cérébrales métastatique du stroma environnant , mais est limitée à certains modèles de mélanome. B) Dissocié cellules tumorales mammaires de la MMTV- Neu / PTEN souris -null transgénique produit cerveau manifeste métastase after l' implantation par injection de l' artère carotide. La marge de la tumeur / stroma est difficile de distinguer malgré la présence évidente de lésions métastatiques angiogéniques. C) MDA-MB-231 cellules de cancer du sein ont été pré-marquées avec une protéine fluorescente (GFP) reporteur verte ex vivo pour faciliter l' extraction des lésions de métastases cérébrales par l' intermédiaire d'une résection chirurgicale ou tri cellulaire. A noter que la majorité des lésions métastatiques sont concentrées sur le même côté du cerveau où a lieu l'injection artérielle carotidienne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les étapes les plus critiques pour l'injection artérielle carotidienne réussie de cellules cancéreuses sont: 1) une anesthésie profonde de la souris en vue d'une opération chirurgicale; 2) mise en place régulière de l'artère carotide au-dessus du support de coton; 3) la ligature serrée de l'artère carotide après l'injection réussie.
anesthésie profonde de ~ 30 min est généralement nécessaire pour une performance chirurgicale régulière sous le microscope de dissection. Nous utilisons cocktail kétamine / xylazine commercialement prête à l'emploi pour l'anesthésie de la souris. Afin d'éviter un surdosage potentiel, le cocktail de kétamine / xylazine peut être dilué 1: 1 ou 1: 2 dans du sérum physiologique pour donner plus de souplesse dans l'ajustement du volume utilisé pour l'anesthésie. En variante, non contrôlée tribromoéthanol de médicament peut également être utilisé comme anesthésique; Cependant, nous avons constaté que la propension des tribromoéthanol à dégrader la substance rend moins fiable comme anesthésique efficace que le cocktail de kétamine / xylazine.
UNEprogressivement placé sous pression et complètement l'artère carotide facilite grandement l'injection des cellules cancéreuses; Par conséquent, nous vous recommandons vivement de passer du temps à préparer soigneusement la position de l'artère sous le microscope plutôt que de procéder à l'injection dans des conditions non optimales.
Plus les cellules cancéreuses se loger dans le système vasculaire du côté de l'injection artérielle carotidienne. Parfois, une partie importante des cellules métastatiques peut se déplacer vers l'autre côté du cerveau, de sorte que les deux hémisphères semblent supporter quantité significative de lésions métastatiques chez les animaux moribonds.
lésions métastatiques peuvent apparaître soit dans le parenchyme ou les leptoméninge du SNC, ou dans les deux endroits. Il semble y avoir des interactions tumeur microenvironnement uniques qui sous - tendent ces phénotypes biologiques 15. Par conséquent, quand une nouvelle lignée cellulaire doit être testé pour sa capacité à produire expérimentale des métastases cérébrales, il est nécesvier accorder une attention particulière à ces phénotypes.
Les artères carotides internes et externes fournissent le sang dans le parenchyme cérébral et les méninges, respectivement. En conséquence, le dépôt des cellules tumorales dans le parenchyme ou leptoméninge peut être réalisé par une légère modification de ce protocole. Pour permettre aux cellules uniquement dans leptoméninges, l'artère carotide interne peut être ligaturé par une suture avant l'injection des cellules tumorales, en dirigeant ainsi des cellules dans l'artère carotide externe; d'autre part, la ligature de la carotide externe avant l'injection des cellules permet seulement l'entrée dans l'artère carotide interne et le parenchyme cérébral.
Dans l'ensemble, l'approche d'injection intracarotidienne produit des données de reproductibilité plus élevée et une plus faible variabilité par rapport à la queue veine ou intracardiaque injections; elle permet également d'éviter l'inflammation induite par le SNC par injection par rapport au procédé d'injection intracérébrale directe. Par conséquent, cette approche est actuellement le plusprécieux dans les études quantitatives de métastases cérébrales qui visent à générer des conclusions statistiques significatives en utilisant un nombre limité d'animaux. Dans le même temps, tous les modèles expérimentaux ont des limites. Semblable à d'autres méthodes d'initiation hématogène des cellules tumorales, l'injection intracarotidienne ne récapitule les étapes ultérieures dans la cascade de métastases après la diffusion des cellules cancéreuses dans la circulation. Ainsi, il est un modèle approprié pour étudier, par exemple, des facteurs biologiques qui déterminent la dissémination des cellules cancéreuses primaires dans le sang.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution | Sigma-Aldrich | K113 | |
| Routine Stereomicroscope Leica M50 | Leica | M50 | The microscope is modular and highly configurable to fit particular space requirements. |
| Surgical disposable scapel | Integra Miltex | 4-410 | to make skin incisions |
| Tissue Forceps - 1 x 2 Teeth | Fine Science Tools | 11021-12 | to bluntly dissect mucles |
| Dumont #5 - Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | to separate and prepare the carotid artery for injection |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | to cut sutures |
| EZ Clip Kit | Stoelting | 59020 | for wound cloure |
| BD Insulin Syringe | Becton Dickinson | 328438 | for cell injection |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 |
References
- Gavrilovic, I. T., Posner, J. B. Brain metastases: epidemiology and pathophysiology. J Neurooncol. 75 (1), 5-14 (2005).
- Patchell, R. A. The management of brain metastases. Cancer Treat Rev. 29 (6), 533-540 (2003).
- Barnholtz-Sloan, J. S., et al. Incidence proportions of brain metastases in patients diagnosed (1973 to 2001) in the Metropolitan Detroit Cancer Surveillance System. J Clin Oncol. 22 (14), 2865-2872 (2004).
- Schouten, L. J., Rutten, J., Huveneers, H. A., Twijnstra, A. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94 (10), 2698-2705 (2002).
- Bendell, J. C., et al. Central nervous system metastases in women who receive trastuzumab-based therapy for metastatic breast carcinoma. Cancer. 97 (12), 2972-2977 (2003).
- Clayton, A. J., et al. Incidence of cerebral metastases in patients treated with trastuzumab for metastatic breast cancer. Br J Cancer. 91 (4), 639-643 (2004).
- Romond, E. H., et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med. 353 (16), 1673-1684 (2005).
- Mayer, M. A patient perspective on brain metastases in breast cancer. Clin Cancer Res. 13 (6), 1623-1624 (2007).
- Lin, N. U., Bellon, J. R., Winer, E. P. CNS metastases in breast cancer. J Clin Oncol. 22 (17), 3608-3617 (2004).
- Zhang, C., Yu, D. Microenvironment determinants of brain metastasis of brain metastasis. Cell Biosci. 1 (1), 8 (2011).
- Fidler, I. J., Nicolson, G. L. Organ selectivity for implantation survival and growth of B16 melanoma variant tumor lines. J Natl Cancer Inst. 57 (5), 1199-1202 (1976).
- Zhang, L., et al. Microenvironment-induced PTEN loss by exosomal microRNA primes brain metastasis outgrowth. Nature. 527 (7576), 100-104 (2015).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Cancer Res. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Zhang, C., Zhang, F., Tsan, R., Fidler, I. J. Transforming growth factor-beta2 is a molecular determinant for site-specific melanoma metastasis in the brain. Cancer Res. 69 (3), 828-835 (2009).
