Summary
Brain metastase is uitgegroeid tot een dringende onvervulde medische noodzaak als de incidentie is toegenomen, terwijl de therapeutische opties palliatieve zijn gebleven. Het creëren van experimentele diermodellen van de hersenen metastase via intracarotid arteriële injectie van kankercellen vergemakkelijkt mechanistische studies van de ziekte biologie en de evaluatie van nieuwe interventies regimes.
Abstract
Metastase, de verspreiding en groei van kwaadaardige cellen op secundaire plaatsen binnen het lichaam van een patiënt, goed voor> 90% van kanker-gerelateerde sterfte. Onlangs zijn indrukwekkende vooruitgang in nieuwe therapieën dramatisch verlengde overleving en een betere kwaliteit van leven voor veel kankerpatiënten. Helaas, de incidentie van de hersenen metastatische recidieven stijgt snel, en alle huidige therapieën zijn slechts palliatieve. Daarom zijn goede experimentele diermodellen dringend nodig om diepgaande studies van de ziekte biologie te vergemakkelijken en om nieuwe therapeutische regimes te beoordelen voor preklinische evaluatie. Echter, de standaard in vivo metastase assay via staartader injectie van kankercellen produceert voornamelijk longen uitgezaaide laesies; dieren meestal bezwijken voor de longtumor last voordat zinvolle uitgroei van de hersenen metastase. Intracardiale injectie van tumorcellen produceert metastatische laesies op meerdere organen sites, waaronder de hersenen; Echter, de variabiliteit vanteit van tumorgroei geproduceerd met dit model is groot, demping haar nut bij het evalueren van de therapeutische werkzaamheid. Betrouwbare en consistente diermodellen voor hersenmetastasen studie genereren Hier beschrijven we een werkwijze voor het produceren van experimentele hersenmetastasen in het huis muis (Mus musculus) via intracarotid injectie van tumorcellen. Deze aanpak maakt het mogelijk om een groot aantal van de hersenen metastase-dragende muizen met een vergelijkbare groei en sterfte kenmerken te produceren, dus moet het onderzoek de inspanningen om fundamentele biologische mechanismen te bestuderen en om nieuwe therapeutische middelen te beoordelen vergemakkelijken.
Introduction
Metastase van kanker aan het centrale zenuwstelsel (CNS) is een verwoestende ziekte, en kan ofwel de hersenparenchym of leptomeningen ( "hersenmetastasen" verwijst naar zowel in dit artikel) omvatten. Het overheerst intracraniale maligniteit outnumbering primaire gliomen met> 10: 1 1, 2. Longkanker, borstkanker, melanoom en zijn de drie belangrijkste neoplastische ziekten die hoge incidentie van hersenmetastasen 3, 4 produceren. De laatste jaren hebben indrukwekkende vooruitgang in nieuwe kankertherapie dramatisch verlengde overleving en een betere kwaliteit van leven voor veel kankerpatiënten. Echter, bij herhaling, de incidentie van hersenmetastasen neemt snel toe. Zo is het anti-HER2 antilichaam Trastuzumab (Herceptin) significante klinische werkzaamheid bij patiënten met HER2 + borstkanker aangetoond; nog een verontrustende trend is ontstaanbij deze patiënten: tot 1/3 van die waarvan extracraniale systemische ziekte aanvankelijk geprofiteerd van trastuzumab behandeling later ontwikkelen hersenmetastasen 5, 6, 7. Helaas, patiënten met hersenmetastasen refractair zijn voor bijna alle huidige behandelingen meestal ervaren een traumatische verslechtering van de levenskwaliteit en de overleving na een jaar na de diagnose is slechts 20% ~ 8. De huidige therapieën voor de hersenen metastase (waaronder steroïden, craniale radiotherapie en chirurgische resectie bij geselecteerde patiënten) zijn slechts palliatieve, niet curatief 9. Daarom wordt hersenmetastasen opkomst als de volgende imposante uitdaging in dit tijdperk van nieuwe kankertherapieën. Om de onvervulde uitdaging patiënten elke dag geconfronteerd worden in de kliniek aan te pakken, dringend moeten we beter inzicht in de onderliggende mechanisme van de hersenen metastase en het gebruik van deze kennis om nieuwe therapieën te ontwikkelen.
Hier beschrijven we de procedures experimentele hersenmetastasen produceren via de injectie van kankercellen in de halsslagader. We hebben deze methode gebruikt om de bijdragen van individuele genen 'ontleden om de metastatische cascade van de hersenen uitzaaiingen en de werkzaamheid van therapeutische interventie te evaluerens 12, 13. De belangrijkste voordelen van deze benadering zijn de hoge mate van reproduceerbaarheid en geringe variabiliteit; het grootste nadeel de verfijning en vaardigheid vereist om de microchirurgie voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek statement: Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Bereid kankercellen voor injectie
- Zaad de kankercellen een of twee dagen vóór de injectie. Gebruik DMEM / F12 medium aangevuld met 10% FBS, tenzij een bijzondere medium in de literatuur is vermeld voor een bepaalde cellijn.
- Op de dag van de operatie, oogst cellen wanneer ze bij 70-80% confluentie door eerst wassen met serumvrij medium keer eerder trypsine (0,25%) gedurende 1-2 min bij 37 ° C. Naar in cellen 10% FBS-DMEM / F12 media om de 0,25% trypsine doven.
- Centrifugeer de cellen bij 80 x g gedurende 3 minuten. Was de cellen in serumvrij medium tweemaal om residueel serum te verwijderen, tel de cellen met een hemocytometer en resuspendeer in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) en 1-5 x 10 6 cellen / ml, afhankelijk van de cellijn. Keep on iceop het moment van injectie.
OPMERKING: MDA-MB-231-borstkankercellen en K1735 melanoomcellen werden in dit onderzoek, en beide cellijnen werden gebruikt 2 x 10 6 cellen / ml concentratie. Houd de duur trypsine zo kort mogelijk overbehandeling kan de resultaten van metastase assays beïnvloeden.
2. Bereid muizen voor de injectie van tumorcellen
- Verdoven muizen door intraperitoneale (ip) injectie van ketamine / xylazine cocktail (ketamine 100 mg / kg xylazine 10 mg / kg).
- Bevestig volledige verdoving door knijpen het dier voeten en observeer gebrek aan reactie.
- Plaats de muis op een glasplaat (gebruikt voor het gieten van eiwit gels), en zet vast met elastiekjes.
- Verwijder indien nodig het haar van de nek door het scheren of het aanbrengen van een kleine hoeveelheid van de ontharing product en veegde het haar af met een papieren handdoek. NB: Bij gebruik van naakt muizen, deze stap overslaan omdat ze geen lichaamshaar hebben.
- Reinig de nek huid door het aanbrengenpovidonjood en 70% alcohol.
- Plaats de muis op het podium van de stereomicroscoop
- Een insnijding in de huid ~ 1 cm lang met een chirurgische scalpel.
- Botweg ontleden de spier met getande tang om de halsslagader eronder bloot te leggen.
- Scheid de halsslagader van de aangrenzende nervus vagus met chirurgische pincet.
- Met behulp van chirurgische tang, scheiden sommige katoen uit een watje, bevochtigen, en mode in een kleinere watje. Plaats deze buffer gehydrateerd watten onder de halsslagader van de beoogde plaats van injectie.
- Plaats een hechtdraad distale en proximale de katoenen bal en maak losse knopen. Draai het proximale knoop om de bloedstroom in de injectieplaats blokkeren.
- Ga verder met kankercel injectie als de halsslagader op de watten wordt volledig onder druk gebracht met verse rode bloed.
3. Cancer Cell Injectie in halsslagader
- Vortex en stelt 100 ul of kankercellen in de spuit.
- Onder de microscoop ontleden, en steek langzaam de 31 G naald (met schuine omhoog) in het lumen van de halsslagader zitten op de top van de watten.
- Injecteer langzaam de cellen van de spuit in de halsslagader. Succesvolle injectie kan onder de microscoop worden waargenomen door de kleurverandering van de nabijgelegen bloedvaten en spieren bij gebufferde kankercellen worden geduwd in de circulatie.
- Bij injectie van het volledige volume voltooid is, tilt het distale halsslagader zachtjes regurgitatie voorkomen.
- Snel zet de distale knoop op de injectie te voltooien.
- Na het voltooien van de injectie, draai de ligaturen en trim het overtollige zijden hechtdraad met micro-schaar onder de microscoop ontleden. Achteruit de afgescheiden spier om de wond te dekken. Sluit de huid met twee nietjes.
4. Chirurgische Recovery
- Beweeg de geopereerde dieren op een verwarmingselementvoor herstel. 60 min voor de dieren om het bewustzijn te herwinnen - Het kan 30 nemen. Ondertussen dienen buprenorfine (0,05 mg / kg) subcutaan als postoperatieve analgesie. Opmerking: analgesie moeten worden verstrekt op basis van uw lokale IACUC goedgekeurd protocol.
- Zodra de dieren ontwaken en hervatten hun normale gedrag, de terugkeer van de muizen om hun woning locatie. Zorg voor muizen met gel voedsel voor enkele dagen na de operatie. Handhaven van een chirurgische plaat en bewaar het in de kamer.
5. Niet-invasieve in vivo beeldvorming
- Voor cellen gemerkt met luciferase reporter constructen meten kankercel injectierendement gebruik in vivo beeldvormingssysteem 14.
OPMERKING: Imaging wordt niet uitgevoerd op de dag van de injectie sterk belast om proefdieren te vermijden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er zijn twee punten waar de kwaliteit van de injectie kan worden geëvalueerd. De eerste kans is door waarneming van het veranderen bloedvat kleuren tijdens de injectie van de operator. Lekkage van slechte injecties kunnen gemakkelijk worden waargenomen onder de stereomicroscoop. De stabiele en zekere plaatsing van de muis (Afbeelding 1A) en de halsslagader (Figuur 1B) zo op het watje kritieke factoren voor een soepele en succesvolle injectie in de halsslagader. Het tweede punt op de injectie kwaliteit te beoordelen is post-operatieve niet-invasieve beeldvorming. Daartoe worden de kankercellen gewoonlijk gemerkt met een luciferase reporter ex vivo voorafgaand aan injectie. Om stress bij de dieren, in vivo beeldvorming wordt gewoonlijk uitgevoerd 24 uur na injectie te minimaliseren. Een succesvolle injectie resulteert in een sterke intracraniële kankercel belasting, en de muis hoofd is de enige regio met een positieve signals (Figuur 2A).
Met behulp van in vivo imaging systeem om de luciferase-gemerkte kankercellen te volgen, zien we een aanvankelijke daling van de intensiteit van het signaal binnen enkele dagen na de injectie; Nog kankercellen kunnen uitgroei in het CZS dus weten te verdelen en te produceren toenemende in vivo beeldvormingssysteem signalen hersenen metastasen (Figuur 2B). Intracarotid injectie produceert meestal consistent in vivo beeldvormingssysteem signalen met een relatief lage variabiliteit, hetgeen een belangrijk voordeel van deze aanpak experimentele hersenmetastasen produceren. Als groeiende tumor laesies verdringen hersenweefsel, kan de kwaliteit van de gezondheidszorg voor dieren met een snelle vordert hersenen metastase snel verslechteren, mirroring de klinische manifestatie van menselijke hersenen metastase patiënten. Typische symptomatische gedrag dat wijst op de belangrijke aanwezigheid van de hersenen metastase zijn verlies vangewicht, gebogen houding, en onophoudelijke omcirkelen. Aan de experimentele eindpunt, kan het dier hersenen worden gewonnen voor het onderzoek van biochemische parameters of voor histologisch onderzoek. Behalve Melanotisch metastase lesies (figuur 3A), is het gewoonlijk moeilijk om de tumorlaesie onderscheiden van omringende hersenweefsel voorafgaand aan histologisch onderzoek (Figuur 3B). In dat geval is het raadzaam om tumorcellen te labelen met een fluorescente reporter (bijvoorbeeld GFP) voor het gemak van het isoleren van metastatische cellen (Figuur 3C). Als alternatief kan de gehele hersenen worden gedissocieerd tot afzonderlijke cellen en tumorcellen gescheiden door magnetische bead-geconjugeerde antilichamen.
Figuur 1: Voorbereiding voor halsslagader injectie. A) De verdoofde muis wordt geplaatst op een glasplaatje bevestigd met rubber bands. De plaats en de lengte van de incisie is gemerkt met een zwarte lijn op de hals. B) alle voorbereidende chirurgische stappen zijn voltooid, wordt het blootgesteld halsslagader geplaatst voor ondersteuning op een stevige watje, gereed voor injectie kankercel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Non-invasieve monitoring voor de hersenen metastase uitgroei. A) Gemodificeerd MDA-MB-231-borstkankercellen werden gemerkt met luciferase reportergen ex vivo. Vanaf 24 uur na halsslagader injectie werd hersenmetastasen ontwikkeling gevolgd non-invasief door herhaalde in vivo imaging systeem beeldvorming (schaalbalk = 50 mm). B) Kwantificatie van in vivo imaging systeem IMAGing data wijst op een aanvankelijke daling van de tumor last post-halsslagader injectie, gevolgd door een exponentiële uitgroei van de hersenen metastase tot dier moribundity. Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM) van de totale luminescentie signaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het oogsten Brain metastase laesies. A) K1735 melanoom cellen melanotisch hersenmetastasen laesies in syngene C3H muizenhersenen, die sterk de scheiding van hersenen metastasen uit de omliggende stroma, maar beperkt is tot bepaalde melanoom modellen. B) Gedissocieerde borsttumor cellen van de transgene MMTV- Neu / Pten -null muis produceert openlijke hersenen metastase after implantatie via halsslagader injectie. De tumor / stroma marge moeilijk te onderscheiden ondanks de duidelijke aanwezigheid van angiogene metastatische laesies. C) MDA-MB-231-borstkankercellen werden vooraf gelabeld met een groen fluorescerend eiwit (GFP) reporter ex vivo extractie van hersenmetastasen laesies via chirurgische resectie of celsortering vergemakkelijken. Merk op dat de meeste metastatische laesies zijn geconcentreerd aan dezelfde kant van de hersenen waar carotis arteriële injectie plaatsvindt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritische stappen voor succesvolle halsslagader injectie van kankercellen: 1) diepe verdoving van muizen ter voorbereiding van chirurgische ingreep; 2) stabiele plaatsing van halsslagader bovenop de katoensteun; 3) strak ligatie van de halsslagader na een succesvolle injectie.
Deep anesthesie van ~ 30 min is meestal nodig voor stabiele chirurgische prestaties onder de microscoop ontleden. We maken gebruik van commercieel kant-en-klare ketamine / xylazine cocktail voor muis verdoving. Om mogelijke overdosering te vermijden, kan de ketamine / xylazine cocktail worden verdund 1: 1 of 1: 2 in fysiologische zoutoplossing om meer flexibiliteit bij het aanpassen van het volume voor anesthesie. Alternatief kan ongecontroleerde geneesmiddel tribroomethanol ook als verdovingsmiddel; echter, hebben we gevonden dat de neiging van tribroomethanol afbreekbare maakt deze minder betrouwbaar als een effectieve verdoving dan ketamine / xylazine cocktail.
EENgestaag geplaatst en volledig druk halsslagader aanzienlijk vergemakkelijkt de injectie van kankercellen; Daarom raden we tijd doorbrengen om de positie van de slagader onder de microscoop zorgvuldig voor te bereiden in plaats van verder te gaan met injectie onder suboptimale omstandigheden.
Meer kankercellen te stellen binnen de vasculatuur aan de kant van halsslagader injectie. Soms een aanzienlijk deel van de metastatische cellen migreren naar de andere kant van de hersenen zodat beide hemisferen blijkbaar een aanzienlijke hoeveelheid metastatische laesies rekening stervende dieren.
Metastatische laesies kunnen worden vermeld in het parenchym of leptomeningen van het CZS, of op beide locaties. Er blijken unieke tumor-micromilieu interacties die deze biologische fenotypes 15 ten grondslag liggen. Daarom, wanneer een nieuwe cellijn wordt getest op zijn vermogen om experimentele hersenmetastasen produceren, is necessari om speciale aandacht te besteden aan dergelijke fenotypes.
De interne en externe halsslagaders bloedtoevoer naar de hersenen parenchym en leptomeningen respectievelijk. Bijgevolg kan tumorcel afzetting in de parenchym of leptomeningen worden bereikt door een lichte wijziging van dit protocol. Cellen slechts rekening leptomeningen toelaten, kan de binnenste halsslagader worden geligeerd met een hechtdraad voor de injectie van tumorcellen, waardoor cellen richten in de externe halsslagader; Aan de andere kant zal ligatie van de carotis externa vóór injectie cellen alleen toegang tot de binnenste halsslagader en de hersenparenchym mogelijk.
Over het geheel genomen de intracarotid injectie aanpak levert gegevens van hogere reproduceerbaarheid en lagere variabiliteit in vergelijking met de staart ader of intracardiale injecties; Het voorkomt ook-injectie geïnduceerd CNS ontsteking in vergelijking met de directe intracerebrale injectiemethode. Dus deze benadering is momenteel de meestwaardevolle kwantitatieve studies van hersenmetastasen die gericht statistisch significante conclusies te genereren met een beperkt aantal dieren. Tegelijkertijd, alle experimentele modellen beperkingen. Net als bij andere methoden van hematogene tumorcel introductie, de intracarotid injectie recapituleert pas later stappen in de metastase cascade na kanker cel verspreiding in de circulatie. Het is dus niet een geschikt model te bestuderen, bijvoorbeeld, de biologische factoren die de verspreiding van primaire kankercellen te bepalen in de bloedbaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution | Sigma-Aldrich | K113 | |
| Routine Stereomicroscope Leica M50 | Leica | M50 | The microscope is modular and highly configurable to fit particular space requirements. |
| Surgical disposable scapel | Integra Miltex | 4-410 | to make skin incisions |
| Tissue Forceps - 1 x 2 Teeth | Fine Science Tools | 11021-12 | to bluntly dissect mucles |
| Dumont #5 - Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | to separate and prepare the carotid artery for injection |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | to cut sutures |
| EZ Clip Kit | Stoelting | 59020 | for wound cloure |
| BD Insulin Syringe | Becton Dickinson | 328438 | for cell injection |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 |
References
- Gavrilovic, I. T., Posner, J. B. Brain metastases: epidemiology and pathophysiology. J Neurooncol. 75 (1), 5-14 (2005).
- Patchell, R. A. The management of brain metastases. Cancer Treat Rev. 29 (6), 533-540 (2003).
- Barnholtz-Sloan, J. S., et al. Incidence proportions of brain metastases in patients diagnosed (1973 to 2001) in the Metropolitan Detroit Cancer Surveillance System. J Clin Oncol. 22 (14), 2865-2872 (2004).
- Schouten, L. J., Rutten, J., Huveneers, H. A., Twijnstra, A. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer. 94 (10), 2698-2705 (2002).
- Bendell, J. C., et al. Central nervous system metastases in women who receive trastuzumab-based therapy for metastatic breast carcinoma. Cancer. 97 (12), 2972-2977 (2003).
- Clayton, A. J., et al. Incidence of cerebral metastases in patients treated with trastuzumab for metastatic breast cancer. Br J Cancer. 91 (4), 639-643 (2004).
- Romond, E. H., et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med. 353 (16), 1673-1684 (2005).
- Mayer, M. A patient perspective on brain metastases in breast cancer. Clin Cancer Res. 13 (6), 1623-1624 (2007).
- Lin, N. U., Bellon, J. R., Winer, E. P. CNS metastases in breast cancer. J Clin Oncol. 22 (17), 3608-3617 (2004).
- Zhang, C., Yu, D. Microenvironment determinants of brain metastasis of brain metastasis. Cell Biosci. 1 (1), 8 (2011).
- Fidler, I. J., Nicolson, G. L. Organ selectivity for implantation survival and growth of B16 melanoma variant tumor lines. J Natl Cancer Inst. 57 (5), 1199-1202 (1976).
- Zhang, L., et al. Microenvironment-induced PTEN loss by exosomal microRNA primes brain metastasis outgrowth. Nature. 527 (7576), 100-104 (2015).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Cancer Res. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Zhang, C., Zhang, F., Tsan, R., Fidler, I. J. Transforming growth factor-beta2 is a molecular determinant for site-specific melanoma metastasis in the brain. Cancer Res. 69 (3), 828-835 (2009).
