Summary
Hirnmetastasen hat ein dringender medizinischer Bedarf werden wie ihre Häufigkeit zugenommen hat, während therapeutische Optionen palliative geblieben sind. Erstellen von experimentellen Tiermodellen von Hirnmetastasen über intracarotid arterielle Injektion von Krebszellen erleichtert mechanistische Untersuchungen der Krankheitsbiologie und Evaluierung neuartiger Interventions Regimen.
Abstract
Metastasierung, die Ausbreitung und das Wachstum von bösartigen Zellen an sekundären Standorten innerhalb des Körpers eines Patienten, Konten für> 90% der durch Krebs verursachten Todesfälle. Vor kurzem haben beeindruckende Fortschritte in der neuartigen Therapien dramatisch das Überleben und die Verbesserung der Lebensqualität verlängert für viele Krebspatienten. Leider ist schnell metastasierendem Rezidive Inzidenz von Gehirn steigt, und alle aktuellen Therapien sind nur palliative. Daher sind gute experimentelle Tiermodelle dringend notwendig in eingehende Studien der Biologie von Krankheiten zu erleichtern und neuartige Therapieschemata für die präklinische Evaluierung zu beurteilen. Jedoch erzeugt die Standard - in - vivo - Metastase Assay über Schwanzveneninjektion von Krebszellen überwiegend Lunge Metastasen; Tiere in die Lunge Tumorbelastung vor eine sinnvolle Auswuchs von Hirnmetastasen erliegen gewöhnlich. Intrakardial von Tumorzellen produziert metastatischen Läsionen zu multiplen Organ Websites einschließlich des Gehirns; jedoch die variabikeit des Tumorwachstums mit diesem Modell hergestellt ist groß, bei der Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit seiner Nützlichkeit dämpfend. So generieren zuverlässige und konsistente Tiermodelle für Hirnmetastasen Studie beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von experimentellen Hirnmetastasen in der Hausmaus (Mus musculus) über intracarotid Injektion von Tumorzellen. Dieser Ansatz ermöglicht eine große Anzahl von Hirnmetastasen tragenden Mäuse mit ähnlichen Wachstum und Mortalität Eigenschaften zu erzeugen, so dass die Forschungsanstrengungen zu erleichtern grundlegende biologische Mechanismen zu untersuchen und neuartige therapeutische Mittel zu beurteilen.
Introduction
Die Metastasierung von Krebs auf das zentrale Nervensystem (ZNS) ist eine verheerende Krankheit, und kann entweder das Hirnparenchym oder die Leptomeningen ( "Hirnmetastasen" bezieht sich sowohl auf die in diesem Artikel) einzubeziehen. Es ist die vorherrschende intracranial Malignität, outnumbering primären Gliomen von> 10: 1 1, 2. Lungenkrebs, Brustkrebs und Melanomen sind die drei wichtigsten Tumorerkrankungen, die eine hohe Inzidenz von Hirnmetastasen produzieren 3, 4. In den letzten Jahren haben beeindruckende Fortschritte in der neuen Krebstherapien, dramatisch verlängert das Überleben und die Verbesserung der Lebensqualität für viele Krebspatienten. Doch bei Wiederholung wird das Auftreten von Hirnmetastasen steigt rapide an. Beispielsweise wurde die Anti-HER2-Antikörper Trastuzumab (Herceptin) signifikante klinische Wirksamkeit bei Patienten mit HER2 + Brustkrebs nachgewiesen; noch eine beunruhigende Tendenz hat sich herausbei diesen Patienten: bis zu 1/3 von denen , deren extracranial systemische Erkrankung zunächst von Trastuzumab Behandlung profitierten später Hirnmetastase 5, 6, 7 zu entwickeln. Leider Patienten mit Hirnmetastasen sind resistent gegen fast alle gängigen Behandlungen, in der Regel eine traumatische Verschlechterung der Lebensqualität erleben, und ihre Ein-Jahres - Überleben nach der Diagnose ist nur ~ 20% 8. Aktuelle Therapien für Hirnmetastasen (einschließlich Steroide, Schädel Strahlentherapie und chirurgische Resektion bei ausgewählten Patienten) sind nur palliativ, nicht kurativ 9. Daher zeichnet sich Hirnmetastasen als die nächste imposante Herausforderung in dieser Ära neuer Krebstherapien. Zur Bewältigung jeden Tag in der Klinik die ungedeckten Herausforderung Patienten konfrontiert, brauchen wir dringend um besser auf die zugrunde liegenden Mechanismus der Hirnmetastasen zu verstehen und dieses Wissen nutzen, um neue Therapien zu entwickeln.
Hier haben wir die Verfahren beschreiben experimentelle Hirnmetastasen über die Injektion von Krebszellen in die Arteria carotis communis erzeugen. Wir haben diesen Ansatz Beiträge zur metastatischen Kaskade von Hirnmetastasen "einzelner Gene zu sezieren und Wirksamkeit der therapeutischen Intervention zu bewertens 12, 13. Die Hauptvorteile dieses Ansatzes sind der hohe Grad an Reproduzierbarkeit und geringer Grad an Variabilität; Der größte Nachteil ist die Raffinesse und Geschicklichkeit erforderlich, um die Mikrochirurgie durchzuführen.
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Protocol
Ethik Aussage: Alle Tierstudien von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der University of Texas MD Anderson Cancer Center genehmigt.
1. Bereiten Sie Krebszellen für die Injektion
- Samen, die Krebszellen ein oder zwei Tage vor der Injektion. Verwenden Sie DMEM / F12-Medium mit 10% FBS ergänzt, es sei denn, eine Spezialität Medium in der Literatur für eine bestimmte Zelllinie angedeutet ist.
- Am Tag des chirurgischen Eingriffs, Ernte Zellen, wenn sie erreicht 70 bis 80% Konfluenz, indem zuerst Waschen mit serumfreiem Medium einmal vor Trypsinisierung (0,25%) für 1 bis 2 min bei 37 ° C. Hinzufügen, in Zellen 10% FBS enthaltendes DMEM / F12-Medium, das 0,25% Trypsin zu quenchen.
- Zentrifugieren der Zellen bei 80 × g für 3 min. 5 × 10 6 Zellen / ml, abhängig von der Zelllinie - in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) bei 1 waschen Zellen in serumfreien Medien zweimal restliche Serum zu entfernen, die Zellen mit einem Hämozytometer zählen und zu resuspendieren. Halten Sie sich auf Eisbis zum Zeitpunkt der Injektion.
HINWEIS: MDA-MB-231 Brustkrebszellen und K1735 Melanomzellen wurden in dieser Studie, und beide Zellinien wurden bei 2 × 10 6 Zellen / ml Konzentration verwendet. Halten Sie die Trypsinierung Dauer so kurz wie möglich als Übertherapie können die Ergebnisse der Metastasierung Assays beeinflussen.
2. Bereiten Sie Mäuse für Tumorzellinjektion
- Anästhesieren Mäuse durch intraperitoneale (ip) Injektion von Ketamin / Xylazin-Cocktail (Ketamin 100 mg / kg, Xylazin 10 mg / kg).
- Bestätigen Sie eine komplette Anästhesie durch Kneifen der Tierfüße und beobachten fehlende Reaktion.
- Platzieren Sie die Maus auf einer Glasplatte (verwendet für das Gießen von Protein-Gele), und befestigen Sie sie mit Gummibändern.
- Falls erforderlich, entfernen Sie die Haare des Halses durch Rasieren oder eine kleine Menge Haarentfernung Produkt Auftragen und Abwischen der Haare mit einem Papiertuch ab. HINWEIS: Wenn Nacktmäuse mit, diesen Schritt überspringen, da sie keine Körperhaare haben.
- Reinigen Sie die Haut am Hals durch die AnwendungPVP-Jod und 70% Alkohol.
- Platzieren Sie die Maus auf der Bühne des Binokular
- Einen Einschnitt in die Haut ~ 1 cm lang mit einem chirurgischen Skalpell.
- Unverblümt sezieren den Muskel mit Zahnzange unterhalb der Arteria carotis zu belichten.
- Trennen Sie die Arteria carotis vom benachbarten Vagusnerv mit chirurgischen Pinzette.
- Mit chirurgische Pinzette, trennen einige Baumwolle aus einem Wattebausch, befeuchten und Mode in eine kleinere Wattebausch. Dieses Puffer-befeuchtete Wattebausch unter der A. carotis der beabsichtigten Stelle der Injektion.
- Legen Sie eine Naht distalen und proximalen zu dem Wattebausch und lose Knoten machen. Ziehen Sie den proximalen Knoten den Blutfluss in der Injektionsstelle zu blockieren.
- Gehen Sie zur Krebszellinjektion, wenn die Arteria carotis auf dem Wattebausch mit frischen roten Blut voll unter Druck erscheint.
3. Cancer Cell Injektion in Arteria carotis
- Vortex und ziehen 100 ul of Krebszellen in die Spritze.
- Unter dem Binokular, legen Sie langsam die 31 G-Nadel (mit Fase nach oben) in das Lumen der Arterie Carotis auf der Oberseite der Baumwollkugel sitzt.
- injizieren langsam die Zellen aus der Spritze in die Carotis-Arterie. Erfolgreiche Injektion kann durch die wechselnden Farben der umliegenden Blutgefäße und Muskulatur, wenn gepufferte Krebszellen in die Blutbahn geschoben werden unter dem Mikroskop beobachtet werden.
- Wenn die Einspritzung des gesamten Volumens abgeschlossen ist, heben Sie vorsichtig die distale Arteria carotis Aufstoßen zu verhindern.
- Schnell den distalen Knoten ziehen Sie die Injektionsvorgang abzuschließen.
- Nach der Injektion abgeschlossen, ziehen Sie die Ligatur und schneiden Sie die überschüssige Seidennaht mit Mikro-Schere unter dem Binokular. Bewegen Sie den abgetrennten Muskel wieder auf die Wunde abzudecken. Schließen Sie die Haut mit zwei Heftklammern.
4. Chirurgische Erholung
- Bewegen Sie das operierte Tier auf einem Heizkissenzur Erholung. 60 min für die Tiere das Bewusstsein wieder zu erlangen - Es kann 30 nehmen. In der Zwischenzeit, Buprenorphin (0,05 mg / kg) subkutane Injektion als postoperative Analgesie verabreichen. Hinweis: Analgesie zur Verfügung gestellt werden sollten, entsprechend den lokalen IACUC Protokoll genehmigt.
- Sobald die Tiere erwachen und ihr normales Verhalten fortzusetzen, kehren die Mäuse zu ihren Wohnstandort. Geben Sie Mäuse mit Gel Lebensmittel für einige Tage nach der Operation. Achten Sie auf eine chirurgische Aufzeichnung und halten Sie sie in den Raum.
5. Nicht-invasive In - vivo - Bildgebung
- Für mit Luciferase - Reporterkonstrukte markierten Zellen, Krebszellen Injektionseffizienz unter Verwendung von in - vivo - Bildgebungssystem 14 messen.
HINWEIS: Imaging nicht am Tag der Injektion durchgeführt, eine übermäßige Belastung auf Versuchstiere zu vermeiden.
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Representative Results
Es gibt zwei Punkte, an denen die Qualität der Injektion ausgewertet werden kann. Die erste Chance wird durch die Beobachtung des Bedieners während der Injektion von Blutgefäßen Farben ändern. Leckage aus armen Injektionen können leicht unter dem Binokular beobachtet werden. Die stetige und sichere Platzierung des Mauskörpers (1A) und seine Arteria carotis (Abbildung 1B) auf der Stützwattebausch sind kritische Faktoren für glatte und erfolgreiche Injektion in die Karotisarterie. Der zweite Punkt, den Injektionsqualität zu beurteilen ist postoperativen nicht-invasive Bildgebung. Zu diesem Zweck werden die Krebszellen typischerweise mit einem Luciferase - Reporter - ex vivo vor der Injektion gekennzeichnet. Zur Minimierung der Belastung für die Tiere, in - vivo - Bildgebung in der Regel durchgeführt wird 24 Stunden nach der Injektion. Eine erfolgreiche Injektion führt zu starken Belastung intrakraniellen Krebszelle und der Maus Kopf ist die einzige Region mit positiven signals (2A).
Mit In - vivo - Bildgebungssystem die Luciferase-markierten Krebszellen zu verfolgen, beobachten wir eine erste Abnahme der Signalintensität innerhalb weniger Tage nach der Injektion; noch Krebszellen fähig Auswuchs im ZNS verwalten schließlich zu spalten und erzeugen in vivo - Bildgebungssystem Signale zunimmt , wenn Hirnmetastasen entwickeln (2B). Intracarotid Injektion üblicherweise erzeugt in vivo - Bildgebungssystem Signale mit relativ geringer Variabilität konsistent, die aus mit diesem Ansatz ein wesentlicher Vorteil ist experimentell Hirnmetastase herzustellen. Als wachsende Tumorläsionen Hirngewebe verdrängen, kann die Qualität der Gesundheit für Tiere mit schnell voran Hirnmetastase schnell verschlechtern, die klinische Manifestation der menschlichen Hirnmetastasen Patienten widerspiegelt. Typische symptomatischen Verhaltensweisen, welche die signifikante Präsenz von Hirnmetastasen gehören der Verlust vonGewicht, gekrümmte Haltung, und unaufhörliche Kreisen. Am experimentellen Endpunkt können die Tier Gehirne für die Untersuchung von biochemischen Parameter extrahiert werden oder für histologische Untersuchungen. Mit Ausnahme melanotic Metastasierung Läsionen (3A), ist es meist schwierig , die Tumorläsion zu unterscheiden von umgebenden Hirngewebe vor der histologischen Bewertung (3B). In solchen Fällen ist es ratsam , auf Tumorzellen mit einem fluoreszierenden Reporter (zB GFP) für die Bequemlichkeit des Isolierens metastatischen Zellen (3C) kennzeichnen. Alternativ kann das gesamte Gehirn durch magnetische Kügelchen-konjugierte Antikörper getrennt in einzelne Zellen und Tumorzellen getrennt werden.
Abbildung 1: Herstellung einer Injektions Arteria carotis. A) Die narkotisierten Maus wird auf eine Glasplatte gelegt und gesichert mit rubber Bands. Die Website und die Länge der Schnitt wird mit einer schwarzen Linie auf dem Hals markiert. B) Nachdem alle vorbereitenden Operationsschritte abgeschlossen sind, wird die belichtete Arteria carotis für die Unterstützung auf eine feste Wattebausch gelegt, bereit für die Krebszellinjektion. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Nicht-invasive Überwachung für Hirnmetastasen Auswuchs. A) Modifizierte MDA-MB-231 - Brustkrebszellen wurden mit Luciferase - Reportergen markierte ex vivo. Ausgehend von 24 Stunden nach der Arteria carotis Injektion wurde Hirnmetastase Entwicklung nicht-invasiv überwacht durch in - vivo - Bildgebungssystem Bildgebung (Maßstab = 50 mm) wiederholt. B) Quantifizierung der in vivo - Bildgebungssystem imaDaten Ging zeigt einen anfänglichen Rückgang der Tumorlast post-Karotis-Injektion, durch exponentielle Auswuchs von Hirnmetastasen bis Tier Siechtum gefolgt. Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) des Gesamt Lumineszenzsignal. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Ernten Hirnmetastase Läsionen. A) K1735 Melanomzellen produzieren melanotischen Hirnmetastase Läsionen im syngenen C3H Maus Gehirn, die stark die Trennung von Gehirn Metastasen aus dem umgebenden Stroma erleichtert aber beschränkt sich auf bestimmte Melanom - Modelle. B) Dissoziiert Brusttumorzellen aus dem transgenen MMTV- Neu / Pten -null Maus produziert offenkundige Hirnmetastase after Implantation mittels Injektion Arteria carotis. Der Tumor / Stroma-Marge ist schwierig, trotz der offensichtlichen Anwesenheit von angiogenen metastatischen Läsionen zu unterscheiden. C) MDA-MB-231 - Brustkrebszellen wurden mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP) reporter ex vivo-pre etikettierenden Extraktion von Hirnmetastasen Läsionen über chirurgische Resektion oder Zellsortierung ermöglichen. Beachten Sie, dass die Mehrzahl der metastatischen Läsionen auf der gleichen Seite des Gehirns konzentriert sind, wo carotis arterielle Injektion stattfindet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die kritischsten Schritte zur erfolgreichen carotis arterielle Injektion von Krebszellen sind: 1) tiefer Anästhesie von Maus in Vorbereitung für die chirurgische Operation; 2) stetig Platzierung der Arteria carotis auf der Oberseite der Baumwolle zu unterstützen; 3) dicht Ligatur der A. carotis nach erfolgreicher Injektion.
Tief Anästhesie von ~ 30 min ist in der Regel notwendig für die stationäre chirurgische Leistung unter dem Binokular. Wir verwenden kommerziell ready-to-use Ketamin / Xylazin-Cocktail für Maus Anästhesie. 1 oder 1: 2 in physiologischer Kochsalzlösung mehr Flexibilität zu schaffen, in der Lautstärke für Anästhesie Einstellung zu vermeiden, kann mögliche Überdosierung, die Ketamin / Xylazin Cocktail 1 verdünnt werden. Alternativ können nicht-kontrollierten Wirkstoff Tribromethanol auch als Anästhetikum verwendet werden; haben wir jedoch, dass die Neigung von Tribromethanol gefunden abzubauen die Substanz weniger zuverlässig als ein wirksames Anästhetikum als die Ketamin / Xylazin-Cocktail macht.
EINstetig gestellt und vollständig unter Druck Arteria carotis stark erleichtert die Injektion von Krebszellen; Daher empfehlen wir die Ausgaben Zeit sehr sorgfältig die Position der Arterie unter dem Mikroskop vorbereiten, anstatt mit Einspritzung unter suboptimalen Bedingungen fortfahren.
Mehr Krebszellen wird innerhalb des Gefäßsystems einlegen auf der Seite der Carotis-Arterien-Injektion. Manchmal ist ein wesentlicher Teil der metastatischen Zellen kann auf die andere Seite des Gehirns migrieren, so dass beide Hemisphären erscheinen erhebliche Menge an metastatischen Läsionen in moribunde Tiere zu tragen.
Metastatischen Läsionen können in erscheinen entweder Parenchym oder den Leptomeningen des ZNS, oder an beiden Orten. Es scheint einzigartig tumor-Mikroumgebung Wechselwirkungen zu sein , die diese biologischen Phänotypen 15 zu Grunde liegen. Wenn daher eine neue Zelllinie für seine Fähigkeit getestet werden soll experimentellen Gehirnmetastasen herzustellen, ist es necessary besonderes Augenmerk auf solche Phänotypen zu zahlen.
Die internen und externen Karotis-Arterien liefern Blut in das Hirnparenchym und Leptomeningen sind. Dementsprechend kann das Tumorzellablage in das Parenchym oder Leptomeningen durch leichte Modifikation dieses Protokolls erreicht werden. In den Zellen, die nur in Leptomeningen, die Arteria carotis interna erlauben kann, durch eine Naht vor der Injektion von Tumorzellen ligiert werden, wodurch die Zellen in die Arteria carotis externa lenken; auf der anderen Seite, Ligatur der A. carotis externa vor der Injektion werden die Zellen Eintrag nur in die Arteria carotis interna und das Hirnparenchym ermöglichen.
Insgesamt produziert die intracarotid Injektion Ansatz Daten höherer Reproduzierbarkeit und geringere Variabilität im Vergleich zu Schwanzvene oder intrakardialer Injektionen; es vermeidet auch spritz induzierte Entzündung CNS Vergleich zur direkten intrazerebralen Injektionsverfahren. Daher ist dieser Ansatz derzeit am meistenwertvoll in quantitative Studien der Hirnmetastasen, die signifikante statistische Schlussfolgerungen unter Verwendung einer begrenzten Anzahl von Tieren zu erzeugen wollen. Zur gleichen Zeit werden alle experimentellen Modelle haben Grenzen. Ähnlich wie bei anderen Methoden der hämatogenen Tumorzell Einführung der Injektions intracarotid rekapituliert nur spätere Schritte in der Metastasierung Kaskade nach einer Krebszelle Verbreitung in den Kreislauf. So ist es kein geeignetes Modell zu untersuchen, beispielsweise die biologischen Faktoren, die die Verbreitung von primären Krebszellen in den Blutstrom zu bestimmen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution | Sigma-Aldrich | K113 | |
| Routine Stereomicroscope Leica M50 | Leica | M50 | The microscope is modular and highly configurable to fit particular space requirements. |
| Surgical disposable scapel | Integra Miltex | 4-410 | to make skin incisions |
| Tissue Forceps - 1 x 2 Teeth | Fine Science Tools | 11021-12 | to bluntly dissect mucles |
| Dumont #5 - Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | to separate and prepare the carotid artery for injection |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | to cut sutures |
| EZ Clip Kit | Stoelting | 59020 | for wound cloure |
| BD Insulin Syringe | Becton Dickinson | 328438 | for cell injection |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 |
References
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